18種觀賞植物F3′5′H基因生物信息學(xué)分析

曾慧蘭 高陽(yáng) 盧毅

摘要 采用生物信息學(xué)方法對(duì)18種觀賞植物類黃酮-3′5′-羥化酶基因（flavonoid-3′5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）的mRNA和氨基酸序列的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和同源性進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。結(jié)果表明，絕大多數(shù)觀賞植物的F3′5′H為親水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)，以α 螺旋為主、無(wú)信號(hào)肽的跨膜蛋白質(zhì)；大多數(shù)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型為5ylw.1.A 鐵銹醇合成酶，為單鏈蛋白，屬于細(xì)胞色素P450基因家族；同源保守氨基酸序列為“LPPGP”“AGTDTS”和“PFGAGRRICAG”。

關(guān)鍵詞 生物信息學(xué)；觀賞植物；氨基酸序列；類黃酮-3′5′-羥化酶

中圖分類號(hào) S 68? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）07-0103-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.026

Bioinformatical Analysis of Flavonoid-3′5′-Hydroxylase Genes Originated from 18 Ornamental Plants

ZENG Hui-lan1，2，GAO Yang1，LU Yi1

（1.College of Life Science and Resources and Environment，Yichun University，Yichun，Jiangxi 336000; 2. Key Laboratory of Crop Growth，Development and Regulation，Yichun University，Yichun，Jiangxi 336000）

Abstract Predictive analyses of the mRNA sequence or amino acid sequences of the flavonoid 3′5′-hydroxylase gene （F3′5′H） originated from 18 ornamental plants and their physical and chemical parameters，transmembrane domains，conserved domains，subcellular localizations，secondary structure，tertiary structure and evolutionary relationships were explored using bioinformatics method.The results suggested that most F3′5′H of the 18 ornamental plants are hydrophilic stable proteins and transmembrane proteins ，which are mainly made of alpha-helix and no signal peptides; they are mostly located on endoplasmic reticulum membrane and assigned to 5ylw.1.A，which belongs to cytochrome P450 superfamily and is a monomer named ferruginol synthase in tertiary structure analysis;the Homologous conserved amino acid sequences are “LPPGP” “AGTDTS” and “PFGAGRRICAG”.

Key words Bioinformatical;Ornamental plants;Amino acid sequence;Flavonoid-3′5′-hydroxylase

基金項(xiàng)目 江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題項(xiàng)目（KFJJ-201704）；宜春學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2103360117013）。

作者簡(jiǎn)介 曾慧蘭（1986—），女，江西宜春人，講師，博士，從事花色機(jī)理和園藝植物病害研究。

收稿日期 2022-04-12

花色是觀賞植物的重要性狀，植物的花色主要是由黃酮類化合物、類胡蘿卜素和生物堿3類物質(zhì)含量決定的［1］，而花色苷是黃酮類化合物的主要組成之一，能控制花的橙紅到藍(lán)紫等顏色［2］。類黃酮-3′5′-羥化酶 （flavonoid -3′5′ -hydroxylase，F(xiàn)3′5′H） 是花色苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一［3］。F3′5′H催化花色素母體B環(huán)3′、5′位形成羥基集團(tuán)，最終形成使花變藍(lán)的飛燕草色素，被稱為“藍(lán)色基因”［4］，所以它對(duì)藍(lán)色花的育種具有非常重要的作用［5］。

目前，已從鶴望蘭（Strelitzia reginae）、矮牽牛 （Petunia hybrida）、非洲堇 （Saintpaulia spp.）、細(xì)莖石斛 （Dendrobium moniliforme） 等多種植物中分離出F3′5′H基因并對(duì)其功能進(jìn)行了深入研究［6-9］。黃敏玲等［8］采用RT-PCR和RACE方法從鶴望蘭（Strelitzia reginae）黃色花萼中克隆到類黃酮生物合成途徑關(guān)鍵基因SrF3′5′H，并分析了其在鶴望蘭不同花期和花瓣中的表達(dá)含量。Qi 等［10］利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和qRT-PCR驗(yàn)證了蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis） PhF3′5′H在花色中的功能。嚴(yán)黎等［11］通過(guò)利用PCR方法擴(kuò)增了丹參 （Salvia miltiorrhiza Bunge） 中的F3′5′H基因全長(zhǎng)，并對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)的理化定性、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行了分析。方穎等［12］以華麗龍膽 （Gentiana sino-ornata） 為材料利用RT-PCR技術(shù)克隆了GsF3′5′H全長(zhǎng)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。也有不少研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)關(guān)注不同花色植物中F3′5′H的表達(dá)與功能，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析［2，13-14］。雖然當(dāng)前植物中F3′5′H基因功能和表達(dá)情況的研究不少，但目前對(duì)各植物中F3′5′H進(jìn)行系統(tǒng)比較生物信息學(xué)相關(guān)的詳細(xì)分析鮮有報(bào)道。

該研究利用生物信息學(xué)原理和軟件，對(duì)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已正式發(fā)表的18種觀賞植物的F3′5′H基因全長(zhǎng)mRNA和氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和同源性進(jìn)行分析，旨在為藍(lán)色花卉的分子育種提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI） GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已正式注冊(cè)、物種來(lái)源明確的18種觀賞植物的F3′5′H基因全長(zhǎng)mRNA核酸序列及其編碼的氨基酸序列 （表1）。在這18種觀賞植物中，藍(lán)紫色系花卉有10種，紅色系有6種，其他色系2種。

1.2 分析方法

運(yùn)用ProtParam［15］（https：//web.expasy.org/protparam/） 對(duì)氨基酸的基本理化性質(zhì)即氨基酸數(shù)、分子式、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性系數(shù)、帶負(fù)電殘基總數(shù) （Asp+Glu）、帶正電殘基總數(shù) （Arg+Lys）、親疏水性和脂肪族氨基酸指數(shù)進(jìn)行在線分析；通過(guò)SignalP 4.1［16］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1） 和SignalP 5.0［17］ （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0） 對(duì)各序列的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用TMHMM 2.0［18］ （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0） 分析氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)SMART［19］ （http：//smart.embl.de/smart/change_mode.pl） 驗(yàn)證跨膜區(qū)域；運(yùn)用PSORT［20］ （http：//psort1.hgc.jp/form.html）在線軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用WebLogo 3［21］ （http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi） 進(jìn)行保守區(qū)域分析；利用SOPMA［22］ （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html） 進(jìn)行氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用SWISS-MODEL［23］ （https：//swissmodel.expasy.org/） 進(jìn)行氨基酸序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用MEGA 11［24］ （https：//www.megasoftware.net/） 進(jìn)行上述序列的多重比對(duì)，尋找保守區(qū)域，并采用鄰接法 （Neighbor-Joining，NJ） 迭代數(shù)為999次建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其在遺傳學(xué)上的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 F3′5′H理化性質(zhì)分析

通過(guò)ProtParam 在線軟件對(duì)18種觀賞植物F3′5′H基因所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析 （表2），結(jié)果表明，18種觀賞植物F3′5′H基因編碼的氨基酸數(shù)為502～535，平均為510.1；相對(duì)分子量為55 827.39～58 080.35，平均為56 737.91；理論等電點(diǎn)為6.52～9.31，平均為8.39；不穩(wěn)定性系數(shù)為28.58～47.99，平均為38.365；帶負(fù)電殘基總數(shù) （Asp+Glu）為49～60，平均為54.5；帶正電殘基總數(shù) （Arg+Lys） 為52～66，平均為58.9;親水性平均系數(shù)為-0.146～0.085，平均為-0.041；脂肪族氨基酸指數(shù)為90.22～106.54，平均為96.42。從表2可知，有11種觀賞植物的F3′5′H為穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，占比61.11%；有4種觀賞植物的F3′5′H為不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，占比22.22%；有2種觀賞植物的F3′5′H為穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)，占比11.11%；有1種觀賞植物的F3′5′H為不穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)，占比5.56%。

2.2 F3′5′H信號(hào)肽和跨膜區(qū)域分析

信號(hào)肽的主要作用是促進(jìn)蛋白分泌到胞外，通常位于氨基酸序列的N端，是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈［25］，一般長(zhǎng)度為5～30個(gè)氨基酸。通過(guò)SignalP 4.1和5.0對(duì)F3′5′H編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽分析 （表3），結(jié)果表明，所測(cè)的16種觀賞植物的F3′5′H均無(wú)信號(hào)肽，只有虎頭蘭×黃蟬蘭和細(xì)莖石斛具有信號(hào)肽，信號(hào)肽所在位置分別為1～24位和1～20位氨基酸，且都與分泌 （Sec/secretory） 通路相關(guān)的能被一型信號(hào)肽酶 （SPI） 切除的信號(hào)肽。從表3可知，有15種植物的F3′5′H為跨膜蛋白，具有內(nèi)膜區(qū)域、外膜區(qū)域和跨膜區(qū)域；有3種植物的F3′5′H無(wú)跨膜區(qū)域，只有外膜區(qū)域。經(jīng)SMART分析驗(yàn)證，TMHMM 2.0所測(cè)的跨膜區(qū)域與SMART分析的結(jié)構(gòu)域一致。

2.3 F3′5′H亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)PSORT在線分析了8種觀賞植物F3′5′H的亞細(xì)胞定位 （表4），根據(jù)定位頻率和可靠性可知，該類蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性最大，為0.640～0.820，平均可靠性為0.786；其次為質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細(xì)胞核、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞外、高爾基體，最后為線粒體基質(zhì)空間和葉綠體類囊體膜上。結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)，可預(yù)測(cè)得F3′5′H可能有以下幾類運(yùn)輸方式來(lái)行使催化功能：一類是F3′5′H蛋白在游離核糖體中合成后，通過(guò)信號(hào)肽錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通過(guò)跨膜運(yùn)輸和膜泡方式分選到過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器行使催化功能，如虎頭蘭×黃蟬蘭；第二類是在游離核糖體中合成后，通過(guò)信號(hào)肽錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通過(guò)分泌方式分選到過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器行使催化功能，如細(xì)莖石斛；第三類是在游離核糖體中合成后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，以跨膜運(yùn)輸方式經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔再直接運(yùn)輸?shù)桨庑惺勾呋δ?，如飛燕草、一品紅、煙臺(tái)翠雀花、新墨西哥釣鐘柳、大花釣鐘柳、荷蘭鳶尾；第四類是在游離核糖體中合成后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通過(guò)跨膜運(yùn)輸方式分選到線粒體、葉綠體、高爾基體、過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器后行使催化功能，如非洲堇、長(zhǎng)筒藍(lán)曼陀羅、藍(lán)眼菊、瓜葉菊、菊花；第五類是直接由細(xì)胞核內(nèi)合成，不經(jīng)跨膜方式，可能直接在細(xì)胞質(zhì)中的線粒體、葉綠體等細(xì)胞器的特定部位中行使催化功能，如洋桔梗。

2.4 F3′5′H二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA軟件在線預(yù)測(cè)了18種觀賞植物F3′5′H的二級(jí)結(jié)構(gòu) （表5），表明F3′5′H主二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以 α 螺旋為主，其次為無(wú)規(guī)則卷曲、延伸主鏈，最少的二級(jí)結(jié)構(gòu)是β轉(zhuǎn)角。通過(guò)SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)結(jié)果中可知 （表6），所測(cè)的所有蛋白質(zhì)序列一致度均大于30%，適合用同源建模法進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，即符合SWISS-MODEL建模質(zhì)量評(píng)估條件，同時(shí)質(zhì)量評(píng)估系數(shù) GMQE和QMEAND值均較大（取值范圍為0～1），建模可靠。從表6可知，所測(cè)的18種觀賞植物F3′5′H的三級(jí)結(jié)構(gòu)均建模至同一蛋白模型 5ylw.1.A 鐵銹醇合成酶 （圖1），為單鏈蛋白，屬于細(xì)胞色素P450基因家族。

2.5 F3′5′H同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)MEGA 11中ClustalW比對(duì)分析，18種F3′5′H 編碼氨基酸的保守位點(diǎn)總計(jì)121個(gè)，明顯的保守序列有起始于48位的“LPPGP”序列、起始于334位的“AGTDTS”序列和起始于469位的“PFGAGRRICAG”序列。從WebLogo 3結(jié)果可知 （圖2），保守序列和ClustalW分析序列基本一致。

從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) （圖3） 可知，屬于同科植物的F3′5′H 其親緣關(guān)系較近，分屬茄科、菊科、蘭科、毛茛科、車前科的13種觀賞植物在科內(nèi)F3′5′H親緣關(guān)系近。在不同科屬間，茄科與龍膽科的洋桔梗和大戟科的一品紅F3′5′H親緣關(guān)系近；車前科與玄參科的金魚(yú)草和苦苣苔科的非洲堇F3′5′H親緣關(guān)系較近；鳶尾科的荷蘭鳶尾與菊科F3′5′H親緣關(guān)系較近。

3 結(jié)論與討論

觀賞植物的類黃酮-3′5′-羥基化酶 （F3′5′H） 是花青苷代謝途徑中重要的關(guān)鍵酶，對(duì)藍(lán)紫色花色的形成有重要的作用。目前越來(lái)越多的研究關(guān)注F3′5′H的基因功能，并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證［3，10，14］，但國(guó)內(nèi)外極少數(shù)研究從生物信息學(xué)角度關(guān)注各種觀賞植物F3′5′H基因和蛋白質(zhì)序列的差異。該研究從GenBank中搜索已發(fā)表的F3′5′H全長(zhǎng)mRNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)，共篩選出18種觀賞植物的核酸和蛋白質(zhì)序列，從理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、同源性等方面進(jìn)行分析。

從理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，雖然不同物種間的F3′5′H蛋白質(zhì)理化性質(zhì)略有差異，但大部分物種的不穩(wěn)定性系數(shù)為小于40，親水性平均系數(shù)為負(fù)值，且二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α螺旋為主，表明該類酶為以α螺旋為主的穩(wěn)定親水性單鏈蛋白，這與楊曉娜等［26］分析結(jié)果相一致。從三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，所測(cè)18種觀賞植物均建模至蛋白模型 5ylw.1.A 鐵銹醇合成酶，由此可推斷，在所有的分析指標(biāo)中，三維結(jié)構(gòu)可能是與其功能密切相關(guān)的一個(gè)指標(biāo)，為有待進(jìn)一步挖掘的功能指標(biāo)?？缒そY(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位分析表明，15種植物的F3′5′H為P450基因家族跨膜蛋白，具有內(nèi)膜區(qū)域、外膜區(qū)域和跨膜區(qū)域，也進(jìn)一步說(shuō)明了該蛋白的形成是經(jīng)過(guò)了跨膜運(yùn)輸加工后行使功能，且虎頭蘭×黃蟬蘭和細(xì)莖石斛有信號(hào)肽指引蛋白質(zhì)通過(guò)分泌通路進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這與楊曉娜等［26］分析結(jié)果基本一致。從序列同源性特征來(lái)看，F(xiàn)3′5′H有3個(gè)較保守的序列，分別是起始于48位的“LPPGP”序列連接膜錨定位點(diǎn)和酶蛋白球體部分的結(jié)合域、起始于334位的“AGTDTS”序列氧分子形成結(jié)合域和起始于469位的“PFGAGRRICAG”序列血紅素結(jié)合域，這與楊曉娜等［26］分析結(jié)果一致。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，F(xiàn)3′5′H蛋白質(zhì)序列可明顯表示出不同植物間的親緣關(guān)系，保守性較高，有利于區(qū)分不同物種間的親緣關(guān)系，該特性可能使其用于物種間的鑒定，提高物種分辨率。

近期雖然已有研究進(jìn)行了高等植物F3′5′H基因cDNA及其氨基酸序列的生物學(xué)分析［26］，但從該分析來(lái)看并未將所列植物的具體信息進(jìn)行詳細(xì)剖析，且多數(shù)植物的信息不夠具體全面，甚至有些序列與該研究相同，但得出了不同的結(jié)果。原因可能為在線軟件的版本問(wèn)題，或者雖然楊曉娜等［26］的研究列出23種高等植物的信息，但并未將該23種植物的全部信息詳細(xì)列出，而是進(jìn)行了概述與總結(jié)。

生物信息學(xué)是采用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)等方法分析生物學(xué)、生物化學(xué)等數(shù)據(jù)的一門綜合性學(xué)科。當(dāng)前基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了生物信息學(xué)的發(fā)展，而生物信息學(xué)也從各方面更好地輔助了生物學(xué)和育種技術(shù)的發(fā)展。利用生物信息學(xué)分析了18種觀賞植物F3′5′H蛋白質(zhì)序列的基本信息并做了詳細(xì)的剖析，可為后期藍(lán)色花的育種技術(shù)提供理論依據(jù)。

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