中國馬凡綜合征并發(fā)主動脈疾病患者基因型-表型關聯(lián)分析研究

武玉多，張宏家，何怡華

馬凡綜合征（Marfan syndrome，MFS）是由位于15號染色體上的原纖維蛋白-1（FBN-1）基因突變導致的常染色體顯性遺傳性結(jié)蹄組織疾病，是遺傳性大血管疾病中較常見的一類[1]。FBN-1基因突變主要累及患者的眼球，骨骼及心血管系統(tǒng)等，其中心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)是威脅患者生命安全最重要的因素。據(jù)文獻報道，在MFS患者中出現(xiàn)心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的患者可占MFS患者總數(shù)的80%，其中主動脈夾層和動脈瘤是主要死因，約2/3的患者于50歲前死亡[2]。

因此明確MFS患者出現(xiàn)主動脈事件與FBN-1基因突變的相關性很有必要。目前關于MFS患者基因型-表型的關聯(lián)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)BN-1基因突變與患者所出現(xiàn)的多系統(tǒng)表型之間尚無明確的聯(lián)系，也無明確的突變熱點區(qū)域[3,4]。因此通過本研究，聚焦MFS患者主動脈相關的并發(fā)癥與突變基因之間的聯(lián)系，以期改善此類患者的預后，為臨床提供關于MFS伴主動脈并發(fā)癥患者更多有價值的信息。

1 資料和方法

1.1 研究對象本研究納入于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院就診的MFS主動脈疾病患者95例，其中包括70名先證者及其家系中的成員（家系成員先證者篩選處理：由于很多家系成員找到的低頻有害位點相同，為避免這種由于家系關系加重對某一個位點的偏好性并影響結(jié)果，我們僅提取了這些家系中的先證者樣本。由于某些家系沒有先證者，如果家系只有一名成員則選擇這名成員作為先證者，如果多于一人則隨機選擇一位患者作為先證者，最終得到70個樣本組成的集合）。入組的馬凡綜合征患者的診斷是依據(jù)2010年新修訂的Ghent標準[5]，患者的人口統(tǒng)計學和相關的臨床資料，均來自于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院的超聲診斷科與心臟外科的病歷系統(tǒng)及通過電話、微信、門診復查等渠道取得的可靠信息。脫氧核糖核酸（DNA）分析的知情同意書，是在采集入組的馬凡綜合征患者的血液樣本和臨床相關信息時，根據(jù)當?shù)貦C構(gòu)審查委員會的要求從患者本人及其家屬那里獲得的。

1.2 遺傳測序

1.2.1 DNA的提取與測序入組的馬凡綜合征患者均抽取外周血4 ml，從中提取基因組DNA，經(jīng)Covaris破碎儀，將收集的基因組DNA隨機打斷為長度約180～280 bp的片段，經(jīng)末端修復和加A尾后，分別在片段兩端連接上接頭，以此來制備DNA文庫。與生物素標記的探針進行液相雜交的是需要帶有特異索引的文庫池化后，去使用帶鏈霉素的磁珠，將相應基因上的外顯子序列捕獲下來，經(jīng)聚合酶鏈式反應（PCR）擴增后去進行DNA文庫的質(zhì)檢，其中建庫和捕獲實驗是采用的Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒（安捷倫公司，美國加利福尼亞）。對人的全外顯子區(qū)域DNA進行高效富集，利用Illumina Novaseq 6000平臺（Illumina Inc.，美國，加利福尼亞，圣地亞哥）對需要檢測的基因組DNA進行全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing, WES），產(chǎn)生配對末端讀取的大小為150 bp，最小的覆蓋率為10×（約99%的基因組），而平均覆蓋率為100×。

1.2.2 Sanger測序所有入組的馬凡綜合征患者在完成全外顯子組測序之后，隨后對先證者和相關受影響的家系中的成員通過Sanger測序進一步驗證獲得的突變位點。用正向引物（caactcctgtggttgc）和反向引物（acgttgccacaggtcc）進行聚合酶鏈式反應擴增，將獲得的序列與FBN-1參考基因（NM_000138.4）進行比較，以確定突變及準確性。

1.3 變異分類為更好地預測變異位點的致病性，此部分參考了本中心以往的研究分類[6]。美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）的突變分類建議被用于所有報告的突變。值得注意的是，以下兩種錯義變異情況被認為是致病性的有力證據(jù)：“支持對基因或基因產(chǎn)物產(chǎn)生有害影響的成熟的體外或體內(nèi)功能研究”，①一種產(chǎn)生或破壞半胱氨酸殘基的錯義變異；③一種影響EGF樣結(jié)構(gòu)域一致序列（D/N）X（D/N）（E/Q）Xm（D/N）Xn（Y/F）中保守殘基的錯義變異（m和n代表可變數(shù)量的殘基）。分類如下所示：

陽性結(jié)果：與報告中的表型相關的已知疾病基因中的致病性或可能致病的突變?？赡艿脑\斷：已知疾病基因中可能與所報告表型有關的變異。此類別包括新發(fā)突變，包括與患者提供的表型重疊的疾病基因中的錯義突變或符合讀框的插入/缺失，以及已知與解釋疾病的基因中的致病性/可能致病性變異反式表達的單個罕見或高度可疑的意義不確定的突變（VUS）報告的表型。候選基因：預計在先前未參與馬凡綜合征的基因中被預測為有害的，或已發(fā)表的支持關聯(lián)的數(shù)據(jù)可能尚不確定的突變被視為潛在的新候選基因。支持數(shù)據(jù)基于模型生物數(shù)據(jù)，拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)，基因?qū)π蛄凶儺惖哪褪苄?，有關組織的表達或發(fā)育時間的數(shù)據(jù)或基因功能和途徑分析的知識。不確定的結(jié)果：已知疾病基因中的高度可疑的意義不確定的突變和患者表型與報告的疾病譜一致（由于缺乏評估新出現(xiàn)和確定突變階段的親本樣本，不確定性僅限于突變的致病性在隱性疾病中）。該類別還包括與為胎兒提供的表型重疊的隱性疾病，其中僅鑒定出單個致病/可能致病的突變。

陰性結(jié)果：未發(fā)現(xiàn)與報道的表型有關的基因變異。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料和計量資料分別采用平均值±標準差（SD）和頻率或百分比的形式來表示。計量資料之間的比較采用Student's t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料本研究共入組有主動脈事件的MFS患者95例，其中男性52例，女性43例，發(fā)病年齡平均為（24.26±14.49）歲。本組中主動脈增寬患者43例，主動脈瘤25例，主動脈夾層27例（A型主動脈夾層21例，B型主動脈夾層4例，A+B型主動脈夾層2例），表1。

表1 患者的一般資料

2.2 遺傳學檢測結(jié)果基因檢測結(jié)果（表2）提示，本組患者中，出現(xiàn)錯義突變的MFS并發(fā)主動脈疾病患者最多，共53例（55.8%）；還發(fā)現(xiàn)了3例內(nèi)含子突變（位于與外顯子位置相近的檢測部位）的MFS患者，其中2例為母女，3例患者為主動脈夾層1例，母女二人均出現(xiàn)主動脈瘤樣病變；WES檢測位于第二位的是移碼突變。

表2 本組患者WES檢測結(jié)果

2.3 基因型-主動脈表型關聯(lián)分析本組患者中出現(xiàn)FBN-1錯義突變的MFS患者在每一種主動脈并發(fā)癥組均占比最高；尤其是在主動脈增寬組（58.1%）；在與外顯子測序相近的內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了突變，經(jīng)驗證后證明是導致患者出現(xiàn)MFS的致病位點（表3）。

表3 不同主動脈表型患者基因突變類型匯總

2.4 不同主動脈表型在FBN-1基因上的分布結(jié)果我們繪制了圖1所示的相關主動脈表型所對應的FBN-1基因位點的分布圖。該圖根據(jù)發(fā)生該變異的樣本是否有主動脈表型進行了劃分，圖中標記為黑色圓圈的位點為發(fā)生該位點變異的樣本均沒有主動脈表型，紅色圓圈為發(fā)生該位點變異的樣本均存在主動脈表型，而綠色圓圈標記的位點說明部分樣本中存在主動脈表型。但從圖中并不能看出是否有主動脈表型的樣本攜帶的FNB-1位點在基因結(jié)構(gòu)上有明顯的富集現(xiàn)象。

圖1 馬凡綜合征患者主動脈表型-FBN-1基因?qū)蛔兾稽c分布圖

同時，我們針對馬凡綜合征患者的一些其他表型進行了分類和探索，發(fā)現(xiàn)不同表型在新的候選基因范圍內(nèi)的變異數(shù)量上并不存在顯著的差異，提示馬凡綜合征患者表型上的差異可能另有其他影響因素。此外，馬凡綜合征患者的基于基因的共有結(jié)果中，有多個基因，如TTN，NEFH，PLEC，CASQ2，SYNE1等都與心肌病或心血管疾病相關，而馬凡綜合征患者常伴有心血管系統(tǒng)的問題，提示此類患者似乎普遍攜帶有心肌病相關的基因上的低頻有害位點，為后續(xù)開展相關的分析提供了可能。

3 討論

MFS是一種常染色體顯性遺傳性結(jié)締組織病，根據(jù)美國CDC的數(shù)據(jù)，患病率約為0.2‰，影響全球超過140萬人[7]；國內(nèi)患病人數(shù)約30～40萬，患者可能會出現(xiàn)眼（晶狀體移位等）、骨骼（肢體細長，脊柱、胸骨畸形等）、皮膚和肺的異常，另外80%的馬凡患者會出現(xiàn)心血管系統(tǒng)病變，其中主動脈瘤和夾層是主要致死原因，2/3患者50歲以前可因救治不及時或突發(fā)心血管系統(tǒng)疾病而死亡[2,8]。因此及時明確診斷，同時控制心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生，可很好地改善患者預后，提高生存壽命。

本研究中共入組95例有主動脈事件的MFS患者，以主動脈增寬患者最多，夾層患者以主動脈A型夾層多見。雖然目前已發(fā)現(xiàn)的MFS相關FBN1突變超過2000種，但位點和表型間無明顯聯(lián)系，在本研究中也得到驗證[1,9]。盡管馬凡綜合征患者的外周結(jié)締組織經(jīng)常受累，但主動脈相關并發(fā)癥的出現(xiàn)仍是導致患者死亡的主要的危險因素。先前的研究表明，具有嚴重表型的馬凡綜合征患者易在外顯子24-32區(qū)域的FBN-1基因中發(fā)生突變（目前文獻報道的除了在新生兒期的馬凡綜合征基因突變與相關的臨床表型具有明確關聯(lián)，在其他階段的患者中尚無明確關聯(lián)）[10]。本中心早期研究表明，患有FBN-1移碼突變和無義突變的馬凡綜合征患者易發(fā)生主動脈夾層，而出現(xiàn)錯義突變的馬凡綜合征患者則易于發(fā)生主動脈瘤[6]。

多因素（遺傳因素與環(huán)境因素共同）作用導致馬凡綜合征患者的臨床異質(zhì)性較明顯，如外部表現(xiàn)、發(fā)病年齡、疾病嚴重程度等[11]。目前已知的可導致馬凡綜合征患者發(fā)生主動脈夾層的非遺傳學因素為高血壓，但其他導致心血管疾病的危險因素如：吸煙、飲酒、糖尿病、冠心病等危險因子，是否也會對馬凡綜合征患者的出現(xiàn)主動脈夾層產(chǎn)生影響，之前研究并未明確報道[12]。以往研究影響馬凡綜合征患者預后因素的統(tǒng)計建模方法，通?；诟饕蛩叵嗷オ毩⒌那疤?，建立邏輯回歸模型，根據(jù)統(tǒng)計分析得出的比值比（OR）反映各危險因子與馬凡綜合征患者預后之間的相關性。馬凡氏綜合征累及眼，可導致失明；侵犯骨骼，患者走路雙腿外撇，呈現(xiàn)出“鴨步”的特點，可出現(xiàn)“雞胸”或“漏斗胸”，但不會危及生命[11]。馬凡氏綜合征還會累及心臟，導致患者出現(xiàn)主動脈瘤、主動脈夾層或瓣膜關閉不全等，可能危及生命[10]。馬凡綜合征患者的預后不是單一因素決定的，在目前的研究基礎上，多因素協(xié)同作用的效應難以被考慮和準確估計，還需進一步的研究與探索。

本研究中，我中心僅研究了馬凡綜合征患者DNA的外顯子區(qū)域，但相關研究報道顯示馬凡綜合征患者也可能是FBN-1基因內(nèi)含子區(qū)域的突變引起的，這些突變可能影響患者的預后和臨床表型[13]。努力獲取更大量的樣本和多中心的數(shù)據(jù)，以分析馬凡綜合征患者內(nèi)含子區(qū)域突變的基因信息，完善患者的遺傳信息譜。另有研究指出，TGFBR1、TGFBR2基因也是馬凡綜合征患者的致病基因，研究表明FBN-I突變使轉(zhuǎn)化生長因子-β的活性和信號轉(zhuǎn)導失調(diào)，導致纖維蛋白原-1的合成質(zhì)量下降，數(shù)量減少，干擾原纖維的組裝，引起結(jié)締組織的伸展過度，致使攜帶者出現(xiàn)相應的臨床表型[14-16]，此部分內(nèi)容也需要我們進一步研究，在前期工作中，已檢測出了相關基因。雖然本研究中未進一步深入分析，后續(xù)將會對此部分內(nèi)容進行深入研究。

近年來由于散發(fā)的馬凡綜合征患者病例的高發(fā)生率，長期以來人們懷疑其患者中可能存在嵌合體突變的現(xiàn)象[17]。散發(fā)病例的新生突變主要來自于兩種情況：一是發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中，二是由于父母為生殖細胞嵌合體所致。生殖細胞嵌合體是指當突變只發(fā)生在胚胎發(fā)育早期的生殖細胞形成過程中，攜帶突變的細胞系只占生殖細胞的一部分，機體其他組織細胞不攜帶該突變，因此在對外周血提取的基因組中可能不攜帶該突變或該突變攜帶的細胞比例太少而檢測不到[18]。若突變發(fā)生在胚胎發(fā)育早期，將導致個體體細胞和生殖細胞均處于嵌合狀態(tài)，這種類型的嵌合體外周血便可檢測到嵌合突變[18]。依據(jù)突變發(fā)生的時期與組織分布，嵌合體分為三種類型：體細胞嵌合（僅發(fā)生于體細胞，不含生殖細胞），生殖腺嵌合（僅發(fā)生在生殖細胞，不含體細胞）以及體細胞和生殖腺均嵌合[18]。后兩種類型的嵌合體親代可將突變遺傳給子代[19-21]，所以早期識別和明確親代嵌合體對家庭遺傳咨詢非常重要。

目前隨著遺傳學的發(fā)展，對于大多數(shù)馬凡綜合征患者，通過譜系分析，致病基因直接測序，高通量測序技術全外顯子測序、全基因組測序等的研究方法可在遺傳學方面深入研究，根據(jù)各個患者家系遺傳學特點制定個體化的遺傳學研究方法，可達到既快捷又經(jīng)濟的篩選患者致病基因的目的[4]。國際上針對馬凡綜合征患者的基因檢測已十分成熟穩(wěn)定，并廣泛應用于臨床檢測。

本研究通過對中國人群MFS合并主動脈表型患者的全外顯子組測序，進一步驗證了FBN-1基因?qū)FS患者的致病性作用；同時認為FBN-1基因突變是導致MFS患者出現(xiàn)主動脈相關并發(fā)癥的主要因素；可為臨床更好地評判MFS患者的預后和預防主動脈不良事件的發(fā)生提供重要依據(jù)，突顯出FBN-1基因全外顯子序列分析在MFS診斷中的重要性和必要性。