4種忍冬屬植物花粉形態(tài)的數(shù)量分類及其活力比較研究

陳燕 曹穎 劉恒星 劉東煥

摘要 ［目的］了解忍冬屬物種的親緣關(guān)系及花粉可育性，為忍冬分類和雜交育種工作提供科學(xué)依據(jù)。［方法］采集4種忍冬屬植物新鮮花粉，分別進(jìn)行花粉形態(tài)的掃描電鏡觀測(cè)及不同溫度處理下花粉離體萌發(fā)的活力檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。［結(jié)果］忍冬屬花粉均為球形或近球形（1.10≤P/E≤1.15），中等或大花粉，3或4環(huán)狀萌發(fā)孔溝，外壁紋飾為較為粗糙的刺突。聚類分析表明，新疆忍冬與剛毛忍冬的關(guān)系最近，金銀花與貫月忍冬在歐式距離12處聚為一類。新疆忍冬的花粉活力最強(qiáng)，達(dá)到56.04%，剛毛忍冬在各種溫度處理下花粉活力相對(duì)較低，僅為15.23%，2種藤本忍冬花粉活力居中，為40%～50%。新疆忍冬和剛毛忍冬的花粉在中溫環(huán)境下萌發(fā)最好，貫月忍冬和金銀花的花粉在高溫環(huán)境中更易萌發(fā)。［結(jié)論］花粉形態(tài)的數(shù)量分類結(jié)果與現(xiàn)行忍冬屬植物分類系統(tǒng)大致吻合，可以指導(dǎo)雜交育種工作、花粉活力強(qiáng)的物種可作為雜交授粉的父本。

關(guān)鍵詞 忍冬屬；花粉形態(tài)；花粉活力；親緣關(guān)系；雜交

中圖分類號(hào) S 567.7+9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）07-0116-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.028

Numerical Taxonomy of Pollen Grain Morphology and Comparsion of Pollen Grain Viability in Four Species of Lonicera Linn.

CHEN Yan1，2，?? CAO Ying1，2，?? LIU Heng-xing1，2 et al

（1.Beijing Botanical Garden/Beijing Floriculture Engineering Technology Research Centre， Beijing 100093; 2.Beijing Laborary of Urban and Rural Ecological Environment， Beijing 100083）

Abstract ［Objective］In order to understand the genetic relationships and pollen fertility of Lonicera， as well as to provide references for classification and cross breeding. ［Method］Fresh pollens of four species in Lonicera were collected respectively. The pollen morphology was observed by scanning electron microscopy （SEM） and pollen germination in vitro was detected under different temperature treatments， then data were analyzed. ［Result］The results showed that the pollen grains of all Lonicera were spheroidal shape（1.10≤P/E≤1.15）， medium or large size with tricolporate or tetracolporate， and extine ornamentation was scabrous echinate. L. tatarica and L. hispida had closest relationship， L. japonica and L. sempervirens were clustered together when Euclidean distance was 12. The highest pollen germination rate was found in L. tatarica （56.04%）， whereas the pollen of L. hispida had the lowest viability （15.23%）， the pollen germination rates of two climbing honeysuckles were on average 40%-50%. Pollens of L. tatarica and L. hispida had best germination rate under medium temperature treatment， while L. japonica and L. sempervirens had optimum pollen germination rates under high temperature treatment. ［Conclusion］The genetic relationships of Lonicera based on pollen morphology were roughly consistent with the current classification system of Lonicera， which can guide cross breeding of this genus. Species with high pollen viability can be served as pollen donors for cross breeding.

Key words Lonicera;Pollen morphology;Pollen viability;Genetic relationship;Cross breeding

基金項(xiàng)目 北京市科技計(jì)劃課題項(xiàng)目“基于改善本地生態(tài)功能的植物引進(jìn)、篩選、培育研究及示范”（D171100007117002）。

作者簡(jiǎn)介 陳燕（1981—），女，青海西寧人，正高級(jí)工程師，碩士，從事園林植物引種選育研究。通信作者，正高級(jí)工程師，碩士，從事園林植物栽培生理研究。

收稿日期 2022-08-08

忍冬屬（Lonicera）植物隸屬川續(xù)斷目忍冬科，依據(jù)不同的分類觀點(diǎn)，《中國植物志》和《Flora of China》分別記載全球有180種和143種，分布于北美洲、歐洲、亞洲和非洲北部的溫帶和亞熱帶地區(qū)，我國分別有98和57種，以西南部種類最多［1-2］。忍冬屬以富含觀賞植物和傳統(tǒng)中藥材而著稱，具有重要的生態(tài)、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3-4］。

花粉是植物的雄性生殖器官，其形態(tài)主要受基因型調(diào)控，是研究植物分類和親緣關(guān)系的重要依據(jù)之一［5-6］。對(duì)該屬植物花粉形態(tài)研究多以藥用金銀花、食用藍(lán)靛果或某一地區(qū)的植物為主［7-10］，而對(duì)該屬不同種源地不同物種之間的花粉形態(tài)比較尚鮮見報(bào)道，對(duì)該屬植物的分類體系也尚未完全達(dá)成一致［1-3，11-12］。掌握忍冬屬物種間親緣關(guān)系有利于開展雜交育種工作。

雜交育種是該屬植物新品種培育方法之一［4］，父本花粉活力的高低直接影響著育種的成效［13］?；ǚ刍盍κ苓z傳特性、環(huán)境因素、貯藏方法和貯藏時(shí)間等多方面的影響［14-15］，不同物種花粉活力及同一物種在不同環(huán)境條件下花粉活力是有差異的?；ǚ刍盍梢酝ㄟ^K-KI溶液、TTC染色以及花粉離體萌發(fā)率等多種方法測(cè)定，而最可靠的測(cè)定方法之一是花粉離體萌發(fā)率的測(cè)定，是衡量花粉萌發(fā)力的直接指標(biāo)［16］。劉安成等［17］比較了不同培養(yǎng)基配比、不同培養(yǎng)溫度及不同花粉采集時(shí)間對(duì)幾種藤本忍冬花粉離體萌發(fā)率的影響；尉倩等［18］優(yōu)選出郁香忍冬的新鮮花粉在30%蔗糖+100 mg/L硼酸的離體花粉培養(yǎng)液上于溫度12 ℃環(huán)境中培養(yǎng)3 h，萌發(fā)率可達(dá)96.28%；郭紅艷等［19］研究認(rèn)為，2個(gè)金銀花品種均在20%蔗糖+0.03%硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)效果最好；劉會(huì)超等［20］研究認(rèn)為，150 mg/L蔗糖、30 mg/L硼酸培養(yǎng)基有利于金銀花花粉的萌發(fā)，其花粉低溫貯藏（-80 ℃）優(yōu)于冷藏（4 ℃、 -23 ℃），不宜常溫貯藏；王麗瑛等［15］研究認(rèn)為，韃靼忍冬等3種忍冬花粉適合于低溫0～4 ℃貯藏，而花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基為10％蔗糖+1％瓊脂；歐洲甜櫻桃花粉活力在30 ℃迅速下降［14］。

筆者運(yùn)用掃描電鏡對(duì)4種忍冬花粉形態(tài)特征進(jìn)行觀察比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討物種之間的親緣關(guān)系，旨在形成科學(xué)有效的雜交組合，通過不同溫度處理下忍冬花粉離體萌發(fā)率的測(cè)定比較，篩選出育性好的父本花粉，以期為分類和雜交育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材為2017—2019年在全國各地引種收集的4種忍冬屬植物（表1）。栽種于北京植物園苗圃內(nèi)，正常養(yǎng)護(hù)管理，正常開花結(jié)實(shí)。2021年4—6月，即不同植物各自自然初花期，分別采集其含苞待放的花蕾、取出花藥、陰干后保存至小玻璃瓶中，在4 ℃冰箱低溫貯藏，待測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀測(cè)。

將干燥的新鮮花粉少量均勻地涂在粘有雙面膠帶的金屬樣品臺(tái)上，用常規(guī)真空噴鍍法噴金處理后，將樣品置于Hitachi S-4800型掃描電鏡下觀察，選取完整飽滿外形和大小有代表性的花粉粒，在清晰視野下觀察花粉的形狀、大小、萌發(fā)孔、表面紋理等特征，并攝像。

每種材料各隨機(jī)選取攝像清晰的10?；ǚ郏４鎴D片用Image J軟件分別測(cè)定花粉的極軸長（P）、赤道軸長（E）、邊緣直立的刺突長度（L）、正面刺突基部直徑（Dia）、刺突密度（D）、萌發(fā)孔長度和萌發(fā)孔寬度等定量數(shù)據(jù)以及表面紋飾和花粉類型等定性指標(biāo)，其中用花粉粒表面中部每（15×15） μm2所分布的刺突數(shù)衡量花粉表面刺突的密度（D），定性指標(biāo)則采用分解法進(jìn)行編碼（表2）。描述術(shù)語參照《孢粉學(xué)術(shù)語》［21］和《孢粉學(xué)手冊(cè)》［22］。利用 SPSS 19軟件將數(shù)據(jù)方差分析后，對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，然后對(duì)各主成分采用類平均法和歐氏距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，繪制聚類分析圖。

1.2.2 花粉活力測(cè)定。

對(duì)采集的新鮮花粉采用懸滴離體培養(yǎng)法測(cè)定花粉活力，在蓋玻片上滴1滴成分為20%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%鈣的花粉培養(yǎng)液［17，19］，均勻地將花粉用解剖針挑落在液滴上，然后將蓋玻片反轉(zhuǎn)，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的表面潮濕的凹穴載玻片上，分別在8 ℃12 h/15 ℃12 h、15 ℃12 h/25 ℃12 h、25 ℃12 h/35 ℃12 h的氣候箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，之后在顯微鏡下觀測(cè)花粉管生長情況，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3個(gè)視野，計(jì)算其平均萌發(fā)率。

萌發(fā)率（%）=視野中萌發(fā)的花粉數(shù)（粒）/視野中總花粉數(shù)（粒）×100%，以萌發(fā)率作為花粉活力的指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉形態(tài)比較

2.1.1 花粉大小與形狀。

從圖1、表3可以看出，供試樣本赤道面觀均為圓球形或近球形（1.10≤P/E≤1.15），極面觀為三裂或四裂圓形。新疆忍冬和剛毛忍冬為中等花粉（25～50 μm），金銀花和貫月忍冬2種藤本類忍冬為大花粉（50～100 μm）。

2.1.2 花粉萌發(fā)孔特點(diǎn)。

所有樣本均為環(huán)狀萌發(fā)孔溝類型，且溝普遍較短，除了剛毛忍冬孔溝明顯有較深的孔洞外，其余從表面看內(nèi)孔不顯著。剛毛忍冬為N3P4C5型，其余3種為N3P4C3型花粉（表3）。

2.1.3 花粉表面紋飾。

該屬花粉外壁紋飾粗糙狀，多為刺突狀，其中新疆忍冬和剛毛忍冬外壁紋飾為刺突狀及具有微小、不規(guī)則條紋的覆蓋層表面，2種藤本忍冬為刺突狀與具有微小、淺薄的穿孔狀覆蓋層組合（表3）。

2.1.4 數(shù)據(jù)分析。

主成分分析是一種降維或?qū)⒍鄠€(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，通過軟件分析得到特征值和特征向量（表4）。由表4可知，第1主成分貢獻(xiàn)率為55.276 0%，第2主成分貢獻(xiàn)率為29.704 8%，第3主成分貢獻(xiàn)率為15.019 2%，3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，可反映原始數(shù)據(jù)信息，作為數(shù)據(jù)有效成分，進(jìn)一步得到4個(gè)物種的成分得分（表5）。

采用表5中主成分得分代替原始指標(biāo)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析［23］，結(jié)果見圖2。聚類分析將樣本分為3組，第1組為新疆忍冬和剛毛忍冬，共有特征是花粉普遍較小，表面紋飾為刺突狀，且其覆蓋層具有微小的不規(guī)則條紋；第2組為忍冬組金銀花，特征是大花粉，萌發(fā)溝短，表面紋飾為刺突狀和具有微小、淺薄的穿孔狀覆蓋層組合；第3組為花粉較大、萌發(fā)溝較長的貫月忍冬。這大致與現(xiàn)行忍冬屬植物分類系統(tǒng)吻合［1-3］，新疆忍冬、剛毛忍冬為灌木屬忍冬亞屬，金銀花、貫月忍冬屬為藤本類。

2.2 不同溫度條件下花粉活力測(cè)定

從表6、圖3可以看出，在8 ℃/15 ℃的低溫變溫條件下，除了剛毛忍冬花粉不能萌發(fā)外，其余物種花粉萌發(fā)率普遍偏低，不超過30%；中、高溫培養(yǎng)使幾種忍冬花粉均有不同程度的萌發(fā)，其中新疆忍冬萌發(fā)率最高，分別為56.04%和53.03%，其次依次為貫月忍冬和金銀花，也均在20%以上，剛毛忍冬花粉在該溫度范圍內(nèi)較低溫培養(yǎng)有一定程度的萌發(fā)，但萌發(fā)率較低，為15%左右。

由此可知，8 ℃/15 ℃低溫培養(yǎng)不利于4種忍冬花粉的萌發(fā)，隨著溫度的升高其花粉萌發(fā)力逐漸升高。新疆忍冬和貫月忍冬花粉在各種溫度環(huán)境下均有不同程度的萌發(fā)，但中、高溫環(huán)境更有利于其花粉的萌發(fā)，低溫狀態(tài)花粉不活躍；金銀花在各種溫度下均有較好的萌發(fā)效果，其中在高溫培養(yǎng)下花粉萌發(fā)效果最好；剛毛忍冬在低溫環(huán)境下花粉不能萌發(fā)，在中、高溫環(huán)境下花粉萌發(fā)力也不高，因此不適合作為雜交父本。

3 結(jié)論與討論

3.1 花粉形態(tài)確定分類關(guān)系與演化趨勢(shì)推導(dǎo)

花粉形態(tài)很少受到環(huán)境因素的影響，在進(jìn)化過程中具有保守性，可用于物種親緣關(guān)系和分類研究［24-25］。忍冬屬花粉均為球形或近球形，中等或大花粉，3或4環(huán)狀萌發(fā)孔溝，外壁紋飾為相對(duì)較為粗糙的刺突。通過花粉形態(tài)的聚類分析表明，空枝組的新疆忍冬與大苞組的剛毛忍冬關(guān)系較近，金銀花與貫月忍冬在歐式距離12處聚為一類。聚類結(jié)果總體上支持現(xiàn)行形態(tài)學(xué)和分子分類結(jié)果，但也出現(xiàn)了一些不一致的情況，如隸屬忍冬亞屬（Subgen.Chamaecerasus）的金銀花因花粉大小與該亞屬的新疆忍冬和剛毛忍冬差異過大，而其遺傳距離較與輪花亞屬（Subgen.Lonicera）的貫月忍冬更近一些，因此不能完全依據(jù)花粉形態(tài)確定植物的分類地位。

目前普遍認(rèn)為，花粉是從大向小、從外表光滑到粗糙的順序演化，即相對(duì)原始的被子植物花粉體積相對(duì)較大，外壁相對(duì)光滑［23］。該研究供試樣本中貫月忍冬個(gè)體最大、外壁刺突相對(duì)平滑柔和，而隸屬中等大小花粉的新疆忍冬和剛毛忍冬外壁粗糙，為刺突狀與覆蓋層具條紋狀凸起的結(jié)合，忍冬亞屬物種比貫月忍冬進(jìn)化，這與湯彥承等［11］所述的“輪花亞屬保留較多的原始性狀，顯示其古老性”相符合。

3.2 花粉形態(tài)與花形態(tài)比較

花粉大的植物，其花朵也相對(duì)較大，如藤本類忍冬均為大花粉，而其花朵也相對(duì)較大，有研究表明花粉大小與花柱大小有一定的相關(guān)性［26］，花柱與花朵也存在一定比例關(guān)系，花朵大小、花粉數(shù)量與花粉大小的關(guān)系需做進(jìn)一步研究。另外，從花粉形態(tài)聚類分析可以看出，遺傳距離較近的物種花期也較接近，如新疆忍冬與剛毛忍冬均為4月左右開花，而與其關(guān)系較遠(yuǎn)的種類開花時(shí)間也相繼不同，植物物候期和親緣關(guān)系是否存在相關(guān)性、花期不同是否存在生殖隔離等也需要進(jìn)一步探討。

3.3 不同溫度處理下的花粉活力

植物花粉活力是基因和環(huán)境互作的結(jié)果［14］。在最適溫度環(huán)境下，花粉萌發(fā)力強(qiáng)的物種，適應(yīng)性強(qiáng)，結(jié)實(shí)率較高，繁衍后代的能力較強(qiáng)，而花粉萌發(fā)力低會(huì)阻礙物種傳粉受精、坐果結(jié)種，從而影響其繁衍生息，甚至?xí)?dǎo)致物種瀕危滅絕［27］。該研究中，新疆忍冬的花粉活力最強(qiáng)，在自然界的結(jié)實(shí)率也最高，植物擴(kuò)散能力強(qiáng)，而剛毛忍冬在各種溫度處理下花粉活力相對(duì)較低，適應(yīng)環(huán)境的能力相對(duì)較弱，2種藤本忍冬花粉活力居中。

測(cè)試植物產(chǎn)地不同，花期物候也各異，因此花發(fā)育所需的環(huán)境條件也各不相同。該研究中原產(chǎn)新疆的新疆忍冬以及原產(chǎn)高海拔的剛毛忍冬花期靠前，氣溫相對(duì)較低，花粉在中溫環(huán)境下萌發(fā)最好，而原產(chǎn)北美和河北并廣布全國多地的貫月忍冬和金銀花，花期相對(duì)較晚，溫度逐漸升高，其花粉在高溫環(huán)境中更易萌發(fā)。這與Hedhly等［14］研究得出的“植物花粉萌發(fā)的最佳溫度反映了該植物自然花期的主要溫度變化”一致，有研究表明，喜溫暖植物的花粉萌發(fā)溫度比喜冷涼的植物所需溫度高，同時(shí)花粉萌發(fā)對(duì)溫度的不同要求，在一定程度上也能反映該植物的耐熱性［14］，說明金銀花和貫月忍冬比其他2種灌木忍冬更加耐熱。

3.4 花粉形態(tài)和活力測(cè)試結(jié)果對(duì)雜交育種的指導(dǎo)

將上述測(cè)試結(jié)果運(yùn)用于雜交育種實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)除了空枝組內(nèi)部、忍冬組內(nèi)部雜交可以結(jié)實(shí)，大苞組的剛毛忍冬與新疆忍冬、貫月忍冬與忍冬亞屬忍冬組的金銀花雜交均可獲得雜種，但需要注意正反交，如貫月忍冬為母本、金銀花為父本的組合可以結(jié)實(shí)，反之則不能結(jié)實(shí)，這與父母本大小孢子發(fā)育情況相關(guān)，還需做進(jìn)一步研究。

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