馬藺幼胚高效再生體系的建立

安文杰 王銀杰 劉清泉 楊永恒 張 婷 范少茹 張永俠* 原海燕

（1.山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，太原 030009；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京 210014）

馬藺（Iris lactealvar.chinensis）為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Iris）多年生草本植物，又名馬蓮、蘭花草，原產(chǎn)我國，廣泛分布于全國各地。馬藺的花、種子和根均可入藥［1］，葉子干枯后，營養(yǎng)成分高，是優(yōu)質(zhì)飼草，還可作為造紙?jiān)希?］。馬藺具有抗旱、耐鹽堿、耐踐踏、抗病等特點(diǎn)，因此水土保持能力強(qiáng)、養(yǎng)護(hù)成本低，在城市園林地被及干旱鹽堿地區(qū)生態(tài)治理中具有廣闊的應(yīng)用空間［3-6］。

作為園林地被植物，馬藺花色較為單一，花色僅有白色、淺藍(lán)色、藍(lán)色或藍(lán)紫色。因此，若能培育出花色豐富的馬藺新種質(zhì)對于提升馬藺景觀價(jià)值和推動(dòng)馬藺的推廣應(yīng)用具有重要意義。鳶尾屬植物大多種間雜交不育，很難通過常規(guī)雜交途徑獲得馬藺新種質(zhì)，而分子育種是獲得新種質(zhì)的有效途徑，但穩(wěn)定高效的再生體系是分子育種的基礎(chǔ)。目前關(guān)于馬藺高效再生體系的報(bào)道尚少，孟林等以馬藺種子為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率僅58%［7］；劉孟穎等以馬藺不定芽為外植體，一年僅繁殖5.29 個(gè)后代，繁殖率低［8］。研究發(fā)現(xiàn)，種子胚更易獲得胚性愈傷組織［9-10］，且幼胚愈傷誘導(dǎo)率比成熟胚更高，污染率和褐化率更低［11］。

綜上，本研究以馬藺幼胚為試驗(yàn)材料，從不同時(shí)期幼胚及不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織、體胚和不定芽誘導(dǎo)影響等方面探究馬藺高頻離體再生體系建立的有效技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年4～5月，取馬藺授粉后的幼胚為外植體，馬藺于1994年引自黑龍江森林植物園，花藍(lán)紫色。

1.2 外植體制備及消毒

取回的蒴果經(jīng)10%的家用洗潔精浸泡10 min后，流水沖洗0.5～1.0 h，然后置于超凈工作臺，75%乙醇消毒5 min，無菌水清洗2 次后備用。蒴果用解剖刀剖開，取出種子，將種子置于解剖臺上，解剖針挑破萌發(fā)孔后，用鑷子輕輕擠出幼胚。

1.3 不同時(shí)期的幼胚對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

取馬藺人工授粉10、15、20、25、30、35、40、45 d后的幼胚分別接種到含1.0 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和0.2 mg·L-16-芐氨基嘌呤（6-BA）的MS 培養(yǎng)基中，每瓶接種20 個(gè)外植體，在（25±2）℃的黑暗條件下培養(yǎng)。共8 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.4 愈傷組織誘導(dǎo)

取出的幼胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）和6-BA（0.1、0.2、0.5 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基，處理為：C1（0.5 mg·L-12，4-D+0.1 mg·L-16-BA）、C2（1.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C3（1.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA）、C4（1.5 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C5（1.5 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA）、C6（2.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA）、C7（2.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA），蔗糖質(zhì)量濃度為30 g·L-1，瓊脂粉為6 g·L-1，pH=5.8，共7 個(gè)處理。根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率確定最佳外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)獲得愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)量×100%。每個(gè)處理30 個(gè)外植體，3次重復(fù)。

1.5 體胚誘導(dǎo)

獲得的愈傷組織分切成直徑約5 mm 的小塊后轉(zhuǎn)移至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在（25±2）℃黑暗條件下 培 養(yǎng)。誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 基 為 添 加2，4-D（0、0.25、0.50 mg·L-1）和6-BA（0、0.05、0.10 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基，處理為：T1（不添加激素）、T2（0.25 mg·L-12，4-D+0.05 mg·L-16-BA）、T3（0.50 mg·L-12，4-D+0.10 mg·L-16-BA），蔗糖質(zhì)量濃度為30 g·L-1，瓊脂粉為6 g·L-1，pH=5.8，共3個(gè)處理。體胚誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)的體胚數(shù)量/接種的愈傷組織數(shù)量×100%。每個(gè)處理20個(gè)胚性愈傷組織塊，重復(fù)3次。

1.6 不定芽誘導(dǎo)

帶有體胚的胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中，在（25±2）℃，光照強(qiáng)度54 μmol·m-2·s-1，14 h 光照/10 h黑暗的光周期條件下培養(yǎng)。分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加噻苯?。═DZ，0.5、1.0、1.5 mg·L-1）或6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）和NAA（0.1、0.2 mg·L-1）的MS培養(yǎng)基，處理為：S1（0.50 mg·L-1TDZ+0.10 mg·L-1NAA）、S2（1.00 mg·L-1TDZ+0.20 mg·L-1NAA）、S3（1.50 mg·L-1TDZ+0.20 mg·L-1NAA）、S4（0.50 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA）、S5（1.00 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA）、S6（1.50 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA），蔗糖質(zhì)量濃度為30 g·L-1，瓊脂粉為6 g·L-1，pH=5.8，共6 個(gè)處理。觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率，愈傷組織的分化率=分化的胚性愈傷組織數(shù)量/檢測的胚性愈傷組織總數(shù)量×100%。每個(gè)處理20個(gè)胚性愈傷組織塊，重復(fù)3次。

得到的不定芽分為帶3～4 個(gè)芽的小芽叢接種到上述分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理20個(gè)不定芽叢，進(jìn)行3 次繼代，每30 d 繼代一次。觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)=增殖不定芽數(shù)量/接種不定芽數(shù)量。

1.7 生根誘導(dǎo)和馴化移栽

不定芽長至3～5 cm，接種到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基由MS 添加NAA（0、0.1、0.2、0.5 mg·L-1），和30 g·L-1蔗糖（pH=5.8）組成。觀察不定芽的生根率及生根的狀態(tài)。生根率=生根的不定芽數(shù)量/檢測的不定芽總數(shù)量×100%。每個(gè)處理30 個(gè)不定芽，重復(fù)3次。再生植株生根后從培養(yǎng)瓶中取出小植株，用自來水洗凈根部的培養(yǎng)基。將再生植株移栽至溫室中煉苗2～3 d。栽培基質(zhì)為高壓滅菌后的蛭石。4周后觀察植株生長狀況并統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期幼胚對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

馬藺人工授粉后15 d 時(shí)，種子形成，胚乳水漬狀，很難觀察到幼胚。隨著幼胚發(fā)育到30 d，能看到明顯的幼胚，幼胚透明狀略帶白色；幼胚發(fā)育到35 d 時(shí)（見圖1A），幼胚乳白色，胚乳柔軟，幼胚剝?nèi)∪菀?；?dāng)幼胚發(fā)育到45 d 時(shí)，胚乳硬化，幼胚剝?nèi)r(shí)易受損傷。因此，最佳的幼胚剝?nèi)r(shí)間為人工授粉后35～45 d。

2.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

由表1 可以看出，隨著2，4-D 質(zhì)量濃度的增大，愈傷組織的誘導(dǎo)率提高，形成愈傷組織的時(shí)間逐漸縮短。除2，4-D 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)出愈傷組織的時(shí)間較長，為20 d，其他2，4-D 質(zhì)量濃度誘導(dǎo)時(shí)間均在10 d 左右。2，4-D 質(zhì)量濃度大于1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率均高于75 %；2，4-D質(zhì)量濃度小于1.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織為淺黃色，致密顆粒型的胚性愈傷組織（見圖1B）；2，4-D質(zhì)量濃度大于1.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織淡黃色、透明、質(zhì)地松軟或黃色的大顆粒狀，為非胚性愈傷組織。因此，最適的馬藺愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對馬藺幼胚愈傷組織的影響Table 1 Effects of plant growth regulators（PGRs）on the proliferation of callus from immature embryo of I.lacteal var.chinensis

2.3 體胚的形成

誘導(dǎo)出的愈傷組織在最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代2～3 次后（見圖1C），胚性愈傷組織切分為3～5 mm左右的小塊轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。由圖1 和表2 可以看出，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到不含2，4-D或含有少量2，4-D 的培養(yǎng)基上，可以誘導(dǎo)出體胚，誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后可明顯看到有凸起的白色圓形或棒狀體胚（見圖1D）。當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，體胚的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)到71.67%。

圖1 馬藺胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和植株再生A.授粉30 d后剝出的幼胚；B.幼胚誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織（30 d）；C.胚性愈傷組織增殖；D.胚性愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚；E.體胚或胚性愈傷分化形成不定芽；F，G.不定芽的生根（14、42 d的生根苗）；H.移栽42 d后的完整植株Fig.1 Induction， proliferation of embryogenic calli of I.lacteal var. chinensis and plant regenerationA.Immature embryos peeled after 30 d of pollination；B.Embryogenic calli induced by immature embryo；C.Proliferation of embryogenic calli；D.Embryogenic calli differentiate into somatic embryos；E.Somatic embryos or embryogenic calli differentiate into adventitious buds；F，G.Rooting of adventitious buds（rooting seedlings at 14 and 42 d）；H.Complete plants after 42 d of transplanting

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對馬藺體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of plant growth regulators（PGRs）on the induction of somatic embryos of I.lacteal var.chinensis

2.4 不定芽誘導(dǎo)及增殖

不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對馬藺不定芽誘導(dǎo)及增殖效果影響較大（見表3），將帶有體胚的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，4周后分化出不定芽（見圖1E），添加TDZ質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1，不定芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)78.33%，且不定芽的長勢好；TDZ 質(zhì)量濃度高于1.0 mg·L-1，不定芽的分化率顯著降低，且部分不定芽發(fā)生玻璃化；不同質(zhì)量濃度的6-BA 對不定芽誘導(dǎo)率均低于TDZ，且部分胚性愈傷或體胚變綠但不能分化出不定芽。同樣，添加TDZ 的培養(yǎng)基上不定芽增殖系數(shù)高于添加6-BA 的培養(yǎng)基，且TDZ 質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最高，為3.65。因此，最佳的分化及增殖培養(yǎng)基均為MS+1.0mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對馬藺不定芽誘導(dǎo)率及增殖的影響Table 3 Effects of different plant growth regulators（PGRs）on adventitious buds and the proliferation of adventitious buds of I.lacteal var. chinensis

2.5 生根培養(yǎng)與馴化移栽

不定芽在添加不同質(zhì)量濃度NAA 的MS 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，2 周后有不定根形成（見圖1F），4周后的生根率均達(dá)到100 %，根的生長速度很快，到8 周左右根幾乎長滿了培養(yǎng)瓶底部（見圖1G）。不添加NAA 的MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的根細(xì)弱，數(shù)量少；添加少量NAA（＜0.2 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的根數(shù)量多、柔軟且生長健壯；添加高質(zhì)量濃度NAA（＞0.5 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的根數(shù)量過多、粗短、質(zhì)硬且易斷（見表4）。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對馬藺不定芽生根的影響Table 4 Effects of different plant growth regulators（PGRs）on rooting of I.lacteal var. chinensis

生根4 周后的馬藺植株開蓋煉苗后洗去培養(yǎng)基移栽至高壓滅菌后的蛭石基質(zhì)中，移栽后置于光照培養(yǎng)箱中，溫度20～25 ℃，4 周后成活率95%以上（見圖1H）。

3 討論

植物組織培養(yǎng)通常選擇植物細(xì)胞分裂最旺盛的幼嫩組織為外植體，如幼胚、莖尖、幼嫩花器官、嫩葉等［12-14］，鳶尾屬植物屬于基生葉，莖尖埋于土層內(nèi)，因此存在消毒困難，污染嚴(yán)重等問題［15］，幼嫩花器官作為外植體存在誘導(dǎo)率低，誘導(dǎo)周期長等缺點(diǎn)［16］。馬藺種子成熟后存在硬實(shí)率高和常溫培養(yǎng)條件下發(fā)芽率低等繁殖局限，因此本試驗(yàn)選擇幼胚作為外植體，且通過馬藺人工授粉后不同時(shí)間取幼胚，發(fā)現(xiàn)授粉后35～45 d 時(shí)，幼胚發(fā)育完成，而胚乳尚未完全硬化，此時(shí)，幼胚剝?nèi)∪菀祝僮骱唵巍?/p>

外源生長素和細(xì)胞分裂素是誘導(dǎo)細(xì)胞分化與增殖所必需的，2，4-D 是誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成的重要激素［17］，鳶尾屬植物中2，4-D配合細(xì)胞分裂素KT 或6-BA 對誘導(dǎo)胚性愈傷組織同樣具有顯著效果［18-21］。研究表明，高質(zhì)量濃度2，4-D 誘導(dǎo)脫分化后必須及時(shí)降低或去掉2，4-D，胚性細(xì)胞才能正常發(fā)育，如不及時(shí)降低2，4-D 的質(zhì)量濃度，球形胚就產(chǎn)生次生胚，當(dāng)次生胚發(fā)育到球形胚后又循環(huán)繼續(xù)形成次生胚，由此形成了分支的球形胚鏈，從而抑制了體胚的正常發(fā)育，而被“鎖”在一個(gè)特殊的發(fā)育階段［22］。本研究也得到相似的結(jié)果，通過不同質(zhì)量濃度2，4-D 和6-BA 組合誘導(dǎo)馬藺幼胚形成愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mg·L-12，4-D和0.2 mg·L-16-BA 誘導(dǎo)馬藺幼胚形成胚性愈傷的效果較好，另外，將胚性愈傷進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到較低質(zhì)量濃度的2，4-D（0.25 mg·L-1）培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)出白色顆粒狀體胚。與喜鹽鳶尾（Iris halophila）成熟胚在含有2，4-D 1.0 mg·L-1和KIN 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)后即可形成白色體胚的結(jié)果［21］不同。

TDZ 是一種人工合成的苯基脲衍生物，不僅具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，還具有生長素的效果，在組織培養(yǎng)中具有突出的作用［23］。如彭綠春等［24］研究表明6 種高山杜鵑（Rhododendronspp.）離體葉片在TDZ 誘導(dǎo)下分化率均可達(dá)到100%。王春夏等［25］發(fā)現(xiàn)TDZ 對朱頂紅（Hippeastrum vitta-tum）不定芽的增殖有明顯效果，且不同品種的效果不同，朱頂紅‘花孔雀’相對‘黑天鵝’增殖的不定芽系數(shù)高且增殖的不定芽數(shù)量多。范春節(jié)等［26］發(fā)現(xiàn)不同濃度TDZ 誘導(dǎo)9 個(gè)尾細(xì)桉（Eucalyptus urophylla×E.tereticornis）無性系葉片獲得再生植株。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ和NAA的組合效果要優(yōu)于6-BA 和NAA 的組合，濃度為1.0 mg·L-1TDZ 和0.2 mg·L-1NAA 對不定芽的誘導(dǎo)率高達(dá)78.33%，增殖系數(shù)達(dá)3.65。

鳶尾屬植物的生根相對容易，江明等［27］研究表明IBA、IAA、NAA、2，4-D 均可以誘導(dǎo)香根鳶尾（I.pallida）不定芽生根，生根率達(dá)95%以上；張芳和陳晨等［28-29］對德國鳶尾（I.germanica）不定芽生根的研究發(fā)現(xiàn)，NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，鳶尾生根率最高可達(dá)100%。本研究發(fā)現(xiàn)馬藺的不定芽生根也較容易，在不含植物激素或添加少量NAA（＜0.2 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基即可生根，生根誘導(dǎo)率達(dá)到95%以上。生根后的組培苗移栽也是組培快繁的重要步驟，前人研究報(bào)道［28，30-31］，無論是否練苗，鳶尾組培苗均能較好地生長，但移栽時(shí)應(yīng)注意控制基質(zhì)濕度，濕度過大易引起組培苗根部腐爛［29］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬藺組培苗移栽至高壓滅菌的蛭石中，成活率可達(dá)95%以上。