高效液相色譜法測(cè)定趕黃草中沒食子酸在不同沖泡條件下的溶出量

◎ 肖玉梅，劉 恬，吳源益，楊 艷，楊 懿

（西南醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 瀘州 646000）

趕黃草學(xué)名為扯根菜，是虎耳草科扯根菜屬植物，扯根菜的嫩芽部分也可作為蔬菜食用[1]。其主要分布于東北、華北、華南、西南等地，是苗族民間用于預(yù)防治療肝病的常用中草藥，被譽(yù)為“神仙草”[2]。民間以全草入藥，性甘、平，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，除濕利水，清熱解毒，祛瘀止痛，主治黃疸、水腫、經(jīng)閉、跌打損傷等。以其為原料的單方制劑在臨床中多用于治療慢性乙肝、急性病毒性肝炎等疾病[3-5]，在治療、保護(hù)肝損傷等方面也有較多研究報(bào)道[6-9]。2020 年6 月2 日，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布關(guān)于新食品原料的國家公告及解讀[10]，正式批準(zhǔn)趕黃草的莖和葉為新食品原料，這為進(jìn)一步開發(fā)利用趕黃草提供了契機(jī)。趕黃草中的主要活性成分為有機(jī)酸類和黃酮類等，其中穩(wěn)定存在的有機(jī)酸類成分為沒食子酸[2,11]。沒食子酸又名五倍子酸、棓酸，化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基苯甲酸（C7H605），為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末，通常以一水合物的形式存在[12]。沒食子酸具有多種生物活性，如抗菌[13]、抗病毒[14]、抗炎、清除自由基和預(yù)防心血管疾病[15-16]、抗氧化[17-18]、抗癌[19-20]、預(yù)防糖尿病[21-22]等，有著廣闊的應(yīng)用前景。因此，檢測(cè)趕黃草中的沒食子酸含量對(duì)于評(píng)估趕黃草品質(zhì)具有重要意義。

已有研究者建立不同的分析方法檢測(cè)趕黃草等樣品中沒食子酸含量。在樣品提取方面，有研究[23]建立了回流法、超聲法、冷浸法3 種方法提取趕黃草中的沒食子酸，以沒食子酸含量為指標(biāo)，采用反相高效液相色譜法測(cè)定提取液中沒食子酸的含量，分別比較回流法、超聲法和冷浸法3 種提取方法對(duì)趕黃草中沒食子酸的提取效果，結(jié)果表明，3 種提取方法的提取效率分別為1.98、1.67 和0.86 mg·g-1。在檢測(cè)方面，THOMAS 等[24]建立了同時(shí)測(cè)定辣木乙醇和水葉提取物中沒食子酸、槲皮素和蘆丁的高效薄層色譜法。劉文等[25]建立了測(cè)定余甘子中沒食子酸的反射鋸齒薄層掃描法。薄層掃描法前處理要求低，可同時(shí)分析多個(gè)樣品，但由于制板、點(diǎn)樣、展開等操作的差異，穩(wěn)定性較差。胡楊等[26]建立高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定趕黃草及醇提物中沒食子酸的含量。LI 等[27]采用高效液相色譜法測(cè)定茶酒中兒茶素和沒食子酸的含量，結(jié)果表明茶酒中兒茶素和沒食子酸含量較高。此外，發(fā)酵后茶汁的兒茶素和沒食子酸含量會(huì)下降，其中，沒食子酸含量下降13.56%。

高效液相色譜法具有選擇性好、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用于沒食子酸檢測(cè)的最普遍方法，但需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，因檢測(cè)沒食子酸樣品的時(shí)間較長，還需要優(yōu)化前處理?xiàng)l件。SUN 等[28]建立了液相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用于大鼠口服山楂水提取物后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，不依賴峰與峰之間的分離度，信號(hào)采集時(shí)間短，為分析沒食子酸提供了可靠方法，但對(duì)樣品前處理的要求較高，檢測(cè)成本高。申銅飛等[29]建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定藏青果中沒食子酸的含量。氣相色譜-質(zhì)譜法分離性能和檢測(cè)性能高，分析時(shí)間相對(duì)較快，但檢測(cè)結(jié)果會(huì)由于樣品提取方法不同而導(dǎo)致沒食子酸的分析結(jié)果受到影響。ZHAN 等[30]采用近紅外光譜結(jié)合多元分析對(duì)芍藥中沒食子酸、兒茶素、白花素和芍藥甙進(jìn)行定量分析，考察對(duì)不同地區(qū)樣品進(jìn)行分類的可行性，開發(fā)并驗(yàn)證了一種新的高效液相色譜方法，以分析芍藥中的沒食子酸、兒茶素、白芍素和芍藥甙作為參考。采用偏最小二乘法、主成分回歸法和逐步多元線性回歸法對(duì)回歸模型進(jìn)行標(biāo)定。近紅外光譜法對(duì)于樣品中沒食子酸的前處理簡單、檢測(cè)快速方便，可以作為半定量分析法用于大規(guī)模篩查。張澤宇等[31]建立測(cè)定地榆中沒食子酸含量的高效毛細(xì)管電泳法。翟海云等[32]建立了測(cè)定沒食子酸的毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法。毛細(xì)管電泳法能夠在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定沒食子酸的含量，具有快速、高效的特點(diǎn)，但由于電滲會(huì)因樣品組成而變化，因而該法重現(xiàn)性較差。綜上，沒食子酸的測(cè)定方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中，高效液相色譜是最常用于檢測(cè)沒食子酸的方法[33-34]，具有高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。

趕黃草的主要食用方式為泡飲。研究表明，沖泡條件對(duì)茶葉中溶出物質(zhì)的含量存在影響[35]，例如茶多酚的含量。茶葉泡制的持續(xù)時(shí)間、泡茶所用水的溫度和沖泡茶葉的頻率次數(shù)會(huì)對(duì)茶湯中活性物質(zhì)茶多酚的含量有直接影響，當(dāng)延長洗茶的時(shí)間，茶多酚的溶出量會(huì)快速增加；當(dāng)升高洗茶的溫度，茶多酚的溶出量也會(huì)有不同程度的增加，用沸水泡茶會(huì)更利于茶多酚的溶出。因此，正確選擇和把握科學(xué)的泡茶方法可以充分溶出茶多酚等茶葉中的有益成分，最大限度發(fā)揮茶葉本身的健康價(jià)值。已有研究測(cè)得趕黃草中沒食子酸含量為0.213～13.990 mg·g-1[26,36-38]，然而，目前尚無研究比較不同沖泡條件對(duì)趕黃草中沒食子酸溶出量的影響。

綜上，本研究擬建立測(cè)定趕黃草中沒食子酸含量的高效液相色譜法，評(píng)估趕黃草中沒食子酸在不同沖泡條件下的溶出量，為更好地開發(fā)趕黃草產(chǎn)品提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

趕黃草購自瀘州盛邦中藥材研究有限公司。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC ≥98%），購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈、甲醇和磷酸（85%～90%）均為色譜純，購自上海麥克林生化有限公司。實(shí)驗(yàn)室用超純水由Milli-Q 凈化系統(tǒng)制備（18 MΩ·cm，德國默克公司）。

安捷倫1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，德國沃爾德布?。?，配有1260 Quat Pump VL、G7129A 1260 自動(dòng)取樣器和G7114A 1260 紫外檢測(cè)器。試驗(yàn)中使用的其他儀器包括SPECTROstar Nano 高通量紫外分光光度計(jì)（廣州伯齊生物科技有限公司）、（Toruńska 5, 26-600，波蘭拉多姆）、5430R 離心機(jī)（Eppendorf AG, 22331，德國漢堡）、SB-800 DTD超聲波清洗機(jī)（寧波森茲生物科技有限公司，中國寧波）、FCD-2000 Serials 恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00 mg·mL-1）：稱取一定量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解在甲醇中配制濃度為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封并儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。

1.2.2 樣品處理

在方法建立階段，參考王星月等[39]提取趕黃草中沒食子酸的方法，分別稱取10 mg 干燥的趕黃草花、莖和葉粉末至15 mL 離心管內(nèi)，添加10 mL 50%甲醇水超聲30 min，用0.45 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

為測(cè)定趕黃草中沒食子酸在不同沖泡條件下的溶出量，參考茶葉的泡制條件[40]，取趕黃草葉、莖和花各100 mg，分別用5 mL 不同溫度的超純水浸泡5～60 min，浸泡液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.3 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（安捷倫科技公司，美國）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇:乙腈:0.2%磷酸溶液（8:5:87，V:V）；流速：0.9 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長：264 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

測(cè)定沒食子酸所用HPLC 條件采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[41]，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。首先通過紫外分光光度計(jì)掃描10 μg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在220～1 000 nm 的紫外光譜，確定沒食子酸的最大吸收波長為264 nm。為了分離干擾物，保證靈敏度并減少運(yùn)行時(shí)間，對(duì)流動(dòng)相、柱溫和流速進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行優(yōu)化，流動(dòng)相主要為甲醇、乙腈和0.2%磷酸，確定最佳流動(dòng)相比例。當(dāng)甲醇體積比為3%～10%時(shí)，沒食子酸的保留時(shí)間縮短，峰形變差，和基質(zhì)中干擾物間的分離度變差；在甲醇體積為8%時(shí)沒食子酸的峰形最好，且與其他雜質(zhì)的分離效果最好。在乙腈體積比為3%～7%時(shí)，沒食子酸的保留時(shí)間縮短，峰形變差，與雜質(zhì)的分離度變差；在乙腈體積為5%時(shí)，沒食子酸的峰形最好，且與雜質(zhì)的分離效果最好。最終采用流動(dòng)相為甲醇:乙腈:0.2%磷酸溶液=8:5:87（V:V）。對(duì)25 ～40 ℃柱溫進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)峰面積、保留時(shí)間和分離度確定最佳柱溫溫度，結(jié)果表明：在35 ℃下沒食子酸的峰形最好，與雜質(zhì)的分離度最高，故選擇柱溫35 ℃。對(duì)0.8 ～1.2 mL·min-1流速進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：隨著流速增快，保留時(shí)間縮短，但峰面積降低，在0.9 mL·min-1時(shí)，沒食子酸的峰形和保留時(shí)間均較好。優(yōu)化后的高效液相色譜條件如下：流動(dòng)相：甲醇:乙腈:0.2%磷酸水溶液（8:5:87，V:V）；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL·min-1。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍、檢出限與定量限

用超純水稀釋對(duì)照品溶液，配制濃度分別為0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.020 μg·mL-1、0.050μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.500μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得沒食子酸在0.005～10μg·mL-1線性范圍的回歸方程：y = 31.439x - 0.754 3（r=0.999 8，n=11）。根據(jù)信噪比（S/N）=3 得出檢出限（Limit of Detection，LOD）為3.77 ng·g-1，根據(jù)信噪比（S/N）=10 得出定量限（Limit of Quantif ication，LOQ）為12.441 ng·g-1。結(jié)果如表1 所示。

表1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限表

2.2.2 方法準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

分別向10 mg 趕黃草粉末中添加200 μg·g-1、440μg·g-1和850 μg·g-1沒食子酸來進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以評(píng)估方法的準(zhǔn)確度與精密度。表2 為本方法的回收率和精密度(n=3)表，由表2 可知，沒食子酸的加標(biāo)回收率為93.2%～98.2%。通過在同一天分析3 個(gè)濃度的趕黃草加標(biāo)樣品來評(píng)估方法的日內(nèi)精密度，并通過連續(xù)3 d 分析這3 個(gè)濃度的趕黃草加標(biāo)樣品來評(píng)估方法的日間精密度。結(jié)果表明：日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.07%～7.05%和2.27%～3.74%。圖1為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、趕黃草樣品色譜圖和趕黃草加標(biāo)樣品色譜圖。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、趕黃草樣品色譜圖和趕黃草加標(biāo)樣品色譜圖

表2 本方法的回收率和精密度 (n=3)表

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

為評(píng)估不同沖泡條件對(duì)趕黃草中沒食子酸溶出量的影響，參考茶葉的泡制條件[40]，取趕黃草葉、莖和花各100 mg，分別用5 mL 的25 ℃、80 ℃和90 ℃超純水浸泡5 min、10 min、20 min、30 min 和60 min，浸泡液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用所建高效液相色譜法檢測(cè)。結(jié)果如圖2 所示，經(jīng)超純水沖泡后，趕黃草的葉、莖和花中沒食子酸溶出量分別為91 ～2 478μg·g-1，118 ～616 μg·g-1和116 ～787 μg·g-1。趕黃草的葉在80 ℃沖泡60 min 溶出的沒食子酸含量最高；不同溫度下沒食子酸的溶出量均隨著沖泡時(shí)間增加而增加；80 ℃沖泡后溶出的沒食子酸量最高，可能是因?yàn)殡S著溫度增加，沒食子酸在水中的溶出效率升高，但部分溶出的沒食子酸在90 ℃高溫下發(fā)生分解。趕黃草的莖在90 ℃泡制20 min 所得沒食子酸含量最高；在25 ℃和80 ℃超純水中溶出的沒食子酸含量隨著時(shí)間的增加有增加趨勢(shì)；在90 ℃超純水中沖泡20 min時(shí)沒食子酸溶出量達(dá)到最高，隨后含量降低。趕黃草的花在90 ℃超純水中沖泡60 min 后溶出的沒食子酸含量最高，不同溫度下沒食子酸溶出量均隨著時(shí)間增加而增加。趕黃草的葉、莖和花的沖泡結(jié)果均提示80℃沖泡后溶出的沒食子酸量較高，25 ℃沖泡后溶出的沒食子酸含量較低，而90 ℃沖泡后溶出的沒食子酸含量不穩(wěn)定。

圖2 不同沖泡條件對(duì)趕黃草的葉、莖和花中沒食子酸溶出量的影響圖

3 結(jié)論

本研究建立了測(cè)定趕黃草中沒食子酸的高效液相色譜法，該法準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定，可用于趕黃草的質(zhì)量評(píng)估。此外，本文比較了趕黃草的葉、莖和花經(jīng)25 ℃、80 ℃和90 ℃超純水沖泡5～60 min 溶出的沒食子酸含量，發(fā)現(xiàn)趕黃草的葉經(jīng)超純水在80 ℃沖泡60 min 后溶出沒食子酸含量最高，該結(jié)果能夠?yàn)槠髽I(yè)更好地開發(fā)利用趕黃草提供技術(shù)依據(jù)，為消費(fèi)者選擇趕黃草產(chǎn)品和泡飲方式提供數(shù)據(jù)支撐。