超低溫保存處理對(duì)水曲柳胚胎生理生化特征的影響

任 悅 魏 騁 徐添添 沈海龍 楊 玲

（林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

水曲柳（Fraxinus mandshurica）為木樨科（Oleaceae）落葉喬木，是我國東北重要的用材樹種之一。水曲柳用合子胚作為外植體誘導(dǎo)獲得愈傷組織的懸浮體系已初步建立，但愈傷組織隨著繼代次數(shù)增加，逐漸褐變并死亡［1］。目前研究中存在胚性愈傷組織可能會(huì)因長期繼代而造成體細(xì)胞變異等問題，因此篩選有效的低溫保存方法至關(guān)重要。

超低溫保存是種質(zhì)資源得以長期保存的重要技術(shù)保障，其在植物遺傳材料保存中的應(yīng)用非常廣泛。植物胚胎是植物遺傳資源延續(xù)的良好載體。經(jīng)過快凍法低溫保存的輻射松（Pinus radiate）合子胚子葉在組織培養(yǎng)中作為外植體的不定芽誘導(dǎo)效果與保存前無差別［2］。建立植物胚胎高效穩(wěn)定的超低溫保存體系可以避免在長期組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的變異現(xiàn)象，維持胚胎的增殖能力和萌發(fā)能力，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良種質(zhì)資源的長期保存［3-4］。為了全面提高胚性愈傷組織保存時(shí)間，梁雪等［5］初步建立了水曲柳胚性愈傷組織超低溫保存體系，Yu 等［6］用玻璃化法使愈傷組織細(xì)胞存活率高達(dá)61.94%，用慢凍法使愈傷組織細(xì)胞存活率高達(dá)80.82%。對(duì)水曲柳優(yōu)良胚性細(xì)胞系的保存迫在眉睫，而相關(guān)的超低溫保存技術(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。

參考前人對(duì)水曲柳胚性愈傷組織的研究結(jié)果，本研究使用3種冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚進(jìn)行超低溫處理，以得到最適宜合子胚的冷凍方式與脫水時(shí)間。通過對(duì)比水曲柳合子胚胎和體胚的超低溫保存率，進(jìn)一步以合子胚為材料測定了超低溫保存前后的水曲柳合子胚細(xì)胞內(nèi)重要抗性生理生化指標(biāo)（脫氫酶、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白、抗氧化酶）的變化，分析冷凍方式和脫水時(shí)間對(duì)合子胚的內(nèi)在生理影響，為找到水曲柳合子胚和體胚的適宜的超低溫保存方式提供了生理數(shù)據(jù)支撐，為水曲柳胚胎冷凍生理機(jī)制的探究和水曲柳資源長期穩(wěn)定的保存奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2018年8月中旬在東北林業(yè)大學(xué)（45°43′16″N，126°37′55″E）校園內(nèi)采集的水曲柳成年母樹上未成熟且未經(jīng)脫水的種子為材料。

切開未成熟種子取完整的合子胚備用。以未成熟合子胚子葉做為外植體，參照叢建民等［7］方法誘導(dǎo)獲得體胚。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胚胎脫水處理

將水曲柳未成熟合子胚分別于室溫下干燥脫水0 min（未經(jīng)脫水處理直接在液氮中冷凍）、40 min（脫水處理40 min 后置于液氮中）、80 min（脫水處理80 min后置于液氮中）、120 min（脫水處理120 min后置于液氮中）。

1.2.2 胚胎冷凍方法

參照J(rèn)ekkel 等［8］的超低溫保存方法處理水曲柳合子胚。在培養(yǎng)皿中墊一層干燥濾紙，將胚胎放置在培養(yǎng)皿中的濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放40 個(gè)胚（直徑9 mm）。分別通過快凍法、慢凍法和玻璃化法處理裝置在2 mL 冷凍管中的不同含水量的胚胎。在液氮中保存24 h［6］后取出冷凍管直接置于40 ℃水浴化凍，然后對(duì)比分析保存前后各生理指標(biāo)的變化。3種冷凍方法的步驟如下。

快凍法：在0 ℃下，將不同含水量的合子胚分別裝入冷凍管中，預(yù)冷1 h后立刻用液氮冷藏。

慢凍法：在0 ℃下，將不同含水量的合子胚分別裝入冷凍管中，預(yù)冷1 h后，再于冷藏柜中-20 ℃冷藏2 h，之后轉(zhuǎn)移到以-1 ℃/min速度降至-80 ℃的程序降溫盒中保存4 h，再立刻將其投入液氮中保存。

玻璃化法：玻璃化保護(hù)劑是高濃度的復(fù)合冰凍保護(hù)劑，簡稱PVS。本研究使用30%甘油、15%聚乙二醇、15%二甲亞砜、0.4 mol·L-1蔗糖配制成保護(hù)劑，簡稱為PVS2；按照MS 液體培養(yǎng)基（蔗糖濃度為0.15 mol·L-1）和PVS2 溶液的體積比按2∶3配成60%PVS2。先在室溫下用60%PVS2 處理不同含水量合子胚，時(shí)間為20 min，再在冰水混合物中用100% PVS2處理不同含水量合子胚0.5～3.0 h，將冷凍管裝入紗布袋中，并迅速投入液氮（-196 ℃），保存24 h以上。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測定

將經(jīng)過不同冷凍方法脫水不同時(shí)間的胚胎作為測試材料，以未經(jīng)過脫水處理的胚胎作為對(duì)照，分別進(jìn)行下列指標(biāo)的測定：脫氫酶活性的測定采用分光光度法［9］。丙二醛（MDA）含量采用MDA檢測試劑盒（TBA 熒光法）測定。脯氨酸含量利用脯氨酸快速測定法在520 nm 波長下比色，用回歸方程計(jì)算脯氨酸含量［10］。可溶性蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定［11］。超氧化物歧化酶（SOD）活性通過氮藍(lán)四唑光化還原法測定，以U·g-1表示［12］。過氧化物酶（POD）活性利用愈創(chuàng)木酚法測定，以U·g-1·min-1表示［13］。過氧化氫酶（CAT）活性采用分光光度法測定，以U·g-1·min-1表示［14］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Microsoft Excel 2007，使用SPSS軟件中的雙因素方差分析（two-way ANOVA）、鄧肯多重極差檢驗(yàn)法（Duncan，α=0.05）分別對(duì)生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Sigmaplot軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

水曲柳未成熟合子胚和體胚經(jīng)脫水處理120 min后快凍法保存24 h 后再經(jīng)40 ℃水浴化凍，相對(duì)存活率分別為62.26%和51.68%。本文進(jìn)一步以水曲柳合子胚作為材料進(jìn)行的超低溫保存對(duì)胚胎生理生化特征影響的分析結(jié)果如下。

2.1 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚脫氫酶（ADH）活性的影響

脫水時(shí)間、冷凍方式和二者的交互作用均影響水曲柳合子胚脫氫酶活性，且差異顯著（P＜0.05）。如圖1 所示，未經(jīng)脫水處理的合子胚（對(duì)照）脫氫酶活性隨脫水時(shí)間延長而降低，在脫水120 min 時(shí)達(dá)到最低值。水曲柳合子胚經(jīng)快凍法和慢凍法處理后，脫氫酶活性均隨脫水時(shí)間的延長而增強(qiáng)，在脫水處理120 min 時(shí)達(dá)到峰值。但經(jīng)玻璃化法處理的合子胚脫氫酶活性則在脫水處理80 min 時(shí)達(dá)到峰值。水曲柳合子胚經(jīng)不同脫水時(shí)間低溫保存后，脫氫酶活性按從低到高順序是玻璃化法、慢凍法、快凍法。

圖1 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚脫氫酶活性的影響不同小寫字母表示同一時(shí)間、不同冷凍法之間差異顯著（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.1 Effect of dehydration time and freezing method on ADH activity of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservationDifferent lowercase letters indicate significant differences among different freezing methods at the same time（P＜0.05）；the same as below

2.2 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚丙二醛（MDA）含量的影響

脫水時(shí)間、冷凍方式和二者的交互作用對(duì)水曲柳合子胚M(jìn)DA含量影響顯著（P＜0.05）。未經(jīng)脫水處理的合子胚（對(duì)照），MDA 含量隨脫水時(shí)間延長而升高，在脫水120 min 時(shí)達(dá)到峰值。在經(jīng)3 種冷凍方式處理后，水曲柳合子胚中MDA 含量均隨脫水時(shí)間延長，呈先下降后升高趨勢。除脫水120 min 處理外，快凍法保存的合子胚在其他3 個(gè)脫水時(shí)間處理下的MDA 質(zhì)量摩爾濃度均為最低，且在脫水80 min時(shí)最低，為26.78 μmol·g-1（見圖2）。

圖2 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of dehydration time and freezing method on MDA content of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

2.3 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚脯氨酸含量的影響

水曲柳合子胚細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量受脫水時(shí)間、冷凍方式和二者的交互作用影響，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。對(duì)照的脯氨酸含量在前3 個(gè)時(shí)間梯度表現(xiàn)為遞增，在脫水120 min 時(shí)出現(xiàn)下降。3 種冷凍方式保存的合子胚脯氨酸含量隨脫水時(shí)間的延長均呈上升趨勢，在脫水120 min 時(shí)達(dá)到峰值。對(duì)比3種冷凍方式，使用快凍法保存的合子胚在脫水120 min時(shí)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值（394.99 μg·g-1），使用玻璃化法保存的合子胚在脫水0 min時(shí)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為47.39 μg·g-1（見圖3）。

圖3 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of dehydration time and freezing method on proline content of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

2.4 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚可溶性蛋白含量的影響

超低溫保存前和保存后，水曲柳合子胚細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量受脫水時(shí)間、冷凍方式和二者的交互作用影響，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。如圖4 所示，與對(duì)照組相比，在不同脫水時(shí)間處理下，經(jīng)快凍法冷凍保存后的合子胚細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量均有所增加。經(jīng)過脫水0、40、80 min 后，用不同冷凍方式保存的合子胚可溶性蛋白含量差異顯著（P＜0.05）。脫水80 min結(jié)合慢凍法保存時(shí)合子胚的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為20.12 mg·g-1，顯著高于其他處理（P＜0.05）。脫水處理為0 min、玻璃化法保存的合子胚的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（16.21 mg·g-1）。

圖4 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effect of different dehydration time and freezing method on soluble protein content of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

2.5 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

水曲柳合子胚SOD 活性受脫水時(shí)間的影響差異顯著（P＜0.05）。對(duì)照和慢凍法處理的合子胚SOD 活性隨脫水時(shí)間延長而增強(qiáng)，在120 min 時(shí)達(dá)到峰值?？靸龇ê筒ＡЩㄌ幚淼暮献优逽OD 活性隨脫水時(shí)間延長呈先升高后降低趨勢。脫水時(shí)間為120 min、經(jīng)慢凍法保存后，水曲柳合子胚SOD 活性達(dá)到最大，為361.97 U·g-1，顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖5）。

圖5 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚SOD活性的影響Fig.5 Effect of dehydration time and freezing method on SOD activity of of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

2.6 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚過氧化物酶（POD）活性的影響

脫水時(shí)間、冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚POD 活性影響的差異顯著（P＜0.05）。但脫水時(shí)間和冷凍方式的交互作用的影響不顯著。不同冷凍方式保存下的合子胚的POD 活性均隨脫水時(shí)間的延長呈增加趨勢，在脫水處理120 min 時(shí)均達(dá)到峰值。其中脫水120 min、經(jīng)快凍法保存后，合子胚的POD活性最大，為338.33 U·g-1·min-1，顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖6）。

圖6 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚POD活性的影響Fig.6 Effect of dehydration time and freezing method on POD activity of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

2.7 脫水處理和冷凍方式對(duì)水曲柳合子胚過氧化氫酶（CAT）活性的影響

超低溫保存前后的水曲柳合子胚CAT 活性受脫水時(shí)間的影響差異顯著（P＜0.05），但CAT 活性受冷凍方式、脫水時(shí)間和冷凍方式二者的交互作用的影響差異不顯著。除玻璃化法處理外，其他3種處理下水曲柳合子胚CAT活性均隨脫水時(shí)間延長而增加。干燥脫水120 min、經(jīng)快凍法保存后，水曲柳合子胚的CAT 活性最高，為1 168.85 U·g-1·min-1。脫水80 min后，對(duì)照的合子胚的CAT 活性最高，為1 030.66 U·g-1·min-1（見圖7）。

圖7 脫水時(shí)間和冷凍方式對(duì)超低溫保存后水曲柳合子胚CAT活性的影響Fig.7 Effect of dehydration time and freezing method on CAT activity of F.mandshurica zygotic embryo after cryopreservation

3 討論

3.1 合子胚和體胚的超低溫保存效果

水曲柳合子胚和體胚經(jīng)過超低溫保存后復(fù)蘇的存活率可達(dá)62.26%和51.68%。Jekkel 等［8］將七葉樹（Aesculus chinensis）體胚脫水處理4 h 至含水量為13%時(shí)，經(jīng)快凍法保存復(fù)蘇后，其存活率可達(dá)到45.9%。任淑娟等［15］利用緩速冷凍法對(duì)含水量為57.3%的七葉樹離體胚進(jìn)行超低溫保存，復(fù)蘇后其存活率為93.0%。本研究發(fā)現(xiàn)，水曲柳體胚經(jīng)脫水處理120 min 后快凍法保存24 h 后復(fù)蘇后的存活率（51.68%）與Jekkel 等［8］研究的存活率接近（45.90%）。因此認(rèn)為，快凍法可用于水曲柳合子胚和體胚的超低溫保存，以實(shí)現(xiàn)超低溫長期保存植物資源的目的，但保存后材料的復(fù)蘇存活率待進(jìn)一步提高。

3.2 超低溫保存對(duì)脫氫酶活性的影響

脫氫酶活性高低是反應(yīng)胚胎活力的重要指標(biāo)之一，主要受超低溫保存前預(yù)處理和冷凍方式等的影響，并與胚胎的活力呈正相關(guān)。肉桂（Cinnamomum cassia）種子含水量為30%～40%時(shí)，抗凍能力較強(qiáng)；但當(dāng)含水量低于15%時(shí)，過度脫水使細(xì)胞膜損傷，超低溫保存的外植體存活率反而降低［16］。在桃葉衛(wèi)矛（Euonymus maackii）種子低溫處理中發(fā)現(xiàn)，種子含水量在8.0%時(shí)，經(jīng)快速冷凍法處理和未經(jīng)冷凍處理的種子，其脫氫酶活性接近，但超低溫處理的種子活力較高［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在超低溫保存的條件下，水曲柳合子胚脫氫酶活性與脫水時(shí)間顯著相關(guān)，且受冷凍方式的影響。隨著脫水時(shí)間的增加，未經(jīng)超低溫保存處理的合子胚的含水量越來越低，脫氫酶活性也隨之降低，這說明脫氫酶活性與含水量顯著相關(guān)，即胚胎活力受含水量影響，與Michalak 等［16］結(jié)論一致。同時(shí)，本研究中，在不同脫水時(shí)間處理下，經(jīng)過超低溫保存后的合子胚脫氫酶活性始終低于未經(jīng)超低溫處理的對(duì)照組（圖1），與Antony 等［17］結(jié)論不一致，可能是因?yàn)檠芯坎牧喜煌?/p>

3.3 超低溫保存對(duì)丙二醛含量的影響

超低溫保存過程中，氧化劑和抗氧化劑之間的平衡被低溫脅迫打破，丙二醛隨著膜脂過氧化反應(yīng)的程度而不斷積累。擬南芥（Arabidopsis thaliana）3 d 的幼苗在滲透保護(hù)和脫水過程中時(shí)，MDA 含量基本增加2 倍，細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重［18］。在桃葉衛(wèi)矛種子低溫處理中發(fā)現(xiàn)，MDA 含量主要受材料含水量和冷凍方式影響。8%和12%的含水量的材料，MDA 含量幾乎不受冷凍方式和是否冷凍影響［17］。由本研究可知，MDA 含量與脫水時(shí)間在水曲柳合子胚未經(jīng)超低溫保存時(shí)，呈正相關(guān)，與李佳琦等［18］一致。而經(jīng)超低溫處理的合子胚中，不同脫水時(shí)間、冷凍方式下MDA 含量差異較顯著，而且在脫水80 min 結(jié)合快凍法保存的條件下最低（圖2），跟Antony 等［17］結(jié)論不一致，可能是當(dāng)含水量低于某個(gè)閾值時(shí)就不再受冷凍處理影響。

3.4 超低溫保存對(duì)脯氨酸含量的影響

脯氨酸能降低凝固點(diǎn)和防止細(xì)胞脫水，外植體對(duì)超低溫的耐受性可通過脯氨酸含量反應(yīng)。對(duì)玉蟬花（Iris ensata）種子低溫處理發(fā)現(xiàn)，脯氨酸含量在含水量為3.6%，液氮速凍、自來水化凍條件下，顯著高于其他處理［19］。Burritt［20］在對(duì)紅爵士海棠（Begoniax erythrophylla）莖尖低溫保存時(shí)發(fā)現(xiàn)，超低溫保存前添加外源脯氨酸預(yù)培養(yǎng)，其存活率增加，認(rèn)為可能是脯氨酸穩(wěn)固了組織代謝過程。本研究發(fā)現(xiàn)，在脫水120 min 結(jié)合快凍法保存的條件下，水曲柳合子胚脯氨酸含量達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照（圖3）。所以，脯氨酸作為保護(hù)劑在預(yù)培養(yǎng)時(shí)的適量添加，可改良超低溫保存方法，提高外植體的存活率。

3.5 超低溫保存對(duì)可溶性蛋白含量的影響

經(jīng)超低溫保存后，水曲柳合子胚的存活率基本與可溶性蛋白含量呈正相關(guān)。通過材料脫水后再進(jìn)行超低溫保存，水曲柳合子胚可溶性蛋白含量增加，可以增加材料的存活率。經(jīng)山梨醇預(yù)培養(yǎng)后的花燭（Anthurium scherzerianum）胚性懸浮細(xì)胞，含水量和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，其可溶性蛋白含量和存活率明顯高于對(duì)照組，認(rèn)為材料的存活率主要受預(yù)培養(yǎng)的影響［21］。在關(guān)于玉蟬花種子研究中發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量主要受含水量的影響［22］。本研究中，干燥脫水80 min 后結(jié)合慢凍法保存的水曲柳合子胚中的可溶性蛋白含量達(dá)到最高（圖4），由此認(rèn)為，材料中的可溶性蛋白含量與冷凍方式密切相關(guān)。

3.6 超低溫保存對(duì)抗氧化酶活性的影響

在超低溫保存后，水曲柳合子胚抗氧化酶活性受脫水時(shí)間和冷凍方式顯著影響（圖5～7）。在超低溫保存牡丹（Paeonia suffruticosa）花粉過程中，發(fā)現(xiàn)超低溫處理后的花粉活性氧（ROS）水平顯著提高，但萌發(fā)率比對(duì)照低；添加外源過氧化氫酶和蘋果酸脫氫酶，可促進(jìn)復(fù)蘇后花粉的萌發(fā)率［23］。本研究中，水曲柳合子胚的過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性、脫氫酶活性均在干燥脫水120 min 結(jié)合快凍法保存后達(dá)到最高（圖1，6～7）。超氧化物歧化酶活性在經(jīng)慢凍法保存后達(dá)到最高（圖5）。由本研究可知，ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)影響著超低溫保存的材料的存活率，其存活率可通過脫水處理和冷凍方式以及添加外源抗氧化劑等方法提高。

綜上所述，快凍法可用于水曲柳合子胚和體胚的超低溫保存，復(fù)蘇后合子胚和體胚的存活率均超過了50%。超低溫保存方法中的脫水時(shí)間、冷凍方式以及二者的交互作用顯著影響水曲柳合子胚的存活率和生理生化指標(biāo)。在不同冷凍方式條件下，除了水曲柳合子胚的丙二醛含量隨脫水時(shí)間的增加而下降以外，其脫氫酶活性、抗氧化酶活性、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量均隨脫水時(shí)間的延長而增加。在脫水120 min 結(jié)合快凍法處理的條件下，水曲柳合子胚細(xì)胞內(nèi)脫氫酶活性最高，同時(shí)過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、脯氨酸含量均達(dá)到最大值，因此認(rèn)為其細(xì)胞抗凍性高于其他冷凍法、超低溫保存效果最好。