利用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)制廣親和水稻溫敏雄性不育系

段敏 謝留杰 高秀瑩 唐海娟 黃善軍 潘曉飚,*

利用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)制廣親和水稻溫敏雄性不育系

段敏1謝留杰1高秀瑩2唐海娟2黃善軍1潘曉飚1,*

(1臺州市農業(yè)科學研究院 作物研究所, 浙江 臨海 317000；2南京農業(yè)大學 作物遺傳發(fā)育國家重點實驗室, 南京 210095；*通信聯系人, email: xbpan163.com)

【目的】為突破傳統(tǒng)雜交轉育方法對水稻兩系不育系選育的限制，利用CRISPR/Cas9技術對秈型恢復系臺恢31的溫敏雄性核不育基因進行編輯，以獲得全新水稻溫敏雄性不育系?！痉椒ā窟x擇水稻溫敏不育基因第1外顯子的2段序列作為靶點，構建雙靶點pHUE411--gRNA載體，通過農桿菌侵染獲得116株T0代轉基因植株?！窘Y果】經鑒定獲得3種類型純合突變體、和，每一種突變均導致TMS5氨基酸序列的缺失。分期播種試驗結果顯示，幼穗分化敏感期溫度為27℃時，和自交結實率分別為0.56%、0.03%，表現為高度不育，而則完全不育。與野生型臺恢31相比，不育系（即）單株穗數增多，穗長變短，株高及每穗總粒數相較WT均下降25%，花藥發(fā)白瘦小，無花粉粒充實，柱頭、穎殼沒有顯著差異。幼穗分化4期時進行溫度處理，確認的育性轉換溫度為26℃。分別與秈、粳型恢復系配組，F1的結實率超過90%?！窘Y論】利用CRISPR/Cas9技術對秈型恢復系臺恢31的溫敏雄性核不育基因進行編輯，獲得能夠穩(wěn)定遺傳的水稻廣親和溫敏雄性不育系，為兩系不育系選育提供新的技術支撐。

CRISPR/Cas9；水稻；幼穗分化敏感期；自交結實；育性轉換溫度

水稻是我國第一大糧食作物，自20世紀60年代三系雜交水稻問世后，我國的水稻產量發(fā)生了第一次質的飛躍。隨后光溫敏核不育水稻的發(fā)現，又為水稻雜種優(yōu)勢的利用開辟了新途徑。1996?2014年，我國有900多個兩系雜交水稻品種通過審定，目前年推廣面積550萬hm2左右[1]。兩系雜交水稻已經成為我國水稻生產中不可或缺的類型。

光溫敏雄性核不育基因是兩系不育系的核心，它與不育系的育性穩(wěn)定性、育性轉換有最直接的聯系[2]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，許多光溫敏核不育基因被成功定位及克隆，例如光敏核不育基因[3]、[4]、[5, 6]，光溫敏核不育基因[7]等。光敏雄性不育基因大部分是由農墾58S 轉育而來的，而溫敏雄性不育材料較為豐富，不育基因來源廣泛。目前已經定位的溫敏核不育基因有[8]、[9]、[10]、[11]等數十個位點，其中是少數已被克隆的功能基因。編碼一個保守短板RNA酶Z，命名為RNase ZS1。單個堿基突變導致安農S-1和株1S中RNase ZS1編碼蛋白質的翻譯提前終止。通過RNA-seq的方法找到了RNase ZS1加工的基因UbL40（泛素核糖體L40蛋白）。RNase ZS1能夠將3個UbL40的mRNA加工成多個片段，在溫敏不育系中由于RNase ZS1功能的缺失，不能正常加工UbL40，使其過度積累引起了雄性不育；而常規(guī)品種中的UbL40的mRNA能被RNaseZS1正常降解，不會造成積累，育性正常[12]。

CRISPR/Cas9是一種由導向RNA介導的基因組定向編輯技術[13]，通過非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）實現對基因組DNA的定點敲除、替換、插入等精準修飾[14]，目前已成功應用于如水稻、玉米、小麥等多種作物的重要農藝性狀遺傳改良。CRISPR/Cas9技術最大特點是只對生物自身的內源基因進行編輯和改造，并非外源基因轉入，可消除民眾對改造后的作物存在安全隱患的顧慮。2022年，農業(yè)農村部制定《農業(yè)用基因編輯植物安全評價指南（試行）》為基因編輯材料在我國的應用和推廣指明了方向。近些年有不少研究者針對溫敏核不育基因進行編輯，獲得了多個粳型[12, 15-16]、秈型[17-18]的不育系資源。本研究以自主選育的具有廣親和性的水稻秈型恢復系臺恢31為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術對其進行編輯，以期獲得具有廣親和性的秈型溫敏不育系，擴大配組范圍，豐富水稻兩系不育系資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及載體

水稻材料臺恢31為偏粳型廣親和恢復系CR84與偏秈型恢復系K6093雜交后，經數代自交選育出的含有廣親和位點的秈型F6代品系。該品系具有廣親和性好、每穗粒數多、柱頭大且外露率高等特點。CRISPR/Cas9載體pHUE411、中間載體pCBC- MT1T2由南京農業(yè)大學張紅生實驗室饋贈。

1.2 基因編輯靶位點的選擇

水稻光溫敏核不育基因（LOC_Os 02g12290）全長1895 bp。登錄Arizona大學網站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)，選取PAM（protospacer adjacent motif）序列（NGG）上游20個寡核苷酸作為靶點，并利用Cas-OFFinder網站(http://www.rgenome.net/cas- offinder/)評估脫靶情況，同時在水稻基因組數據庫中比對靶序列的特異性。

1.3 雙靶點pHUE411-TMS5-gRNA載體構建

參考Chen等[19]方法，稍作修改。1）PCR擴增。以中間載體pCBC-MT1T2質粒為模板，根據同源重組法原理設計雙重引物T5T1-BsF/BsR及T5T1-F0/R0擴增gDNA（gRNA對應序列），引物包含2個去掉離NGG最遠端堿基的19 nt大小的靶位點（表1）。2）酶切-連接體系建立。純化回收上述PCR產物，建立15 μL反應體系：2 μL回收產物；2 μL載體質粒pHUE411；1.5 μL 10×T4 緩沖液；1.5 μL 10×BSA；1 μLⅠ內切酶；1 μL 高濃度T4連接酶，加水補足至15 μL。反應條件為37℃下酶切5 h，50℃下連接5 min，80℃下處理10 min以終止反應。3）轉化及陽性驗證。取5 μL連接液，利用電轉法轉化大腸桿菌DH10B感受態(tài)，Kan板篩選。以單克隆菌落為模板，設計引物T5U3-F/R進行PCR擴增，片段大小為831 bp。驗證為陽性的單克隆提取質粒，根據載體信息設計正向引物T5-SF1、T5-SF2測序。引物序列見表1。

1.4 T0代轉基因植株陽性驗證及突變位點分析

測序驗證正確的大腸桿菌質粒轉化農桿菌EHA105，將PCR檢測陽性的克隆用于水稻愈傷組織的轉化。參考唐海娟[20]方法稍作修改，以臺恢31成熟水稻種子誘導的胚性愈傷組織為受體，經根癌農桿菌侵染創(chuàng)制轉基因植株。

采用改良的CTAB法提取T0代轉基因水稻葉片的DNA，分別利用T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R進行陽性驗證，以驗證轉基因是否成功。轉基因成功的單株以引物T5-F/R擴增的第1外顯子并測序，檢測靶序列是否發(fā)生突變。

測序鑒定為雜合突變的T0代轉基因單株，經自交結實獲得T1代種子。提取T1代葉片DNA，繼續(xù)擴增潮霉素標記以尋找不含載體的無Cas9單株。針對無Cas9單株，以引物T5-F/R擴增的第1外顯子并測序，尋找靶序列發(fā)生純合突變的單株，通過生物軟件DNAMAN分析突變類型。擴增潮霉素引物HYG-F/R及第1外顯子的引物T5-F/R序列見表1。

1.5 不育系花粉育性鑒定及TB52S農藝性狀調查

純合突變體于2021年5月14日至6月14日分4期播種，每期間隔10 d，記錄播始歷期，以野生型臺恢31作對照。同時，在試驗地旁安裝溫度記錄儀，每隔30 min記錄一次，用以統(tǒng)計幼穗分化敏感期的平均溫度。本研究中，將水稻始穗期前20 d開始，持續(xù)7 d的時期定義為幼穗分化敏感期。

盛花期后，每種突變體選擇3個主穗，用I2-KI染色觀察花粉育性，同時在鏡檢取樣的單株上另選1穗套袋自交，30 d后統(tǒng)計結實率。取同時期突變體和WT未開放的小花，置于體式顯微鏡下觀察。成熟期時，突變體選擇15個單株，以臺恢31作對照，分別考查株高、分蘗、每穗粒數、穗長等農藝性狀。

表1 本研究涉及的PCR擴增及測序引物

下劃線表示靶位點

The two target sites are underlined.

1.6 不育系TB52S育性轉換溫度鑒定

大田環(huán)境下生長的不育系，當主莖幼穗發(fā)育至4期左右時移入光照培養(yǎng)箱，分別進行溫度、光照處理。溫度處理設置23℃、24℃、26℃、30℃，光照條件為14 h光照/10 h黑夜。光照處理設置12 h光照/12 h黑夜、13 h光照/11 h黑夜、14 h光照/10 h黑夜、15 h光照/9 h黑夜，溫度條件為30℃。每個處理3個單株，以臺恢31作為對照。處理12 d后置于自然條件下正常生長。盛花期后鑒定花粉育性及自交結實率，方法同1.5。

1.7 不育系TB52S配合力分析

2021年初在海南陵水基地，不育系分別與秈、粳型恢復系測配，2021年正季將雜交F1播種于海南小溪基地，成熟后選取中間5株，統(tǒng)計結實率、千粒重、每穗總粒數等相關數據。

2 結果與分析

2.1 gRNA靶點的設計

光溫敏核不育基因（LOC_Os02g12290）全長1895 bp，由6個外顯子組成，編碼302個氨基酸。登錄網站http://www.genome.arizona.edu/ crispr/CRISPRsearch.html，選擇第1外顯子的2個PAM（protospacer adjacent motif）序列（NGG）前20 nt的寡核苷酸作為靶點，以確保該基因能夠被編輯，2個靶點之間相距400 bp（圖1-A）。利用Golden gate克隆技術[21]，將2個目標序列連入終載體pHUE411，組成雙元表達載體pHUE411--Cas9（圖1-B）。

圖1 gRNA靶點的位置(A)及終載體pHUE411-TMS5-Cas9組成(B)

Fig. 1. Targets site of gRNA (A) and structure of pHUE411--Cas9 (B).

2.2 T0代tms5突變體的鑒定

以臺恢31成熟水稻種子誘導的胚性愈傷組織為受體，將構建好的表達載體pHUE411--Cas9經根癌農桿菌侵染轉入其中，得到T0代植株。采用改良的CTAB法提取T0代轉基因水稻葉片的DNA，分別利用T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R進行陽性驗證。電泳結果顯示，116個T0代單株均能擴增出506 bp大小的潮霉素片段以及831 bp大小的載體+基因片段（圖2）。

以引物T5-F/R擴增所有陽性T0代植株的第一外顯子并測序，相應的編輯位點序列與臺恢31作對比。測序結果顯示，所有T0代單株在的第一個靶點位置均呈現雙峰，雙峰的位置一般在編輯序列第6或第7個堿基開始（圖3）。結合PCR及測序結果，認為陽性T0代單株屬于突變雜合型。

2.3 無載體的tms5純合突變株的篩選與鑒定

為了獲得無載體的純合突變單株，將T1代種子播種成苗，抽穗前提取單株DNA，繼續(xù)以T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R進行分析，結果表明，213個T1單株中有49個不含表達載體。繼續(xù)對49個無載體的單株進行第一外顯子序列測序，共獲得25個純合突變株，包含3種類型的突變。3種突變均在靶點2末端有1個堿基插入，靶點1的序列略有差異。如突變體T31-9，靶點1附近缺失7個堿基；突變體T31-100的靶點1附近缺失10個堿基；突變體T31-155的靶點1缺失1個堿基（圖4）。靶點1的序列缺失使得蛋白翻譯提前終止（圖5）。

2.4 tms5突變體育性鑒定及TB52S農藝性狀觀察

綜合測序結果，將T31-9類型突變體命名為，T31-155類型命名為，T31-100類型命名為。3種突變體分期播種于試驗田，育性鑒定結果列于表2。可以看出，隨著播種日期的延遲，不育系的播始歷期逐漸縮短，3種突變體的在同一播始歷期內基本一致。分析I-IV期播種株系幼穗分化敏感期平均溫度與相對應不育系的自交結實率可以發(fā)現，當幼穗敏感期平均溫度超過27℃時，3個不育系自交結實率均為0。當幼穗敏感期平均溫度為27℃時，和自交結實率分別為0.56%、0.03%，表現為高度不育，花粉經I2-KI染色亦可看到極少數的可育花粉，而則完全不育（圖6）。以上結果說明相較于其他2個不育系，的不育性更為穩(wěn)定徹底，其育性轉換溫度低于27℃。將作為重點對象分析，命名為。選擇5月24日播種于大田的不育系與野生型比較田間性狀。與野生型相比，成熟期單株穗數增多、穗長變短；株高達86.1 cm，每穗總粒數243.17，二者相較WT均下降近1/4水平（圖7-A、B；表3）。盛花期將及WT的小花置于解剖鏡下觀察，可以發(fā)現的花藥發(fā)白瘦小，無花粉粒充實，柱頭、穎殼沒有顯著差異（圖7-C）。綜上所述，的突變導致恢復系臺恢31呈現出花粉不育、矮稈、多分蘗等不育系的特征。

M―標記；1～24―T0單株。A―潮霉素標記, 條帶大小506 bp；B―載體+基因片段, 條帶大小831 bp。擴增出相應片段表示植株為陽性。

Fig. 2. Positive identification of T0transgenic plants (partial).

A, T0代雜合植株第一靶點測序結果, 箭頭表示雙峰開始位置；B, 野生型（臺恢31）第一靶點測序結果。

Fig. 3. Sequencing of the first target site of TMS5 in T0 transgenic plants and WT (Taihui 31).

圖4 tms5突變株與野生型靶位點突變序列比對分析

Fig. 4. Comparison of mutation sequences at target sites between tms5 mutants and WT.

圖5 tms5突變株與野生型氨基酸序列比對分析

Fig. 5. Comparison of amino acid sequence between tms5 mutants and WT.

表2 tms5突變體分期播種的不育性鑒定

2.5 TB52S育性轉換溫度的探索

為了探索的育性轉換溫度，利用人工氣候箱對處于幼穗分化期4期左右的進行溫度處理，以臺恢31為對照。處理條件為23℃、24℃、26℃、30℃，每日光照14 h，持續(xù)12 d，處理后放入自然條件下繼續(xù)生長。從圖8可以看出，23℃、24℃處理下，花粉可育，花藥形態(tài)與臺恢31無異，自交結實率分別為49.1%、59.4%。26℃條件下，花粉經染色具備典敗、圓敗、可育等多種形態(tài)，花藥相較臺恢31變小，但仍是明顯的黃色，自交結實率達33.1%。而30℃處理后基本無花粉，花藥發(fā)白瘦小，敗育徹底。結合分期播種試驗的結果可以認為，26℃是的育性轉換溫度。

圖6 tms5突變體在I期和IV期播種時的花粉育性

Fig. 6. Pollen fertility ofmutants seeded at sowing dates I and IV.

圖7 不育系TB52S及野生型成熟期表型對比

Fig. 7. Comparison of phenotype betweenmutant and WT.

研究過程中發(fā)現一個值得思考的現象，在12月份海南陵水基地繁種時，次年4月時的結實率超過70%，與野生型臺恢31接近（數據未公布）。這種可育表現提示研究者育性可能受到光照長短的影響。為了證明這一觀點，研究者繼續(xù)利用人工氣候箱對處于幼穗分化期4期左右的進行光照處理，以臺恢31為對照。光照處理設置12 h光照/12 h黑夜、13 h光照/11 h黑夜、14 h光照/10 h黑夜、15 h光照/9 h黑夜，溫度條件為30℃，持續(xù)12 d，處理后放入自然條件下繼續(xù)生長。結果顯示（圖9），12 h光照條件下，花粉以典敗為主，有極少數可育花粉，花藥瘦小呈黃色。13 h、14 h、15 h的光照處理均使基本無花粉，花藥發(fā)白瘦小。所有處理下自交結實率均為0。該結果說明，在高溫條件下，光照在12 h以上可以保持徹底不育的特性。至于光照少于12 h時其育性是否會發(fā)生變化，還需進一步探索。

圖8 突變體TB52S在不同溫度處理下的花粉育性、花藥形態(tài)及自交結實率（比例尺為5 mm，F表示可育，S表示不育）

Fig. 8. Pollen fertility and self-fertilization rate ofmutant under different temperature treatments during the young panicle differentiation. (Bar=5 mm; F, Fertile; S, Sterile)

Fig. 9. Pollen fertility and self-fertilization rate ofmutant under different photoperiod period treatments during the young panicle differentiation. (Bar=5 mm; S showed sterile)

2.6 TB52S配合力分析

經統(tǒng)計，的柱頭外露率達到53.3%（表3），表明其具有較高的異交結實率。將分別與秈、粳型恢復系測配，雜交F1成熟后取樣統(tǒng)計農藝性狀。從表4可以看出，由于具有廣親和性，除/臺恢1628的結實率為88.9%，其余組合結實率均超過90%，最高的為/TP39，達到96.1%。與秈型恢復系配組F1的千粒重和單株產量較高，其中/臺恢468的單株產量接近80 g。與粳型恢復系配組F1的每穗粒數和結實率較高，但是有效穗數少，故單株產量較秈型恢復系偏低。綜合看，的廣親和性好，今后研究中可以擴大配組范圍，尋找優(yōu)良組合。

表3 水稻溫敏核不育系TB52S農藝性狀

表4 水稻溫敏核不育系突變體TB52S與不同恢復系配組F1農藝性狀

3 討論

基因組定向編輯技術是近幾年發(fā)展起來的對基因組進行定向精確修飾的一種技術?；蚪M編輯技術包括鋅指核酸酶[22]、類轉錄激活因子效應物核酸酶[23]以及CRISPR/Cas9進行基因組編輯。相較于前兩種技術，CRISPR/Cas9設計簡單，由個性化的sgRNA來介導靶基因DNA的切割，與靶基因結合的特異性由20個核苷酸的導向RNA決定，DNA切割由Cas9蛋白完成[13]，作用效率高。

目前國內單子葉植物的基因編輯研究中，使用的主要是pYLCRISPR/Cas9Pubi載體體系[24]以及pHUE411載體體系[21]，可以進行雙靶點或者多基因靶點同時編輯，針對單靶點編輯效率低下的缺點[25]進行了有效的改進。利用CRISPR/Cas9對靶序列的編輯時，通常會得到多種類型的T0代株系，如無突變型、突變純合型、突變雜合型[26-27]。本研究構建的雙元表達載體pHUE411--Cas9經農桿菌侵染后，得到的116個T0代單株經PCR驗證均為突變雜合型。盡管株系類型單一，但均為突變株，說明pHUE411載體體系編輯效率較高。25個T1的純合突變單株僅包含3種突變類型，原因可能是T0轉基因植株很多由同一個愈傷組織分化而來，故具有相同的基因型。本研究中獲得的3種突變體、、在靶點1分別缺失1個、7個、10個堿基，導致蛋白翻譯提前終止，因此靶點2的單堿基插入可以不用分析。

育性轉換溫度閾值是水稻核不育系的研究重點。是生產上應用最為廣泛的溫敏核不育基因[28]。粳稻背景的突變體的轉育溫度一般超過28℃[12, 16]，而秈稻品種如粵晶絲苗、泰豐B、五山絲苗的突變體分別在 24℃、26℃、26℃下花粉表現為完全不育[29]。本研究中的育性轉換溫度經鑒定為26℃，與前人研究結果類似。針對不同類型水稻材料獲得的突變體轉育溫度差異明顯，有研究者提出只是育性的一個開關，不育起點溫度受其他基因的調控[17]。因此想要獲得具有生產應用價值的秈型兩系不育系有待進一步探索。

程式華等[30]在對全國101份光、溫敏不育系的光溫反應分類研究后，提出實用的秈型不育系的育性轉換光溫條件，應當是高溫條件下無論長短日照均為不育，短日適溫條件下育性基本恢復。另外，長日照下如遇短期低溫亦保持不育或基本不育。本研究中，在30℃處理下，盡管12 h日照能產生極少數的可育花粉，從自交結實率來看仍然徹底不育，與日照長度15 h結果一致。海南陵水4月的平均溫度為25.3℃，平均日照長度12.5 h左右[31]。結合每年4月份在海南陵水結實率接近野生型臺恢31的表型，推斷在短日照適溫的條件下育性可以恢復。

水稻廣親和基因的發(fā)掘以及廣親和恢復系成功選育，使得水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用逐步轉為現實[32, 33]。同樣的，選育具有廣親和性的兩系不育系亦可擴大配組范圍，增加選育超級稻的幾率。本研究中，分別與秈型、粳型恢復系配組，F1的結實率接近或超過90%，說明的適配范圍廣，具有較好的應用前景。綜合來看，具備高溫不育、短日適溫可育的優(yōu)點，且適配范圍廣，實用性較好。然而其長日照下26℃的轉育溫度仍是推廣應用的一個短板，需進一步優(yōu)化。

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Creation of Thermo-sensitive Genic Male Sterile Rice Lines with Wide Compatibility Based on CRISPR/Cas9 Technology

DUAN Min1, XIE Liujie1, GAO Xiuying2, TANG Haijuan2, HUANG Shanjun1, PAN Xiaobiao1,*

(Crop Research Institute, Taizhou Academy of Agricultural Sciences, Linhai 317000, China; State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; Corresponding author, email: xbpan@163.com)

【Objective】In order to break the fetters in traditional hybridization in the breeding of genic male sterile rice lines, the thermo-sensitive genic male sterility genewas edited by CRISPR/Cas9 technology to create new genic male sterile lines usingrestorer line Taihui 31 as material. 【Method】Two sequences in the first exon ofwere chosen as target sites for the construction of vector pHUE411--gRNA and 116 T0generation transgenic plants were obtained byinfection method.【Result】Three homozygous mutants,,andwith amino aciddeletion in TMS5 were verified by PCR and sequencing. The split sowing experiment showed that the self-fertilization rate ofandwere 0.56% and 0.03% at 27℃, respectively. Meanwhile, at the same temperature, the pollen ofturned to be completely sterile. Compared with Taihui 31 (WT),() had more panicles, shorter panicle length. Its plant height and grain numbers per panicle reduced to nearly three quarters of WT. Furthermore, except for smaller anther with no pollens, the stigma, palea and lemma ofdidn’t change significantly as compared with WT. The fertility transfer temperature ofwas confirmed as 26℃according to the temperature test during the IV phase of young panicle differentiation. Last but not least, the seed setting rate of hybrid F1derived from the cross between TB52S andorrestorer lines was beyond 90%. 【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 technology, we obtained thermo-sensitive genic male sterile linewhich was genetically stable. It provides new technical support for the breeding of genic male sterile lines.

CRISPR/Cas9; rice; young panicle differentiation sensitive period; self-fertilization; critical temperature of fertility alternation

10.16819/j.1001-7216.2023.221006

2022-10-24;

2022-11-07。

浙江省重大科研攻關計劃資助項目(2016C02050-5); 臺州市科技計劃資助項目(21nya07)。