不同品種大球蓋菇原生質(zhì)體單核化及單核體的特性

周 峰,楊煥玲,2*,趙 妍,姜淑霞,陳明杰,李正鵬,2,查 磊,2,李 玉**

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;2 上海國(guó)森生物科技有限公司,上海 201403;3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,泰安 271018)

大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)又名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇、赤松茸[1-2],不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),味道鮮美,深受消費(fèi)者喜愛[3],而且在實(shí)現(xiàn)“鄉(xiāng)村振興”戰(zhàn)略中同樣發(fā)揮重要作用,可以提高農(nóng)田利用率、增加經(jīng)濟(jì)效益、改善土壤品質(zhì)等[4]。 大球蓋菇作為新興發(fā)展產(chǎn)業(yè)面臨很多亟待解決的問題,如高溫環(huán)境下燒菌、易開傘,育種周期長(zhǎng),野生資源少,種質(zhì)資源匱乏等。 為滿足市場(chǎng)需求,豐富大球蓋菇的種質(zhì)資源庫,定向育種迫在眉睫。 相較于傳統(tǒng)常規(guī)的食用菌育種方法,原生質(zhì)體技術(shù)開辟了食用菌育種的新天地,單核原生質(zhì)體具有相對(duì)穩(wěn)定而集中的親本性狀,可以減少篩選雜交后代的工作量,同時(shí)不受栽培季節(jié)限制,有效地縮短了育種周期[5]。 目前原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌育種方面也廣泛應(yīng)用。 高明俠等[6]將紫芝和赤芝原生質(zhì)體使用電融合方法獲得高多糖的靈芝。 王淑珍等[7]利用靈芝與糙皮側(cè)耳的原生質(zhì)體融合,選育木栓質(zhì)化較弱的靈芝新菌株。 燕曉翠等[8]通過電融合糙皮側(cè)耳和釀酒酵母原生質(zhì)體的方法,獲得了生長(zhǎng)較快且有效降解木質(zhì)素的新菌株。 鄭錦榮[9]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得3 株金針菇與巨大口蘑融合的新菌株。 蔡佺佑[10]采用原生質(zhì)體融合育種方法,以秀珍菇和巨大口蘑為親本菌株選育出2 株新菌株。 原生質(zhì)體融合的方法也應(yīng)用于大球蓋菇育種[11]。 朱靜嫻[12]利用原生質(zhì)體育種技術(shù)馴化出3 株大球蓋菇耐高溫菌株。 任紀(jì)帆等[13]通過原生質(zhì)體融合和單孢雜交選育出‘山農(nóng)球蓋3 號(hào)’耐高溫高產(chǎn)菌株。 單核原生質(zhì)體特殊的遺傳背景,在理論上是研究其基因定位和遺傳性狀的重要材料,在育種上是形成以單核原生質(zhì)體為材料的新方向,具有廣闊的應(yīng)用和推廣前景[14-16]。

原生質(zhì)體單核化的關(guān)鍵是原生質(zhì)體的制備及再生,影響原生質(zhì)體制備的因素有很多,主要包括酶的種類及濃度、反應(yīng)溫度、酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑種類及濃度等,不同的食用菌有其特定的最佳條件。 研究表明,真姬菇、褐色雙孢蘑菇、蛹蟲草、桑黃、草菇等食用菌原生質(zhì)體制備的條件各不相同[17]。 本試驗(yàn)通過不同品種大球蓋菇原生質(zhì)體單核化,獲得單核體,探究單核體菌絲形態(tài)特征,為利用原生質(zhì)體技術(shù)選育新品種做鋪墊,同時(shí)為大球蓋菇的遺傳和育種工作提供不同品種的單核體材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

本研究所用供試菌株及其來源見表1。

表1 供試菌株及其來源Table 1 Tested strains and their sources

1.1.2 主要儀器

智能食用菌培養(yǎng)箱(型號(hào):ZJX-300A),杭州錢江儀器設(shè)備有限公司;潔凈工作臺(tái)(型號(hào):VS-1300LU),蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;均質(zhì)儀(型號(hào):32BL80,產(chǎn)地:美國(guó));超級(jí)恒溫槽,上海比郎儀器有限公司;倒置顯微鏡(產(chǎn)地:菲律賓);電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

其他試材:血球計(jì)數(shù)板,無紡布,普通漏斗,0.20 μm 細(xì)菌過濾器,砂芯漏斗,50 mL 離心管,20 mL 離心管。

1.1.3 主要試劑

溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所;甘露醇購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司;PDA 粉(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)、PDB 粉(馬鈴薯葡萄糖肉湯)購(gòu)自美國(guó)碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基類型

固體培養(yǎng)基(加富PDA 培養(yǎng)基):PDA 粉39 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,胰蛋白胨2 g,酵母粉2 g,水1 L。 液體培養(yǎng)基:PDB 粉24 g,胰蛋白胨2 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,VB10.1 g,水1 L。再生培養(yǎng)基:PDA 粉39 g,胰蛋白胨2 g,酵母粉2 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,K2HPO41.5 g,KH2PO41.5 g,VB10.1 g,VB60.1 g,甘露醇109 g,水1 L。 鏡檢培養(yǎng)基:PDA 粉0.39 g,吐溫-20 20 μL,水100 mL。 以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌15 min 后冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固體菌絲的制備

在無菌超凈工作臺(tái)中,將4 ℃冰箱保存的大球蓋菇菌種25 ℃活化2 d 后,取3—5 mm 大小的菌絲塊接種到固體培養(yǎng)基上,于25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)14 d,備用。

1.2.2 液體菌絲的制備

將長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落轉(zhuǎn)至均質(zhì)儀,并加入50 mL 液體培養(yǎng)基打碎,分別接種于盛有50 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)3 d,備用。

1.2.3 滲穩(wěn)劑的制備

甘露醇穩(wěn)滲液:稱取10.9 g 甘露醇溶解于100 mL 蒸餾水中,配成0.6 mol∕L 的甘露醇穩(wěn)滲液,121 ℃高壓滅菌15 min 后備用。

1.2.4 酶液的制備

稱取0.12 g 溶壁酶溶于8 mL 0.6 mol∕L 滲透壓穩(wěn)定劑,使酶液含量為1.5%,經(jīng)0.20 μm 細(xì)菌過濾膜過濾除菌后備用。

1.2.5 原生質(zhì)體的制備

收集并過濾液體培養(yǎng)3 d 的菌絲,無菌水沖洗后用無菌吸水紙吸干多余水分,將菌絲轉(zhuǎn)移至酶液含量為1.5%的液體中,輕微振蕩使菌絲均勻分散開,置于30 ℃水浴鍋中酶解3 h,每隔1 h 輕微震蕩,使其與酶液充分接觸。 用G-2 砂芯漏斗過濾除去酶解液中殘留的菌絲,將收集的濾液放在50 mL 離心管中,4 ℃、4 000 r∕min 離心15 min,棄上清,沉淀用0.6 mol∕L 的甘露醇洗滌2 次,即得到純化的原生質(zhì)體。

1.2.6 原生質(zhì)體再生

將原生質(zhì)體用0.6 mol∕L 的甘露醇稀釋至適當(dāng)濃度,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原生質(zhì)體總數(shù)。 吸取100 μL稀釋好的原生質(zhì)體懸液于再生培養(yǎng)基上,用涂布棒涂布均勻。 同時(shí)用無菌水脹破原生質(zhì)體后,以同樣方法涂布于再生培養(yǎng)基上,以消除非原生質(zhì)體所形成的菌落帶來的誤差。 25 ℃恒溫黑暗條件下倒置培養(yǎng)3—5 d 可見再生菌落,并統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體再生菌落數(shù)。 計(jì)算各個(gè)品種原生質(zhì)體的再生率:

原生質(zhì)體再生率=[(原生質(zhì)體再生菌落數(shù)-對(duì)照組再生菌落)∕原生質(zhì)體總數(shù)] ×100% (1)

1.2.7 原生質(zhì)體單核化

將原生質(zhì)體再生的單個(gè)菌落(長(zhǎng)出如針尖大小時(shí)挑出)接種在鏡檢培養(yǎng)基上,統(tǒng)計(jì)單個(gè)菌落總數(shù)。25 ℃培養(yǎng)3—5 d 后使用顯微鏡觀察鎖狀聯(lián)合情況,若無鎖狀聯(lián)合則為單核體,并統(tǒng)計(jì)單核化率。

1.2.8 菌絲形態(tài)特征

將不同品種的大球蓋菇菌株及其單核體接種于鏡檢培養(yǎng)基上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d,觀察菌落大小、長(zhǎng)勢(shì)、顏色等特征,分析出發(fā)菌株與單核體菌落形態(tài)的差異性。 每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大球蓋菇品種的原生質(zhì)體再生率

將制備的原生質(zhì)體用0.6 mol∕L 的甘露醇洗滌后得到純凈的原生質(zhì)體,如圖1 中黑色圓圈標(biāo)出的即為原生質(zhì)體。

圖1 顯微鏡下的大球蓋菇原生質(zhì)體(20 ×)Fig.1 Protoplasts of Stropharia rugosoannulata under microscope(20 ×)

由表2 可知,‘土肥’品種原生質(zhì)體再生能力最強(qiáng),3 d就已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,并且菌絲濃白,氣生菌絲發(fā)達(dá),再生率最高,達(dá)1.37%;‘高郵’和‘大T’品種再生菌落均4 d 長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,‘高郵’菌絲較稀疏且分散,再生率為1.13%,菌落由白色濃密菌絲組成;‘大T’菌絲蔓延擴(kuò)展,呈擴(kuò)散狀,菌落較大,菌絲先由透明變?yōu)榘咨?在試驗(yàn)的3 個(gè)品種中再生率最低,為0.90%。

表2 不同品種大球蓋菇原生質(zhì)體再生率Table 2 Regeneration rate of protoplasts of different strains of Stropharia rugosoannulata

2.2 不同品種大球蓋菇的原生質(zhì)體單核化率

從表3 可以看出,供試驗(yàn)的3 個(gè)大球蓋菇品種的單核化率‘大T’品種的最高,達(dá)到85.2%,‘土肥’的單核化率次之,為66.0%,‘高郵’的單核化率最低為59.8%。 單個(gè)菌落接種在鏡檢培養(yǎng)基上,可能由于培養(yǎng)基較薄,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠充足,生長(zhǎng)的菌絲較細(xì),在倒置顯微鏡下難以觀察鎖狀聯(lián)合,待菌絲生長(zhǎng)5 d 后才能清晰觀察到有無鎖狀聯(lián)合。

表3 不同品種大球蓋菇原生質(zhì)體單核化率Table 3 Monokaryotization rate of protoplasts of different strains of Stropharia rugosoannulata

2.3 不同品種大球蓋菇的單、雙核體菌落特性

觀察菌落大小、長(zhǎng)勢(shì)、顏色、形態(tài)等特征,統(tǒng)計(jì)不同品種大球蓋菇單、雙核菌絲體菌落形態(tài)的特性。 如圖2 及表4,大球蓋菇的不同品種菌落形態(tài)差別明顯,而同一品種的單核體和雙核體在菌落形態(tài)上差別較小。 使用鏡檢培養(yǎng)基,提高了培養(yǎng)基的透明度,觀察更為清晰明顯,但生長(zhǎng)速度較普通PDA 培養(yǎng)基慢?！练省贩N菌絲生長(zhǎng)非常稀疏,菌落顏色為白色,有同心輪紋,微凸起,邊緣整齊,單核和雙核體的菌落形態(tài)略微有差別,雙核體的菌落邊緣有氣生菌絲生長(zhǎng),但單核體邊緣菌絲匍匐,生長(zhǎng)不旺盛,多為基內(nèi)菌絲。 ‘大T’品種菌絲生長(zhǎng)旺盛,濃密,長(zhǎng)勢(shì)良好,邊緣整齊,菌落呈放射狀,圓形,平坦,單雙核無明顯差異?！哙]’品種單雙核菌絲體差異較大:單核體菌落呈放射狀,平坦,基內(nèi)菌絲多,氣生菌絲較少,菌絲稀疏;雙核體菌絲生長(zhǎng)旺盛,菌落白色,邊緣不整齊,呈絨氈狀,氣生菌絲發(fā)達(dá),菌絲濃密。

圖2 不同品種大球蓋菇的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of different strains of Stropharia rugosoannulata

表4 不同品種大球蓋菇的菌落特性Table 4 Colony characteristics of different strains of Stropharia rugosoannulata

3 討論與結(jié)論

大球蓋菇在溫度較高的環(huán)境下原基難分化、菌蓋易開傘,品質(zhì)和產(chǎn)量均急劇下降[12],為解決大球蓋菇發(fā)展的瓶頸,可通過快速定向育種的途徑豐富大球蓋菇種質(zhì)資源,單核原生質(zhì)體成為探究遺傳背景及開展原生質(zhì)體技術(shù)育種的重要前提。

原生質(zhì)體再生率的高低是原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。 本研究采用0.6 mol∕L 的甘露醇做滲透壓穩(wěn)定劑,制備菌齡3 d 的菌絲和含量為1.5%的酶液,在30 ℃恒溫水浴鍋中酶解3 h,濾液在4 ℃、4 000 r∕min條件下離心15 min,再生培養(yǎng)基在普通的PDA 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入VB1、VB6,以促進(jìn)進(jìn)原生質(zhì)體再生。鄒彰毅等[18]在再生培養(yǎng)基中添加纖維二糖和VB1,提高了姬松茸原生質(zhì)體的再生率,此結(jié)果在本試驗(yàn)中再次得到驗(yàn)證。 大球蓋菇中供試驗(yàn)的3 個(gè)不同品種再生率均較高,‘土肥’品種再生率最高,達(dá)1.37%,‘高郵’品種再生率次之為1.13%,‘大T’品種的再生率最低為0.90%。 許梅[19]用雙層平板法得到大球蓋菇再生率為0.96%,遠(yuǎn)低于‘土肥’和‘高郵’兩個(gè)品種,進(jìn)一步說明大球蓋菇的再生率與不同品種相關(guān),本試驗(yàn)原生質(zhì)體再生的配方為最佳條件。 茶樹菇再生菌落中異核體與單核體存在時(shí)間差,8—10 d 異核體菌落先生成,10 d 之后產(chǎn)生單核體菌落[20]。 但是,本試驗(yàn)表明大球蓋菇原生質(zhì)體再生速度較快,原生質(zhì)體單核化率高,且單核體和雙核體再生的菌落幾乎同時(shí)形成,這與閆培生等[11]和Yan 等[21]的結(jié)果相符。

原生質(zhì)體單核化是快速獲得單核體雜交親本的有效手段,已從許多食用菌中通過單核化獲得單核體。 本研究獲得了不同品種大球蓋菇的原生質(zhì)體單核體,供試驗(yàn)的三個(gè)大球蓋菇品種的單核化率‘大T’品種高達(dá)85.2%;‘土肥’品種單核化率次之,為66.0%;‘高郵’品種單核化率最低,為59.8%。 ‘大T’品種單核化率是已報(bào)道過的食用菌中單核化率最高的,這也豐富了食用菌原生質(zhì)體單核化和遺傳育種研究的內(nèi)容。 ‘土肥’和‘高郵’品種的單核體與雙核體在菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速度上有所差別,‘土肥’品種菌絲生長(zhǎng)局限,非常稀疏,菌落顏色為白色,有同心輪紋,微凸起,邊緣整齊,單核和雙核體的菌落形態(tài)略微有差別,雙核體的菌落邊緣有氣生菌絲生長(zhǎng),但單核體邊緣菌絲匍匐,生長(zhǎng)不旺盛,多為基內(nèi)菌絲。 ‘高郵’品種菌絲蔓延生長(zhǎng),邊緣不整齊,菌落白色,培養(yǎng)皿上單雙核菌絲體差異較大,單核體菌落呈放射狀,平坦,基內(nèi)菌絲多,氣生菌絲較少,菌絲稀疏,雙核體菌落呈絨氈狀,氣生菌絲發(fā)達(dá),菌絲濃密。 目前,已使用本試驗(yàn)選育的原生質(zhì)體單核體進(jìn)行了高溫菌種的選育,并獲得高溫大球蓋菇品種[12]。

將不同品種大球蓋菇原生質(zhì)體單核化可獲得遺傳背景單一的單核體,初步探究單核體的菌落特性,后續(xù)對(duì)其進(jìn)行分類確定交配型,不僅可為構(gòu)建大球蓋菇遺傳體系提供原材料,同時(shí)還可為定向育種提供更多材料,進(jìn)一步豐富大球蓋菇種質(zhì)資源。