食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證結(jié)果與分析

◎ 蘇妙貞，楊丹婷，丁清龍，周 露

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

肉類是動物的皮下組織及肌肉，肉類食品含有豐富的蛋白質(zhì)，通常是人們飲食中的重要組成部分[1]。近年，社會接連出現(xiàn)肉類食品摻假或以次充好的問題，如2013 年歐洲的“馬肉風(fēng)波”，在多款冷凍牛肉食品中檢出馬肉成分[2]。另外，還有個別不法商人低價購入豬肉摻入價格更高的牛肉[3]或羊肉中、將低價風(fēng)干鴨肉干冒充為牦牛干等。為保障消費者的利益及食品質(zhì)量安全，動物源性成分檢測具有重要的社會意義。

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心（ACAS）是中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可的能力驗證提供者，能對參加者的結(jié)果進(jìn)行評價[4]。能力驗證是檢驗實驗室能力的重要手段之一，參加能力驗證對于持續(xù)提高實驗室檢測水平和質(zhì)量控制具有重要意義。本實驗室于2022 年5 月參加了ACAS 組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證ACAS-PT1397（2022）。選用SN/T 2051—2008[5]進(jìn)行牛、羊源性成分檢測；SN/T 3730.5—2013[6]進(jìn)行馬源性成分檢測；SN/T 3730.8—2013[7]進(jìn)行豬源性成分檢測，并用BJS 201904[8]對豬源性成分檢測結(jié)果再確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2 個樣品由ACAS 提供，為肉類產(chǎn)品，呈肉糜狀，鋁箔袋真空包裝，重約10 g，編號為22-K950、22-W704；陰性樣品為市場購買的雞肉樣品；陽性樣品為市場購買的牛肉、羊肉、豬肉、馬肉樣品；實驗用水為無菌ddH2O。

1.2 儀器與試劑

ME203 天平（美國梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1 生物安全柜（新加坡ESCO 公司）；Nano 核酸蛋白分析儀（日本島津企業(yè)管理有限公司）；CFX-96 實時熒光PCR 儀（美國伯樂公司）；Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5430 離心機（德國艾本德公司）

DNA 提 取 試 劑 盒（ 德 國QIAGEN 公 司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（ 日 本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；內(nèi)參照、豬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904，馬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.5—2013 提供的序列信息由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 實驗方法

參照組織方提供的參試指導(dǎo)書、SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013 和BJS 201904進(jìn)行實驗。

1.3.1 樣品DNA 提取

分別取樣品約200 mg，取樣盡量均勻。根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書步驟提取樣品DNA，每個樣品提取3 個平行樣。提取過程同時取200 μL 水作為提取空白對照，與樣品同時進(jìn)行DNA 提取。用核酸蛋白分析儀測定DNA 濃度、A260及A280的比值，將DNA 濃度統(tǒng)一用水稀釋至50 ng·μL-1進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 牛、羊源性成分PCR 擴增

用CFX-96 實時熒光PCR 儀，按照SN/T 2051—2008 進(jìn)行牛、羊源性成分檢測。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）混合 液1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模 板DNA 2 μL，水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，1 個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

1.3.3 豬源性成分PCR 擴增

用Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀，先按照SN/T 3730.8—2013 進(jìn)行豬源性成分檢測。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，1 個循環(huán)；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，45 個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

對需要再確認(rèn)的樣品，用Quant Studio 6 Flex 實時熒光PCR 儀按照BJS 201904 進(jìn)行豬源性成分檢測。反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中包括2×premix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，探針（10 μmol·L-1）0.1 μL，模板DNA 1 μL，水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1 個循環(huán)；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，35 個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

1.3.4 馬源性成分PCR 擴增

用CFX-96 實時熒光PCR 儀，按照SN/T 3730.5—2013 進(jìn)行馬源性成分檢測。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min，1 個循環(huán)；94 ℃變性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40 個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

1.3.5 質(zhì)量控制

每個實驗過程均設(shè)置陽性對照、陰性對照、試劑空白對照及提取空白對照。試劑空白對照即用水代替模板；提取空白對照即在樣品DNA 提取過程中，用水代替樣品與樣品同時進(jìn)行DNA 提?。粺晒釶CR 實驗的每個樣品各加2 個平行孔。結(jié)果根據(jù)SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013、BJS 201904 要求進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2 個樣品各提取3 個平行樣的A260和A280比值均在1.8 ～2.0，說明DNA 濃度較高，提取效果較好[9]。在豬源性成分PCR 擴增實驗中，按照SN/T 3730.8—2013 要求做的樣品內(nèi)參照（18S rRNA 基因）均有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct 值均＜30，證明有提取到動物源性DNA，符合實驗要求。

本次實驗設(shè)置的陽性對照、陰性對照、試劑空白對照及提取空白對照均符合要求，實驗結(jié)果有效。兩個樣品的牛、羊、豬、馬成分檢測結(jié)果根據(jù)相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定。各樣品的檢測結(jié)果詳見表1。

表1 各樣品的檢測結(jié)果表

樣品22-W704 的3 個平行樣的4 個檢測檢測項目結(jié)果基本一致，可得出相同結(jié)論。樣品22-K950 的3個平行樣品的牛、羊、馬源性成分結(jié)果也基本一致，可得出相同結(jié)論。用SN/T 3730.8—2013 檢測的豬源性成分判定結(jié)果出現(xiàn)不一致的情況：兩份樣品未檢出豬源性成分，一份樣品檢出豬源性成分但Ct 值（36.951、39.309）較大。將相同3 個平行樣用BJS 201904 進(jìn)行實驗，按BJS 201904 檢驗和判定均未檢出豬源性成分（表2），增強了22-K950 的豬源性成分檢測結(jié)果為未檢出的信心。

表2 22-K950 豬源性成分用BJS 201904 檢測結(jié)果表

最終結(jié)果為樣品22-K950 檢出羊源性成分，未檢出牛、豬、馬成分；樣品22-W704 檢出牛、羊、豬源性成分，未檢出馬源性成分（表3）。

表3 能力驗證上報結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

將最終實驗結(jié)果上報至ACAS，結(jié)果均為滿意。證明本實驗室有能力進(jìn)行動物源性成分的檢測，也是對本實驗室的充分肯定。本次能力驗證，開闊了檢測人員的思路并積累了經(jīng)驗，促進(jìn)了本實驗室能力的提升。

本實驗用了兩種方法確認(rèn)樣品22-K950 的豬源性成分檢測結(jié)果。方法比較能提高結(jié)果準(zhǔn)確性和檢測能力，為實驗室能力驗證結(jié)果填報提供了參考，提高實驗室報出結(jié)果的把握[10]。根據(jù)經(jīng)驗，在結(jié)果判定時，需結(jié)合Ct 值和擴增曲線進(jìn)行綜合判定[11]。分析本實驗樣品22-K950 用SN/T 3730.8—2013 檢測，有一份Ct 值（36.951、39.309）較大的情況，其擴增曲線并不十分典型，考慮為假陽性。結(jié)合BJS 201904 判定結(jié)果，得出該樣品未檢出豬源性成分的結(jié)論。對該樣品，雖然BJS 201904 的Ct 值大于35 判定未檢出，仍未達(dá)到SN/T 3730.8—2013 檢測的Ct 值36.951 和39.309，但用SN/T 3730.8—2013 檢測豬源性成分上報結(jié)果為未檢出的能力驗證結(jié)果評價為滿意，則說明SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904 得出的未檢出豬源性成分實驗結(jié)果均可靠。

熒光PCR 結(jié)果出現(xiàn)假陽性的可能原因有實驗耗材污染、陽性樣本和陽性對照造成的污染[12]、樣品制作過程環(huán)境交叉污染等。由于本實驗的空白對照、提取對照結(jié)果均符合要求，則認(rèn)為本實驗豬源性成分檢測所出現(xiàn)的情況很可能是樣品在制樣過程交叉污染導(dǎo)致的。

熒光PCR 技術(shù)有靈敏度高、特異性強的特點，廣泛應(yīng)用于肉制品中物質(zhì)的定性和定量分析[13]。由于該技術(shù)的極高敏感性，樣品采集、提取過程的污染及環(huán)境氣溶膠污染容易導(dǎo)致結(jié)果假陽性。為預(yù)防以上情況出現(xiàn)，實驗室應(yīng)區(qū)分試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、產(chǎn)物擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)；實驗人員應(yīng)嚴(yán)格按照檢測方法操作；使用的耗材如PCR 管應(yīng)無菌無酶等[14]。對肉類檢測，基于DNA 生物學(xué)層面的分析技術(shù)除了熒光PCR 法外，還有常規(guī)PCR、數(shù)字PCR、等溫擴增檢測技術(shù)、DNA 條形碼和下一代測序等技術(shù)[15]。