基于PPI分析新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）受體ACE2在高血壓靶點中的網絡關聯(lián)影響

吳佳蕓，李玲玲，朱春臨，姚睿祺，黃力

高血壓是引發(fā)新型冠狀病毒肺炎感染患者危重癥與死亡的重要基礎疾病與危險因素，尋找二者間緊密聯(lián)系作用靶點有利于剖析和發(fā)現(xiàn)阻斷兩病進程，阻止不可逆醫(yī)學結局的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）受體ACE2不僅是新型冠狀病毒入侵機體的重要門戶[1]，更是影響高血壓發(fā)生發(fā)展的關鍵影響因子[2,3]。然而其在高血壓靶點網絡中的關聯(lián)影響及作用方式目前仍有待深入闡明，ACEI等降壓藥物在高血壓合并新型冠狀病毒感染的患者中的應用亦有待驗證。本研究擬從PPI網絡分析的角度入手，探究新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）受體ACE2在高血壓靶點中的網路關聯(lián)作用，以期找出關鍵靶點與蛋白模塊，為新型冠狀病毒感染合并高血壓患者的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 確定高血壓相關疾病靶點通過以“hypertension”作為關鍵詞檢索以下四大數(shù)據庫：Genecards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）、DisGeNET（https://www.disgenet.org）和TTD（http://db.idrblab.net/ttd/） ，獲取與高血壓相關的疾病靶點。值得注意的是，在應用DisGeNET和Genecards數(shù)據庫尋找靶點時，由于所獲靶點眾多且部分關聯(lián)分數(shù)極低，提示其與高血壓的關聯(lián)不大，故進一步采用靶點關聯(lián)分數(shù)＞關聯(lián)分數(shù)整體中位數(shù)的標準對靶點進行二次篩選，最終僅保留與高血壓相關性較高的靶點。結果顯示，SARSCoV-2受體ACE2蛋白本身就是高血壓相關的作用靶點之一。

1.2 遴選與ACE2最為直接相關的關鍵靶點將上述ACE2和其他所獲取的靶點通過Uniprot KB數(shù)據庫進行統(tǒng)一規(guī)范化命名，確定gene symbol。將其一并導入String在線平臺（http://www.string-db.org/），獲取蛋白-蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，物種設置為人類，導出TSV文件。通過Cytoscape3.8.0軟件分析網絡拓撲參數(shù)，結合度值、中心介度、緊密度等指標找出與ACE2最為密切相關的靶點。

1.3 構建靶點互作網絡與核心蛋白模塊功能分析將與ACE2及與其聯(lián)系最為密切的33個靶點再次輸入至String數(shù)據庫，得到新的PPI網絡。通過String自帶的聚類功能提取該網絡中的核心蛋白功能模塊，選擇K-means算法進行網絡聚類分析。

1.4 生物學功能及通路富集分析通過Metascape平臺（https://metascape.org/）對ACE2及與其緊密相關的三大核心蛋白模塊所涉及的靶點進行生物學功能GO及KEGG富集分析，初步確定這些靶點參與發(fā)揮作用的生物學過程（biological process，BP）、細胞結構（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及主要集聚的細胞傳導信號通路。

1.5 評估ACE2在互作網絡中的關聯(lián)影響將ACE2所在模塊作為內網絡，篩選出除去ACE2所在模塊外的其他模塊間的彼此關聯(lián)作用（即跨模塊關聯(lián)），以便于更好評估ACE2所在模塊在互作網絡中對其他模塊的作用，應用SPSS20.0進行統(tǒng)計并作圖。根據均值和中位數(shù)確定，最終以0.7作為篩選標準進一步分選數(shù)據，保留符合標準的內容（包括跨模塊關聯(lián)蛋白及關聯(lián)分數(shù)），對二者分別求和計算得到各自總評分。

2 結果

2.1 ACE2直接相關的核心靶點在OMIM和TTD數(shù)據庫中，我們分別檢索到66和107個高血壓相關靶點；在Genecards數(shù)據庫，最初得到了8435個靶點，通過關聯(lián)分數(shù)中位數(shù)篩選（＞11.96），最終得到555個相關靶點；而在DisGeNET數(shù)據庫中共找到445個高血壓靶點，后同樣根據關聯(lián)分數(shù)中位數(shù)篩選（＞0.07）得到34個靶點。合并4個數(shù)據庫合計共762個靶點，刪除重復值，最終共得到675個高血壓相關靶點（圖1）。將ACE2和所得靶點一并導入String，分析顯示共計得到586個節(jié)點，14 198條連線，平均節(jié)點degree值為48.5，平均局部聚類系數(shù)為0.493。其中，與ACE2直接相關的靶點共33個。將上述結果導出為TSV格式后導入Cytoscape 3.8.0軟件，發(fā)現(xiàn)上述33個與ACE2直接關聯(lián)的靶點間共形成267條連線，利用network analyzer工具進行分析，得到各靶點的網絡拓撲學參數(shù)數(shù)據，表1。

表1 ACE2直接相關靶點

圖1 高血壓相關靶點分布情況

2.2 PPI網絡將33個ACE2直接相關蛋白以及ACE2一并導入String數(shù)據庫，得到蛋白與蛋白之間的互相作用關系網絡（圖2），共得到34個節(jié)點，267條連線，平均節(jié)點degree值為15.7，平均局部聚類系數(shù)為0.755。預期連線為39條，遠低于實際形成連線數(shù)目，說明各靶點蛋白之間的相互作用比從基因組種隨機抽取一組相似蛋白質之間的相互作用要多，聯(lián)系交織較為緊密，這些蛋白整體在生物學功能上存在部分相連。

圖2 PPI網絡

2.3 主要蛋白模塊功能分析通過K-means聚類分析的方法對PPI網絡主要蛋白模塊功能進行分析，最后得到紅、藍、綠3種不同顏色節(jié)點構成的三大主要蛋白模塊。其中，模塊1（紅色）由AGTR2、ALB、APLNR、APOE、CRP、ECE1、EDN1、IL6、KNG1、NOS3、NTS、PRCP共12個節(jié)點組成；模塊2（藍色）由AGT、AGTR1、APLN、ATP6AP2、CYBB、CYP11B2、HIF1A、INS、NOX4、NR3C2、REN共11個節(jié)點構成；模塊3（綠色）則由包括ACE2、ACHE、CAT、CMA1、DPP4、ENPEP、ERAP1、GHRL、IRS1、LNPEP、MME在內的11個節(jié)點構成（圖3）。

圖3 ACE2直接相關蛋白功能模塊

2.4 GO分析及KEGG通路富集結果將上述與ACE2蛋白關聯(lián)緊密的三大模塊涉及的靶點輸入到Metascape數(shù)據庫，物種設置為Homo sapiens，Min overlap設為3，p值截點設為0.01，Min Enrichment為1.5。結果發(fā)現(xiàn)，模塊1主要涉及的生物學功能是管徑調節(jié)，分子功能是受體調節(jié)子活性，細胞組分為內質網腔，主要富集的通路是神經活性配體受體相互作用；模塊2主要涉及的生物學功能是激素水平調節(jié)，分子功能是外肽酶活性，細胞組分為脂筏，主要集中的通路是腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通路；而模塊3主要涉及的生物學功能是內分泌過程，分子功能是激素活性，細胞組分是頂端細胞，主要涉及的通路是腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號轉導途徑，表2。

表2 各模塊GO及KEGG分析結果

2.5 模塊3的跨模塊關聯(lián)分析對ACE2所在的模塊3進行跨模塊關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，其一共存在184條跨模塊關聯(lián)，占據整體267條網絡關聯(lián)的68.9%，平均關聯(lián)分數(shù)為0.709，中位數(shù)為0.704，如圖4和表3；為進一步凸顯跨模塊關聯(lián)網絡中的關鍵蛋白節(jié)點，利用Cytoscape軟件依照Degree值對涉及跨模塊關聯(lián)網絡的各靶點進行排序，其中顏色透明度及節(jié)點的大小代表了靶點的重要性。由圖5可知，AGT、AGTR1、ALB、INS、EDN1等是與ACE2所在的模塊3形成的跨模塊關聯(lián)網絡中占據主導作用的靶點，推測它們可能在跨模塊關聯(lián)網絡中起到主要影響。

表3 ACE2所在模塊3跨膜關聯(lián)蛋白及關聯(lián)分數(shù)

圖4 模塊3跨模塊關聯(lián)分析統(tǒng)計描述

圖5 跨模塊關聯(lián)網絡中主要重要節(jié)點（Degree值排序）

2.6 模塊3對整體網絡的影響經對ACE2所在模塊和模塊3跨關聯(lián)蛋白評分我們發(fā)現(xiàn)，ACE2所在的模塊3中ACE2、CAT、DPP4、ACHE、CMA1所獲得的評分最高；而在跨模塊關聯(lián)分析中則以AGT、AGTR1、EDN1、ALB以及AGTR2評分最高，表4。

表4 ACE2所在模塊3及跨模塊蛋白評分

3 討論

綜上，我們發(fā)現(xiàn)與ACE2直接相關的33個靶點中，AGT、REN、MME、DPP4、PRCP以及AGTR1的關聯(lián)分數(shù)排名靠前，且分值均高于0.9，說明上述6個蛋白與ACE2的關系最為緊密；其中AGT、REN二者degree值均為27，位列第一，degree值越高，提示其重要性越強，說明AGT、REN相較于其他4個蛋白而言，對于ACE2的影響作用地位更高、程度更深。AGT、REN、AGTR1三者均是RAS系統(tǒng)的重要組成部分。REN可將肝臟的AGT水解生成血管緊張素Ⅰ（AngⅠ），AngⅠ在肺血管緊張素轉換酶（ACE）的作用下變成血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），后者可與AGTR1結合，促進縮血管、炎癥及水鈉潴留，升高血壓[1]；ACE2、PRCP則主要起到降解AngⅡ、生成與之拮抗的Ang1-7的作用，PRCP缺如可引起獨立于全身與局部AngⅡ和Ang1-7因素之外的血壓升高與左室重構[2,3]；而Ang1-7既可以通過結合血管內皮細胞表面的Mas受體激活促進NO介導的血管舒張、減輕氧化應激[4]，同時還能非競爭式結合的方式抑制AGTR1的活性[5]。此外，MME是一種中性內肽酶，其抑制可增加利鈉肽、緩激肽和P物質的生物利用度，產生利鈉、血管擴張和抗增殖的作用[6]；研究顯示，增加MME活性可能有助于限制RAS中AngⅡ的血管收縮作用[7]。接著通過聚類分析，我們提取得到了3個不同功能但互相關聯(lián)的核心蛋白模塊，模塊1主要涉及血管管徑和神經活性配體受體相互作用的調節(jié)；模塊2主要參與激素水平和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的調控；而ACE2所在的模塊3則主要與內分泌和RAS調節(jié)有關。SARS-CoV-2是導致新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）感染的直接病原體；ACE2則是SARS-CoV-2其進入人體的重要門戶，同時也是參與血管舒縮和高血壓形成的關鍵調節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的侵襲可以導致肺組織中ACE2蛋白出現(xiàn)大規(guī)模降解與表達降低，繼而激活RAS系統(tǒng)，引發(fā)細胞因子風暴，促進高血壓形成或加重高血壓進展[8,9]；而常用降壓藥物ACEI和ARB的應用可增加心、腎組織ACE2的表達[10-12]，使SARS-CoV-2更易于進入機體，進而增加感染機會。因此，將SARS-CoV-2受體ACE2作為核心節(jié)點探究其在高血壓靶點關聯(lián)網絡中的地位和影響，有助于尋找和發(fā)現(xiàn)與單純COVID-19出現(xiàn)潛在血壓升高或COVID-19合并高血壓緊密聯(lián)系的核心靶點，同時為ACEI和ARB在上述患者人群中的應用提供部分理論參考和依據。

本研究中選擇使用關聯(lián)分數(shù)的均值與中位數(shù)聯(lián)合剔選的方法對ACE2跨模塊關聯(lián)蛋白進行了篩選，并采用關聯(lián)分數(shù)之和作為評價和判斷蛋白重要性與影響力的標準，分數(shù)越高，關聯(lián)越密切，對網絡影響度越大。結果發(fā)現(xiàn)，ACE2所在的模塊3中，除ACE2評分高達9.324外，CAT、DPP4、ACHE、CMA1評分較高且均分值均大于1，提示它們對其他蛋白模塊的影響更大。首先，ACE2本身的多態(tài)性與高血壓及SARS-CoV的易感性和產生的后果密切有關[13]；其次，CAT啟動子區(qū)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關系密切[14]，且過表達CAT能夠有效阻止Akita小鼠模型高血壓、腎間質纖維化并促進ACE2的表達正?；痆15]；而CAT缺乏使得對機體有害的過氧化氫水平升高，致使COVID-19患者固有免疫受到抑制出現(xiàn)細菌-病毒協(xié)同感染及肺損傷加重[16]。DPP4是一種絲氨酸蛋白酶，其可溶形式sDPP4對血管直接有毒害作用，可促進血管平滑肌增殖與炎癥反應以及內皮功能紊亂[17,18]；而DPP4/CD26可能與SARS-CoV-2的S1刺突蛋白結構域發(fā)生相互作用的繼ACE2外有利于病毒入侵的另一重要門戶，其抑制劑可能起到抵抗SARS-CoV-2的作用[19,20]。ACHE是參與乙酰膽堿（Ach）水解的限速酶，后者既參與介導內皮細胞釋放NO引起血管舒張，同時也是參與外周交感信號調節(jié)的重要的興奮性神經遞質，并且膽堿能激動可能阻止SARS-CoV-2誘導的糖蛋白與ACh受體結合，減輕COVID-19臨床癥狀和表現(xiàn)[21-23]。CMA1則是組織中非ACE轉換生成AngⅡ的來源，在心臟和血管中高表達，參與血壓升高并能激活轉化生長因子β（TGF-β）參與組織炎癥及纖維化過程；并且CMA1抑制劑的使用可能是代替RAS抑制劑而起到緩解COVID-19中AngⅡ和TGF-β不良反應的有效策略[24]。上述蛋白均與COVID-19和高血壓同時關聯(lián)，多數(shù)還與ACE2存在互相影響，提示對于這些節(jié)點的有效調控可能同時阻止SARS-CoV-2的侵襲和危害與血壓升高。

而在跨模塊關聯(lián)分析中則以AGT、AGTR1、EDN1、ALB與AGTR2占據較高評分，提示模塊3可能是通過上述關聯(lián)蛋白進行對其他模塊進行作用、彼此發(fā)生交互影響。AGT、AGTR1、EDN1、ALB與AGTR2可能是ACE2所在的模塊3與其他模塊產生作用的重要聯(lián)絡點。其中，EDN1在COVID-19患者體內隨時間延長而水平升高[25]，其在循環(huán)中的表達水平是反映高危COVID-19患者嚴重程度的潛在標志物[26]；EDN1還是強大的具有調節(jié)血壓功能的血管收縮肽，不僅與各種高血壓動物模型血壓升高緊密相關[27]，更對RAS有多方面作用，如劑量性依賴地抑制REN合成、提高AGT表達[28]和下調ACE2[29]等。值得注意的是，AGT和AGTR1二者評分＞10，體現(xiàn)它們可能是模塊3與模塊1和2發(fā)生生物學聯(lián)系和作用的關鍵效應點，在介導SARS-CoV-2受體ACE2與高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要意義，同時也是連結COVID-19與高血壓的關鍵分子信號橋梁。研究顯示，SARS-CoV-2與SARS-CoV具有80%以上相似性。SARS-CoV感染時，肺中的ACE/AngⅡ/AT1R系統(tǒng)優(yōu)勢逐步轉向ACE2/Ang1-7/mas受體系統(tǒng)優(yōu)勢，致使非競爭性AngⅡ積累、活化ATGR1而導致急性肺損傷。SARS-CoV-2也有類似作用，其通過刺突蛋白與ACE2結合實現(xiàn)與宿主細胞膜融合并進行胞內復制，致使ACE2表達下降、更多AGT被水解生成AngⅡ并激活ATGR1，引發(fā)肺損害[10]；而ACE2敲除的實驗小鼠其COVID-19發(fā)病率則大大降低[30]。此外，包括奧美沙坦、替米沙坦、氯沙坦以及賴諾普利在內的ACEI、ARB類降壓藥的使用被證實會增加高血壓心肌肥厚、心肌梗死等動物模型以及正常大鼠心肌和腎臟血管中ACE2 mRNA或蛋白表達水平[31-34]，但ARB和ACEIs對動物模型或人類肺ACE2表達的影響尚無數(shù)據[10]，即使在動物模型中，ACE2水平的變化（如ARB誘導的上調）是否確實促進SARS-CoV和SARSCoV-2及其他病毒的侵襲仍有待系統(tǒng)驗證。綜上可知，SARS-CoV-2受體ACE2在高血壓靶點中的網絡關聯(lián)影響重大，占據核心地位，其可通過作用于CAT、DPP4、ACHE、CMA1、EDN1等影響COVID-19和高血壓進程。但其是否真正有利于SARS-CoV-2入侵，合并高血壓的COVID-19人群使用ACEI和ARB又會否加重COVID-19病情尚需更多的大型臨床試驗加以驗證。

本研究基于PPI網絡濾選得到了與SARSCoV-2受體ACE2關系密切的高血壓靶點及主要涉及功能模塊，并探究了ACE2所在模塊對整體蛋白網絡的地位與影響，提出RAS失衡是引起單純COVID-19患者發(fā)生血壓升高或COVID-19合并高血壓出現(xiàn)高致死率的關鍵所在，其通過與ACE2、CAT、ACHE、CMA1、EDN1等蛋白發(fā)生交互作用，參與加劇血管炎癥與內皮損傷，升高血壓，同時與COVID-19發(fā)病息息相關。但ACE2上調是否有助于COVID-19發(fā)病以及RAS抑制劑如ACEI、ARB類在合并高血壓的COVID-19患者中是否適用或禁忌仍有待深入實驗研究和闡明。