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    電子束對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蚴及其p38 mRNA 表達(dá)的影響

    2023-05-18 05:56:32楊麗萍路鵬霏古麗米來(lái)玉素甫吾日古麗巴吾東
    廣州醫(yī)藥 2023年4期
    關(guān)鍵詞:頭節(jié)電子束細(xì)粒

    楊麗萍 路鵬霏 周 欽 古麗米來(lái)·玉素甫 吾日古麗·巴吾東 毛 睿

    新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心(烏魯木齊 830000)

    棘球蚴病俗稱(chēng)包蟲(chóng)病,是由棘球蚴絳蟲(chóng)的中絳期幼蟲(chóng)寄生于人體及其余動(dòng)物所引起的一種人畜共患性疾?。?]。據(jù)估計(jì)因棘球蚴病導(dǎo)致全球畜牧業(yè)每年損失約20億美元,人類(lèi)因棘球蚴病的死亡率為2%~4%[2]。手術(shù)是治療細(xì)粒棘球蚴病的首選方法,但術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。近幾年,國(guó)內(nèi)外對(duì)甲苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑[3]等藥物的治療療效、藥理學(xué)等方面都做了深入的研究[4-6]。其臨床療效不甚理想,治愈率只有30%。因外科手術(shù)清除難度大、高復(fù)發(fā)率及藥物療效欠佳,對(duì)于棘球蚴病的治療仍需尋求新的方式。目前已證實(shí)放射治療對(duì)棘球蚴有明顯的殺傷作用,且放射療法的安全性相對(duì)較高,并有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)組織的改變[7-9]。

    放射治療主要分為外照射和近距離放射治療兩種技術(shù),外照射包括低能X線、電子束,有研究證實(shí)X線對(duì)棘球蚴病的治療有效[10],由于電子束對(duì)較表淺組織的照射有更高的控制率,有更好的劑量分布,且目前暫無(wú)電子束照射棘球蚴的相關(guān)研究,所以本研究采用電子束進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中有相應(yīng)的p38基因信號(hào)通路,p38基因是由Brewster等[11]研究發(fā)現(xiàn),它與寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)、繁殖信號(hào)傳遞過(guò)程密切相關(guān)[12-16],且在棘球蚴中較高表達(dá)[17-20],已有結(jié)論證實(shí)p38抑制劑可抑制體外培養(yǎng)的棘球蚴生長(zhǎng)[21-22],Gelmedin等提到[23]應(yīng)用基因抑制劑處理,可將體外培養(yǎng)的棘球蚴的p38基因信號(hào)通路阻斷,并使蟲(chóng)體死亡率明顯升高;Schiff 等[24]發(fā)現(xiàn)p38的基因有助于放療后的細(xì)胞修復(fù),證實(shí)p38基因可能會(huì)減弱放療療效。本研究通過(guò)電子束照射棘球蚴,觀察蟲(chóng)體大體結(jié)構(gòu)、死亡率的變化并檢測(cè)其中p38基因的表達(dá)情況,進(jìn)一步了解電子束對(duì)于棘球蚴的殺傷作用及p38基因在其中的作用機(jī)制,以期探索包蟲(chóng)病潛在治療靶點(diǎn),提供新的治療路徑。

    1 材料與方法

    1.1 棘球蚴來(lái)源

    本研究用于體外培養(yǎng)的棘球蚴來(lái)自自然感染棘球蚴的綿羊肝臟,由新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市畜牧站提供。研究方案通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查(倫理學(xué)審批號(hào):IACUC-20141021002)。

    1.2 主要試劑

    磷酸鹽緩沖液(PBS);培養(yǎng)'基:RPMI 1640培養(yǎng)基、含有100 U/mL的青霉素及100 μg/mL鏈霉素的雙抗、胎牛血清;含有1%胃蛋白酶的消化液;0.1%的亞甲基藍(lán)染色劑;Trizol;氯仿;異丙醇;DEPC水;無(wú)水乙醇等。

    1.3 原頭蚴分離

    抽取羊肝包囊內(nèi)液體至50 mL培養(yǎng)管中,將棘球蚴沉淀置于消化液中,并于37 ℃水浴30 min,每隔5 min觀察消化情況,無(wú)明顯可見(jiàn)囊皮,停止胃蛋白酶消化過(guò)程,消化完畢后檢測(cè)原頭蚴的活性。

    1.4 原頭蚴活性觀察及計(jì)數(shù)

    吸取1 μL蟲(chóng)體至EP管中,進(jìn)行染色,用PBS沖洗染液,用光鏡觀察原頭蚴活性、數(shù)量等,重復(fù)4~5次得均值,以此估算蟲(chóng)體總數(shù)。

    1.5 原頭蚴體外培養(yǎng)

    將含有胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、100 IU/mL的青鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液稀釋細(xì)粒棘球蚴原頭蚴至2 000粒/mL,移置于培養(yǎng)瓶中,共分為同等的3瓶,在37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),需每2~3天更換一次更換培養(yǎng)液,注意實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的培養(yǎng)時(shí)間不宜超過(guò)3 d。

    1.6 原頭蚴電子束照射

    用0 Gy、30 Gy、60 Gy的6 兆電子束(6 MeV)分別對(duì)各分組培養(yǎng)瓶進(jìn)行1次放射,將放射后的培養(yǎng)瓶繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d、14 d,以上實(shí)驗(yàn)步驟共進(jìn)行3~4次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

    1.7 原頭蚴RNA的提取

    準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備,按照RNA提取步驟進(jìn)行RNA的提取。

    1.8 逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR及檢測(cè)原頭蚴p38基因表達(dá)

    mRNA的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作;進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),引物序列見(jiàn)表2。

    表2 p38 基因qRT-PCR引物序列信息

    用cDNA作為模板,按照德國(guó)QIAGEN公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,測(cè)定p38 基因的表達(dá),并以β-actin作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為20 μL,見(jiàn)表3。

    表3 p38基因qRT-PCR反應(yīng)體系

    每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),包括 1 次陰性對(duì)照,反應(yīng)條件按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。計(jì)算過(guò)程:選擇每個(gè)孔的Ct值,依照相對(duì)定量公式 2-△△Ct,即△Ct=Ct(p38)-Ct(β-actin),△△Ct=△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△Ct(對(duì)照組),統(tǒng)計(jì)分析選擇單因素方差分析,得出p38基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用Prism 8.0與SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,所有實(shí)驗(yàn)需要包含不得少于3次的重復(fù)實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),蟲(chóng)體死亡率的比較采用χ2檢驗(yàn),qRT-PCR測(cè)得mRNA表達(dá)量的比較采用方差分析和SNK法進(jìn)行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 電子束照射對(duì)原頭蚴的狀態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

    相同劑量電子束照射的蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)在不同天數(shù)(3 d、14 d)時(shí)無(wú)明顯差異,0 Gy組蟲(chóng)體活性基本正常,形態(tài)結(jié)果未見(jiàn)明顯改變;30 Gy照射劑量分組中部分蟲(chóng)體活力減弱,育囊減少,部分囊壁變薄、塌陷;60 Gy照射劑量分組中蟲(chóng)體體積縮小明顯,正常形態(tài)消失,多呈不規(guī)則球形、勾突脫離、頭節(jié)裂解、吸盤(pán)扭曲(見(jiàn)圖1)。

    圖1 光鏡下觀察各組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)

    2.2 電子束照射對(duì)原頭蚴死亡率的影響

    經(jīng)卡方檢驗(yàn)證實(shí)部分分組死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對(duì)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,見(jiàn)表1。

    表1 單純照射組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)死亡率差異情況

    培養(yǎng)3 d、14 d時(shí)0 Gy組30 Gy、60 Gy組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的死亡率有差異(P<0.012 5);30 Gy與60 Gy組的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)死亡率也有差異(P<0.012 5);相同照射劑量下培養(yǎng)3 d與培養(yǎng)14 d時(shí)的死亡率未見(jiàn)差異(P>0.012 5)。

    2.3 電子束照射對(duì)原頭蚴p38 mRNA表達(dá)的影響

    經(jīng)qRT-PCR檢測(cè),在照射組細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中的60 Gy組培養(yǎng)3 d時(shí)p38 mRNA表達(dá)其相對(duì)表達(dá)為:31.05±0.30,60 Gy組培養(yǎng)14 d時(shí)p38 mRNA表達(dá)其相對(duì)表達(dá)為:32.11±0.32,本研究證實(shí)照射組細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中的電子束劑量為60 Gy組的p38mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于0 Gy及30 Gy組的相對(duì)表達(dá)水平(P <0.05),且培養(yǎng)3 d與14 d無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

    圖2 各組細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)經(jīng)照射后qRT-PCR 測(cè)得mRNA 表達(dá)結(jié)果與平均死亡率對(duì)照

    3 討 論

    棘球蚴病是一種全球流行的動(dòng)物源性寄生蟲(chóng)?。?5],寄生于人及某些動(dòng)物等中間宿主中引起囊性棘球蚴病,如果不及時(shí)治療,90%的病例會(huì)在診斷后10~15年內(nèi)死亡[26]。全世界每年估計(jì)有超過(guò)18 000例新病例,其中91%發(fā)生在中國(guó)[27]。棘球蚴病的治療選擇很少,手術(shù)治療主要在感染的早期階段,可進(jìn)行預(yù)防性抗寄生蟲(chóng)藥物治療[28],外科手術(shù)及新型藥物治療都已經(jīng)有了極大的突破[29],但外科手術(shù)后的高復(fù)發(fā)率未得到有效解決,藥物治療中的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生還未明確,因此我們對(duì)于細(xì)粒棘球蚴病的治療還在探尋更多、更新的治療方式。

    本研究顯示,照射組在相同照射劑量下的連續(xù)培養(yǎng)3 d、14 d蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異,0 Gy組蟲(chóng)體形態(tài)飽滿,勾突、頭節(jié)、吸盤(pán)清晰可見(jiàn),大部分有活動(dòng)性且不被藍(lán)染著色;30 Gy照射劑量分組表現(xiàn)為部分蟲(chóng)體正常形態(tài)消失,部分藍(lán)染,活力減弱,育囊減少,部分囊壁變薄、塌陷、曲折斷裂;60 Gy照射劑量分組中鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)染著色細(xì)胞布滿大部分視野,蟲(chóng)體正常形態(tài)消失,體積縮小明顯呈不規(guī)則球形、吸盤(pán)扭曲、頭節(jié)裂解,勾突脫離,棘球蚴囊壁可見(jiàn)毛刺狀破裂、塌陷,觀察60 Gy照射劑量分組中細(xì)粒棘球蚴原頭蚴細(xì)胞質(zhì)散亂,腫脹變粗、擁擠。由此證實(shí)照射劑量為30 Gy、60 Gy的電子束對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭蚴均有殺傷作用,但60 Gy組殺傷作用更加明顯,而照射后培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)并不會(huì)影響蟲(chóng)體死亡率的變化。

    本研究發(fā)現(xiàn),p38基因在受電子束照射的細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中呈不同程度的表達(dá)水平,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)p38基因在60 Gy照射劑量分組中的相對(duì)表達(dá)水平高于0 Gy組及30 Gy組的相對(duì)表達(dá)水平,表明照射劑量的不同可能影響p38基因的表達(dá)變化。p38基因存在于所有真核生物中,其結(jié)構(gòu)和調(diào)控特征從微生物到人類(lèi)都是保守的,與其他MAPK 家族成員不同,p38基因通常不主動(dòng)進(jìn)行有絲分裂,而是被細(xì)胞異常微環(huán)境及炎癥信號(hào)激活,其編碼的蛋白質(zhì)將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核,以響應(yīng)各種外源性和內(nèi)源性刺激[30]。這與細(xì)粒棘球蚴接受電子束照射刺激后引起p38基因不同程度表達(dá)的理論相一致。p38基因信號(hào)通路的傳導(dǎo)引起相關(guān)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié),可以起到抑制放射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[31]。本研究顯示經(jīng)電子束的照射使蟲(chóng)體的死亡率升高、p38基因的表達(dá)增加,但p38基因的放療抑制作用可能不足以完全抵抗電子束對(duì)蟲(chóng)體的殺傷作用,從而使電子束引起蟲(chóng)體的生長(zhǎng)阻滯,從而促進(jìn)了棘球蚴蟲(chóng)體的死亡,并且在60 Gy照射劑量下蟲(chóng)體死亡率最高、p38基因的表達(dá)最高,這也為后期包蟲(chóng)病的放射治療的劑量選擇提供一定的理論參考。

    綜上所述,電子束治療包蟲(chóng)病的研究目前仍處于初級(jí)階段,后期將進(jìn)一步從機(jī)制出發(fā),深入研究電子束致棘球蚴中p38基因信號(hào)通路調(diào)控變化的作用機(jī)制,為包蟲(chóng)病的放射治療提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論支持。

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