秈稻材料570011抗褐飛虱基因的遺傳分析及鑒定

程玲 黃福鋼 邱一埔 王心怡 舒宛 邱永福 李發(fā)活,*

秈稻材料570011抗褐飛虱基因的遺傳分析及鑒定

程玲1, 2黃福鋼3邱一埔3王心怡3舒宛2邱永福3李發(fā)活3,*

(1糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430064;2長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 湖北 荊州 434025;3廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530004;*通信聯(lián)系人, email: 316801153@qq.com)

【目的】發(fā)掘秈稻570011中抗褐飛虱主效基因，為培育抗蟲水稻新品種提供基因資源?！痉椒ā坎捎妹缙诩瘓F(tuán)法對(duì)抗性親本570011和感蟲親本9311雜交后代F3群體進(jìn)行表型鑒定，結(jié)合F2群體基因型，使用作圖軟件構(gòu)建染色體的局部遺傳連鎖圖，對(duì)目標(biāo)區(qū)段抗性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和遺傳效應(yīng)評(píng)估。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析定位區(qū)間內(nèi)最可能的候選基因，并對(duì)其基因組序列進(jìn)行測(cè)序，比較對(duì)應(yīng)CDS和氨基酸序列并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析?！窘Y(jié)果】秈稻570011在苗期對(duì)褐飛虱表現(xiàn)高抗，且對(duì)褐飛虱有明顯的抗生性和趨避性。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)F3群體抗蟲株系數(shù)（抗性值＜7）∶感蟲株系數(shù)（抗性值≥7）為89∶35，卡方檢驗(yàn)表明符合一對(duì)顯性基因的分離規(guī)律。基因定位發(fā)現(xiàn)在第4染色體標(biāo)記4M18.675和4M24.64之間的39 cM區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到一個(gè)褐飛虱抗性位點(diǎn)，可能是已克隆基因的等位基因。qRT-PCR分析表明570011中（等位基因）在褐飛虱取食后表達(dá)量顯著高于感蟲材料9311。570011中基因與的CDS和氨基酸序列同源性分別達(dá)到99.08%和97.96%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)兩者的親緣關(guān)系最近，表明該抗性基因是的等位基因。【結(jié)論】秈稻材料570011是一份高抗褐飛虱種質(zhì)，其抗性表型受一個(gè)主效基因控制。該基因的發(fā)掘豐富了的等位型和抗源來源，為抗蟲水稻育種提供新抗源。

水稻；褐飛虱；；等位基因；生理抗性機(jī)制

褐飛虱()是亞洲稻區(qū)主要暴發(fā)性、毀滅性的害蟲，其若蟲和成蟲棲息在水稻基部莖叢處，通過刺吸稻莖韌皮部細(xì)胞汁液致使植株萎蔫、莖叢腐爛，并會(huì)傳播水稻病害加速水稻死亡，導(dǎo)致水稻減產(chǎn)甚至絕收[1]。近年來，隨著我國南方水稻種植結(jié)構(gòu)、種植水平和耕作制度的改變，褐飛虱對(duì)水稻的危害日趨嚴(yán)重[2]。褐飛虱屬于典型的-對(duì)策型害蟲，具有極高的內(nèi)稟增長(zhǎng)率，人類越是精耕細(xì)作，其生殖和擴(kuò)散能力就越強(qiáng)，而且具有長(zhǎng)距離遷飛習(xí)性，易造成水稻大面積受災(zāi)。長(zhǎng)期以來，化學(xué)防治一直是控制褐飛虱的重要途徑，然而選育和推廣抗褐飛虱水稻品種是防治褐飛虱大面積暴發(fā)和減藥栽培的最佳途徑。因此，持續(xù)發(fā)掘新抗源和新抗性基因，通過多基因聚合培育持久型抗褐飛虱品種，避免褐飛虱致害性變異引起的單一抗性基因失效帶來的損失是防治褐飛虱的重要工作。

20世紀(jì)60年代起，研究人員利用不同水稻材料已定位了38個(gè)抗褐飛虱主效基因，其中源于野生稻的褐飛虱抗性基因有20個(gè)，源于栽培稻有18個(gè)[3]。但因供體親本和標(biāo)記方法的不同存在命名混亂的現(xiàn)象，如同一基因兩種命名或不同基因雷同命名[4]。在水稻12條染色體中，第4染色體攜帶15個(gè)抗褐飛虱主效基因，是目前報(bào)道的定位基因數(shù)量最多的染色體。自通過圖位克隆法獲得第一個(gè)抗褐飛虱基因以來，目前已報(bào)道克隆的抗BPH基因有12個(gè)，大致可以分為四類。第一類基因?yàn)榫幋a水稻第一層免疫系統(tǒng)的質(zhì)膜蛋白模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），通過被激活并響應(yīng)保守的食草動(dòng)物相關(guān)分子模式（herbivore associated molecular pattern，HAMP）[5]，包括[6]和[7]。第二類基因?yàn)榫幋a細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合域和富含亮氨酸重復(fù)（Nucleotide-binding domain and Leucine-rich Repeat，NLR）的蛋白，通過感知褐飛虱傳遞給水稻細(xì)胞的效應(yīng)因子并觸發(fā)相應(yīng)的防御反應(yīng)[5]。此類基因又可以分為四個(gè)小類：一是編碼僅含CC-NB結(jié)構(gòu)域類型的蛋白，如第6染色體上的[8]；二是編碼包含CC-NB-LRR結(jié)構(gòu)域類型的蛋白，如第3染色體上的[9]、第4染色體上的[10]；三是編碼包含CC-NB-NB-LRR結(jié)構(gòu)域類型的蛋白，如第12染色體上的[11]，[12]和[13]；四是編碼僅含LRR結(jié)構(gòu)域類型的蛋白，包括第4染色體上的和[14]；第三類為編碼一個(gè)包含B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，例如[15]；第四類為編碼包含簡(jiǎn)短共有重復(fù)序列（short consensus repeat，SCR）結(jié)構(gòu)域蛋白，如第6染色體上的[16]。褐飛虱與水稻長(zhǎng)期協(xié)調(diào)進(jìn)化過程中，由于其致害性的變異，部分抗性基因已失效，最典型的就是和[17, 18]，所以需要不斷發(fā)掘新的抗褐飛虱基因并將其應(yīng)用于聚合育種，提高其對(duì)褐飛虱抗性的持久性與廣譜性。

水稻對(duì)褐飛虱的抗性水平可以通過苗期集團(tuán)法、成株期鑒定等方法和褐飛虱的宿主選擇、蟲體增重、蜜露分泌量等指標(biāo)來衡量。其中，宿主選擇性是根據(jù)抗蟲水稻植株具有驅(qū)趕或抑制褐飛虱取食的能力，使褐飛虱群體遷飛到更適宜生存的地點(diǎn)或植株上繼續(xù)生長(zhǎng)。蟲體增重法、蜜露分泌量測(cè)定則是根據(jù)褐飛虱在水稻植株上的反應(yīng)表現(xiàn)值（如蜜露分泌量、蟲體增重量），來評(píng)價(jià)水稻植株的抗性水平。秈稻材料570011對(duì)褐飛虱表現(xiàn)高抗，其抗性基因尚不清楚。為此將之與感蟲材料9311雜交構(gòu)建遺傳定位群體，利用苗期集團(tuán)法測(cè)定抗蟲表型及分子標(biāo)記確定基因型，對(duì)褐飛虱抗性基因掃描定位，以期發(fā)掘新的抗褐飛虱基因；同時(shí)，利用qRT-PCR和測(cè)序方法對(duì)候選基因進(jìn)行分析，確定候選基因，為水稻抗褐飛虱育種中分子標(biāo)記輔助選擇、品種的聚合培育提供新抗源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秈稻材料570011來源于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，作為抗蟲親本；秈稻品系9311作為感蟲親本。水稻種子在37℃下催芽，然后轉(zhuǎn)移到塑料盆或塑料桶生長(zhǎng)，自然光照，平均溫度26℃～32℃，相對(duì)濕度75%。

以感蟲材料9311為母本，抗蟲材料570011為父本，雜交得F1代，再種植124個(gè)單株的F2分離群體，單株自交收種得到對(duì)應(yīng)的F3株系。

1.2 實(shí)驗(yàn)用蟲及苗期抗蟲鑒定

采集廣西南寧市水稻大田的褐飛虱自然種群，于溫室種植的感蟲品系9311上繁殖。

參照Qiu等的方法[19]，利用苗期集團(tuán)法進(jìn)行群體抗性測(cè)定，具體方法如下：塑料托盤（58 cm×38 cm×9 cm）盛5 cm厚稻田土，縱向均分兩份，每份平均分成15個(gè)小區(qū)。每小區(qū)內(nèi)等株距播種已發(fā)芽種子20粒，每個(gè)株系隨機(jī)排列，其中抗感親本各隨機(jī)播種1個(gè)小區(qū)，每個(gè)株系播種3個(gè)重復(fù)，共36個(gè)小區(qū)。待植株長(zhǎng)到2葉期（約7 d）搬出室外煉苗；3葉期（約12 d）時(shí)剔除弱、病、死苗，每區(qū)留苗16株，每株幼苗接2～3齡褐飛虱若蟲8頭，使用紗網(wǎng)罩罩住防止褐飛虱逃出。當(dāng)感蟲親本9311死亡率達(dá)90%以上時(shí)，參照苗期集團(tuán)法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每株進(jìn)行評(píng)級(jí)。該標(biāo)準(zhǔn)共分為6個(gè)抗性級(jí)別，0級(jí)為植株生長(zhǎng)健康無葉片受害；1級(jí)為存在1片黃葉；3級(jí)為1～2片黃葉，或1片葉枯萎；5級(jí)2～3片黃葉，或2片葉枯萎；7級(jí)為3～4片黃葉，或2片葉枯萎；9級(jí)為整株死亡，每個(gè)株系的抗性級(jí)別為各重復(fù)株系測(cè)定級(jí)別的加權(quán)平均值。

1.3 褐飛虱宿主選擇、存活、蜜露分泌量、蟲體增重量試驗(yàn)

宿主選擇試驗(yàn)：將長(zhǎng)至12～14 d的兩個(gè)親本植株移栽于同一塑料桶（= 29 cm,= 20 cm）中，每桶移栽4株（抗、感各2株）。其中，相同親本的植株對(duì)角線移栽。用可透光的紗網(wǎng)罩將移栽幼苗的塑料桶封閉好，確保接褐飛虱后不會(huì)逃出。植株長(zhǎng)至30 d，將60頭褐飛虱投入每個(gè)紗網(wǎng)罩中，并在接蟲后3 h、6 h、9 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h統(tǒng)計(jì)植株上著蟲數(shù)，試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

褐飛虱存活試驗(yàn)：將長(zhǎng)至12～14 d的兩個(gè)親本分別移栽一株于塑料杯（= 10 cm，= 16 cm）中，罩上底部打圓孔的透明塑料杯。植株長(zhǎng)至30 d時(shí)，從打孔處按每株接入10頭2～3齡的褐飛虱若蟲，再用脫脂棉封住圓孔以防褐飛虱逃出，每天記錄植株上褐飛虱的數(shù)目，連續(xù)統(tǒng)計(jì)10 d。每個(gè)親本設(shè)置8個(gè)重復(fù)。

蟲體蜜露分泌量和蟲體增重量測(cè)定：親本植株的種植方法與宿主選擇試驗(yàn)相同。具體操作是將Parafilm封口膜裁剪成3.5 cm × 3 cm長(zhǎng)方形蠟袋，其一角邊留1 cm長(zhǎng)度的口徑，用于接入一頭已稱量的3齡褐飛虱并將封口膜綁在苗齡40 d的植株莖部。褐飛虱在植株上取食48 h后，移出褐飛虱并稱量，蟲體前后質(zhì)量相減即為接蟲48 h后體質(zhì)量的增量[20]。接蟲48 h后移出褐飛虱并稱量蠟袋，用脫脂棉擦拭蠟袋中蜜露后再稱量，兩者相減即為蟲體蜜露量。每個(gè)親本設(shè)置12個(gè)重復(fù)。

1.4 遺傳圖譜構(gòu)建和抗性位點(diǎn)分析

采用集團(tuán)分離分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）篩選與抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，具體方法如下：從124個(gè)F3株系中挑選10個(gè)極端抗蟲和10個(gè)極端感蟲株系對(duì)應(yīng)的F2單株分別提取基因組DNA[21]，分別測(cè)量各樣品DNA的濃度，然后將等量的單個(gè)基因組DNA進(jìn)行混合構(gòu)建抗感池?；诒緦?shí)驗(yàn)室1559對(duì)SSR和InDel引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染顯色檢測(cè)，篩選得到在親本間具有多態(tài)性的引物，再利用親本間多態(tài)性引物對(duì)抗感DNA池進(jìn)行驗(yàn)證，獲得與目標(biāo)性狀緊密連鎖的引物，進(jìn)而將其對(duì)124個(gè)F2單株的基因型進(jìn)行檢測(cè)，獲得對(duì)應(yīng)單株的基因型。利用JoinMap 3.0軟件構(gòu)建F2群體的局部遺傳連鎖圖譜。利用MapQTL 5軟件對(duì)獲得的F2群體表型和基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行抗性位點(diǎn)檢測(cè)，以閾值LOD值≥3.0來判斷群體是否存在抗性位點(diǎn)。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR分析

分別將發(fā)芽的親本種子播種在塑料杯（= 17 cm，= 15 cm）并保留8株，長(zhǎng)至3葉期時(shí)，每杯接入64頭2～3齡褐飛虱若蟲。接蟲處理0 h、12 h、24 h、48 h時(shí)快速采集植株的葉鞘部分，于液氮中保存并存放于–80℃冰箱中用于RNA的提取，每個(gè)處理的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

采用TaKaRa公司TransZol Up Plus RNA Kit提取RNA，接著用PrimeScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR引物參考日本晴基因組序列信息（http://rice.plantbiology.msu.edu），并用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。PCR在ABI PRISM 7300 real-time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行。參照Prime Script TM RT試劑盒（TaKaRa）說明書，qRT-PCR體系為正反向引物、Passive Reference Dye（50×）各0.4 μL，模板 cDNA 1 μL，2× TransStart Top 10 μL，dd H2O加至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4℃下預(yù)熱30 s，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的程序：94℃下5s，56℃下15 s，72℃下10 s。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。運(yùn)用MS-Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以及計(jì)算斜率和2。以水稻基因（上游引物5’-CAGCACATTCCAGCAG AT-3’，下游引物5’- GGCTTAGCATTCTTGG GT-3’）作為參照，運(yùn)用2?方法分析樣品間基因表達(dá)水平。根據(jù)3次生物學(xué)重復(fù)的定量表達(dá)結(jié)果，比較目標(biāo)基因在褐飛虱處理的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化情況。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用MS-Excel分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，并在5%或1%的顯著性水平上用最小顯著性差異法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 秈稻570011對(duì)褐飛虱的生理抗性特征

苗期抗蟲結(jié)果鑒定表明，秈稻570011對(duì)來自南寧田間的褐飛虱自然群體具有高抗性，平均抗性值為2.9。褐飛虱侵害9 d后，9311表現(xiàn)出整株葉片枯萎，呈現(xiàn)死亡癥狀；而570011植株表現(xiàn)為正常綠色，表明褐飛虱未對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育造成明顯危害（圖1）。

A―接蟲前；B―接蟲9 d；C―宿主選擇試驗(yàn)；D―蟲體存活試驗(yàn)；E―單頭褐飛虱48 h的蟲體增重量；F―單頭褐飛虱48 h的蟲體蜜露量；*和**分別表示在5%和1%水平差異顯著或極顯著。

Fig. 1. Physiological resistance characterization ofrice 570011 against BPH.

為探討秈稻570011對(duì)褐飛虱的抗生性和趨避性特征，我們采用蟲體宿主選擇、存活、蜜露分泌量和蟲體增重量試驗(yàn)來衡量。宿主選擇試驗(yàn)結(jié)果表明，接褐飛虱3 h、6 h、9 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，感蟲材料9311植株上褐飛虱數(shù)目為20～30頭，始終高于抗性材料570011植株上褐飛虱數(shù)目（3～8頭），表明抗源對(duì)褐飛虱具有顯著的趨避性（圖2）。褐飛虱的存活試驗(yàn)表明，接蟲10 d內(nèi)，抗性植株上的褐飛虱存活數(shù)均低于9311（圖3）。此外，抗性植株上單頭蟲體的體質(zhì)量平均增量（–0.32 mg）和蜜露分泌量（2.32 mg）都低于感蟲植株，體質(zhì)量平均增量和蜜露分泌量分別為1.25 mg和11.99 mg，表明該抗蟲材料明顯抑制了褐飛虱的生長(zhǎng)和發(fā)育。上述試驗(yàn)結(jié)果表明秈稻570011對(duì)褐飛虱有明顯的趨避性和抗生性。

2.2 群體抗蟲鑒定及基因定位

苗期抗蟲鑒定結(jié)果表明，秈稻570011和9311對(duì)褐飛虱群體分別表現(xiàn)為極抗和極感。定位群體中124個(gè)F3株系的抗感分離情況如圖2所示，抗性值范圍為2.8～9.0，按照0～6.9和7.0～9.0水平劃分為抗（RR和Rr）與感（rr)兩種類型，株系數(shù)量比為89∶35，卡方檢驗(yàn)(χ2=0.69<χ20.01,1=3.84)表明該性狀的分離比符合1對(duì)基因的分離規(guī)律。為了確定抗性基因所在染色體的位置，利用BSA法篩選抗感DNA池，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4染色體相鄰的5個(gè)引物4M18.675、4M24.64、4M24.7、4M27.553和4RM11491在抗感親本和抗感DNA池間的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)呈現(xiàn)類似的多態(tài)性，而其他染色體區(qū)域未發(fā)現(xiàn)（表1）。因此，初步確定該抗源中的褐飛虱抗性基因可能位于該區(qū)域。利用JoinMap 3.0構(gòu)建覆蓋第4染色體47 cM的局部連鎖遺傳圖譜，該遺傳圖譜中標(biāo)記的順序與日本晴和9311基因組中的參考順序一致。為進(jìn)一步明確抗蟲基因的位置，利用MapQTL 5檢測(cè)定位群體在目標(biāo)連鎖群的基因型和表型值，結(jié)果在標(biāo)記4M18.675和4M24.64之間檢測(cè)到一個(gè)抗性位點(diǎn)，最大LOD值為16.23，按照命名規(guī)則將其命名為()（圖3），該位點(diǎn)解釋了F2群體抗褐飛虱抗性變異的33%。

圖2 定位群體（9311/570011）的褐飛虱抗性值分布

Fig. 2. Distribution of BPH resistance scores of F3mapping population derived from 9311 / 570011.

表1 定位群體(9311/570011)的抗性基因定位結(jié)果

PEV?該位點(diǎn)可解釋的總表型方差百分比；?570011對(duì)關(guān)聯(lián)標(biāo)記的加性效應(yīng)；?570011對(duì)關(guān)聯(lián)標(biāo)記的顯性效應(yīng)。

PEV, Percentage of total phenotypic variance (PEV) was explained by the locus., Additive effect of the associated marker indicated from 570011;, Dominant effect of the associated marker indicated from 570011.

*表示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)材料間的基因相對(duì)表達(dá)量差異達(dá)5%顯著水平。

Fig. 3. qRT-PCR analysis ofallelic genes derived fromrice 570011 and 9311.

2.3 候選基因分析與確定

綜合分析定位區(qū)段分子標(biāo)記錨定的物理位置以及日本晴和9311基因組序列信息，()與已經(jīng)克隆的重合，我們認(rèn)為秈稻570011中的抗性基因很可能是的等位基因。于是我們對(duì)570011和9311中對(duì)應(yīng)的進(jìn)行了表達(dá)量分析。在接蟲0 h、12 h、24 h、48 h后，570011中等位基因的表達(dá)量上升并在接蟲12 h達(dá)到高峰，接著下降并在接蟲24 h達(dá)到最低，進(jìn)而再上升；9311中等位基因的表達(dá)量趨勢(shì)也類似，但570011中等位基因在12 h和48 h的表達(dá)量均明顯高于9311?？梢?，與感蟲材料相比，抗性材料中等位基因?qū)诛w虱取食有顯著的影響。

為了進(jìn)一步確定是否為的等位基因，我們測(cè)定了秈稻570011中的基因組序列，并在EMBL-EBI網(wǎng)站在線比對(duì)兩者CDS序列。結(jié)果表明，570011中基因的CDS序列與公布的CDS序列的同源性達(dá)到99.08%，僅存在22處堿基的差異，其中單堿基突變有20處；多堿基突變有2處，其中1處多堿基變異為4個(gè)堿基連續(xù)突變。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，兩者同源性達(dá)到97.96%，共存在20處氨基酸的差異（圖4）。基于秈稻570011中基因推定的氨基酸序列在NCBI進(jìn)行同源性序列比對(duì)，將比對(duì)獲得同源性最高的100個(gè)不同氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)570011中與同源性最高，親緣關(guān)系最近。以上分析表明秈稻570011中的抗性基因應(yīng)該是的等位基因。

圖4 秈稻570011中Os04g35210與已克隆基因BPH6氨基酸序列比對(duì)

Fig. 4. Amino acid sequence comparison ofderived fromrice 570011 and cloned gene.

3 討論

發(fā)掘褐飛虱抗性種質(zhì)和定位抗性基因來持續(xù)培育新的抗性品種，是防治日趨嚴(yán)峻的褐飛虱危害的最經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑。目前，抗褐飛虱水稻品種主要通過常規(guī)有性雜交育種獲得，存在著育種耗時(shí)長(zhǎng)，選種工作量大的特點(diǎn)，短時(shí)間內(nèi)難以獲得優(yōu)良的抗性品種；而隨著農(nóng)藥防治的大規(guī)模推廣和環(huán)境形勢(shì)的惡化，褐飛虱出現(xiàn)新“生物型”的變異現(xiàn)象，一些原本抗性水稻品種逐漸失去抗性，如攜帶的IR26、攜帶的IR36和IR42[22]。通過分子標(biāo)記輔助選擇（molecular marker-assisted selection, MAS）技術(shù)或者基因工程育種同樣存在著部分褐飛虱抗性基因的抗譜窄、連鎖累贅等困難，使得基因的轉(zhuǎn)育效率低。因此，不斷發(fā)掘廣譜抗性、持久抗性和累贅連鎖效應(yīng)小的抗性基因，通過多基因聚合育種選育新品種已經(jīng)成為防治褐飛虱危害的重要工作。

水稻抗褐飛虱基因在染色體上成簇排列現(xiàn)象明顯，比如第4染色體共鑒定15個(gè)褐飛虱抗性基因，即、()、、、、()、()、()、()、()、()、、()-、和[4]。本研究通過構(gòu)建作圖群體和基因定位發(fā)現(xiàn)，來源于抗性材料 570011的抗褐飛虱基因也位于該區(qū)段的分子標(biāo)記4M18.675和4M24.64間（圖2）。該區(qū)段內(nèi)來源于秈稻品種Swarnalata的已經(jīng)被克隆。該基因介導(dǎo)水稻對(duì)褐飛虱具有趨避性、抗生性和耐蟲性，其對(duì)不同的褐飛虱生物型和白背飛虱具有廣譜抗性同時(shí)農(nóng)藝性狀沒有負(fù)效應(yīng)[10, 20]。本研究中抗源570011對(duì)褐飛虱也表現(xiàn)高抗，具有顯著的趨避性和抗生性（圖1）。此外，褐飛虱的取食均能顯著誘導(dǎo)抗性材料中等位基因的表達(dá)，與Swarnalata中定量表達(dá)規(guī)律較一致。基因編碼一個(gè)包含981個(gè)氨基酸的新類型抗性蛋白，是一類等位型非常豐富的基因，郭建平等[10]測(cè)定了來源于不同水稻材料的等位基因，將不同類型的SNP差異劃分為80種等位型。本研究表明來源于抗源570011的等位基因與的氨基酸同源程度非常高（97.96%），也屬于的等位基因，進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證可以最終確定。

方框內(nèi)為已克隆BPH6及抗源570011中等位基因?qū)?yīng)的氨基酸序列。

Fig. 5. Phylogenetic tree developed with amino acid sequence ofand its homologous sequences.

本研究利用抗源570011與9311雜交構(gòu)建的定位群體，在第4染色體上的標(biāo)記4M18.675和4M24.64之間的39 cM區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到一個(gè)褐飛虱抗性位點(diǎn)。鑒于該區(qū)段有已經(jīng)定位克隆的基因，我們通過qRT-PCR分析和序列比較，發(fā)現(xiàn)抗源570011中基因與已克隆的表達(dá)規(guī)律相似，序列同源性極高，且兩者的親緣關(guān)系也最近，表明本研究鑒定的抗性基因?yàn)榈囊粋€(gè)等位基因。該基因的發(fā)掘進(jìn)一步豐富了的等位型并提供新的抗源，為抗褐飛虱水稻新品種選育提供可利用的抗源。

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Genetic Analysis and Identification of Brown Planthopper Resistance Gene inRice Accession 570011

CHENG Ling1, 2, HUANG Fugang3, QIU Yipu3, WANG Xinyi3, SHU Wan2, QIU Yongfu3, LI Fahuo3,*

(1Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement, Wuhan 430064, China;2College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, China;3College of Agriculture, Guangxi University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning 530004, China;*Corresponding author, email: 316801153@qq.com)

【Objective】The aim is to identify brown planthopper (BPH) resistance gene in resistantrice accession 570011, and provide new materials for insect-resistant rice breeding.【Method】A seedling bulk test was conducted to evaluate the BPH resistance of F3population, and a local genetic map was developed based on the genotype of the mapping population by JoinMap 3.0. The resistance locus was then detected and genetic effect was evaluated by MapQTL 5. The expression of one candidate resistance gene was analyzed with qRT-PCR, and the corresponding CDS and amino acid sequences of the candidate gene were compared.【Result】Accession 570011 showed high resistance to BPH at the seedling stage and significant antibiosis and antixenosis against BPH. The ratio of resistant lines (score < 7) to susceptible lines (score≥7) in F3population was 89:35, which accorded with the separation law of one dominant gene. One BPH resistance locus was detected in the 39 cM region flanked by markers 4M18675 and 4M24.64 on chromosome 4, which could be allelic to the cloned. qRT-PCR analysis indicated that the expression ofallele in accession 570011 was significantly higher than that in susceptible line 9311. Accession 570011 respectively shared the similarity of 99.08% and 97.96% in CDS and amino acid sequence comparing with the cloned gene. Moreover, they closely clustered in the phylogenetic tree. All the results suggested that the BPH resistance gene derived from accession 570011 was allelic to【Conclusion】Accession 570011 is highly resistant to BPH and carries one major resistance gene, which is an allele of. The identification of the resistance gene enriches the alleles ofand provides new materials for insect resistant rice breeding.

; brown planthopper;; allele; physiological resistance mechanism

10.16819/j.1001-7216.2023.220601

2022-06-01；

2022-07-12。

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金專項(xiàng)(桂科ZY21195040); 糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2021lzjj09); 廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2022-36-Z01-KF04)。