大球蓋菇菌渣原位還田對土壤理化性質(zhì)及真菌多樣性的影響

洪 琦,張津京,郝海波,趙 靜,陳 輝**,趙 勇

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海 201403;3 上海光明森源生物科技有限公司,上海 201408)

我國是食用菌生產(chǎn)大國,2019 年我國食用菌總產(chǎn)量已超過3 700 萬t。 在食用菌產(chǎn)出的同時,食用菌栽培剩下的培養(yǎng)料(菌渣)隨著食用菌產(chǎn)量的提高也逐年增加,目前已超過8 000 萬t[1]。 菌渣中有大量的有機(jī)質(zhì),富含植物生長所需且易于吸收利用的氨基酸、維生素、碳氮化合物及其他微量元素,是一種良好的有機(jī)肥原料[2]。 目前,菌渣的循環(huán)利用率并不高,通常以丟棄或燃燒的方式進(jìn)行處理,這不僅造成資源的浪費,也對環(huán)境造成污染。 因此,菌渣的循環(huán)利用是目前食用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟需解決的問題。

研究表明,食用菌的廢菌棒能夠有效提高土壤的pH、有機(jī)質(zhì)以及速效氮、磷、鉀的含量,改善土壤的理化性質(zhì),提高肥力[3]。 香菇渣和平菇渣能夠顯著改善土壤肥力,尤其對提高速效鉀和全磷的含量有顯著效果,且能夠降低土壤pH[4]。 菌渣與化肥混合施用不僅能夠有效改良土壤,顯著提高土壤中活性有機(jī)碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(LOC)以及全氮、堿解氮和有效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[5],還能優(yōu)化肥料在土壤中的轉(zhuǎn)化過程[6]。菌渣還田對微生物和酶活性也有一定影響。 菌渣還田后,土壤中脫氫酶、磷酸酶、脲酶等活性顯著提升,硝酸還原酶的活性受到抑制[7-10];土壤中細(xì)菌多樣性水平得到顯著提升,但真菌多樣性受到菌渣種類和試驗條件的影響呈現(xiàn)出不同的結(jié)果[7-9]。

大球蓋菇(Stropharia rugosoannulataFarl. Ex Murrill),又名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇、斐氏球蓋菇等,為球蓋菇科球蓋菇屬食用菌[11]。 在我國,大球蓋菇主要種植在西南地區(qū)和東北地區(qū)[12]。 大球蓋菇中必需氨基酸種類齊全,含有多種生物活性物質(zhì),具有很高的營養(yǎng)價值,并且其抗氧化、降血糖的藥理作用使其有發(fā)展成為藥物和保健食品的潛力[13]。 同時,大球蓋菇擁有良好的抗雜和抗逆能力,栽培技術(shù)不復(fù)雜,能高效降解纖維素和木質(zhì)素等,可有效解決農(nóng)林廢棄物的循環(huán)利用問題[14]。 據(jù)中國食用菌協(xié)會2019年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2018 年大球蓋菇產(chǎn)量為57 151.21 t,增長率為96.92%,呈快速增長趨勢。 隨著大球蓋菇產(chǎn)量的快速增加,菌渣的產(chǎn)生量也迅速增長。 目前,對大球蓋菇的研究多集中在栽培種植和生物活性方面,而對其菌渣利用及還田后對土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性影響的報道甚少。 本試驗研究大球蓋菇菌渣還田對土壤理化性質(zhì)和真菌多樣性的影響,以期為大球蓋菇菌渣還田及其有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大球蓋菇栽培及菌渣還田后的土壤取樣

采用稻秸稈作為栽培大球蓋菇的培養(yǎng)料,其使用量為2.25 ×105kg∕hm2。 播種后,根據(jù)實際情況采取相應(yīng)措施,使堆放發(fā)酵的溫度保持在22—28 ℃,培養(yǎng)料含水量為70%—75%,覆土,調(diào)整其相對濕度至90%—95%,溫度為12—25 ℃[15]。 采收后,剩余的菌渣量為2.7 ×104kg∕hm2。 在大球蓋菇菌渣原位還田1 個月后,分別從種植過大球蓋菇的土壤(處理組)和未種植大球蓋菇的土壤(對照組,CK)中收集土壤樣品。 按照十字取樣法將處理組的土壤分為橫向(HT)和縱向(ZT),在HT 和ZT 兩個方向分別選取5 個點進(jìn)行取樣,將所取樣品混合均勻,記為JZ,取土深度為0—20 cm。

1.2 土壤pH 的測定

參照NY∕T 1377—2007《土壤pH 的測定》,采用電位法測定土壤pH。

1.3 土壤有機(jī)質(zhì)含量的測定

土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定。 在加熱條件下,土壤中的有機(jī)質(zhì)被過量重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化,重鉻酸鉀中的Cr4+被還原為Cr3+,其含量與樣品中有機(jī)質(zhì)的含量成正比,用分光光度計于585 nm 波長處測定吸光度,計算有機(jī)質(zhì)含量[16]。

1.4 土壤氮磷鉀含量的測定

參照GB 7173—1987《土壤全氮測定法(半微量開氏法) 》測定土壤全氮含量;速效氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定[17];用混合酸高溫消解土壤樣品,采用鉬銻抗比色法測定全磷含量[18];參照NY∕T 1121.7—2014《土壤檢測 第7 部分:土壤有效磷的測定》測定速效磷含量;參照LY∕T 1234—2015《森林土壤鉀的測定》測定全鉀含量;速效鉀含量采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定[19]。

1.5 土壤酶活性的測定

土壤中性磷酸酶(S-NP)活性采用磷酸苯二鈉比色法測定[7];土壤脫氫酶(S-DHA)活性采用TTC 比色法,用分光光度計于485 nm 處測定其吸光值[8]。

1.6 土壤真菌多樣性的測定與分析

參考曹敏等[20]的方法,采用CTAB 法提取樣本中的真菌DNA[21],提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度和濃度的檢測。 以各樣品總DNA 為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶有barcode 的特異引物ITS1F(5’-CCTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)對樣品ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR 條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸45 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。 每個樣本重復(fù)5 次,將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物,再用Tris-HCl 洗脫,用2%瓊脂糖電泳檢測。 根據(jù)電泳檢測結(jié)果,將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量,按PCR 產(chǎn)物測序量進(jìn)行相應(yīng)比例的混樣。 在Illumina MiSeq 測序平臺進(jìn)行高通量測序,再過濾處理得到優(yōu)化序列。 去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU 聚類分析,對OTU 的代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。 樣品DNA 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 26 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇菌渣還田對土壤pH 的影響

大球蓋菇菌渣原位還田后,處理組土壤pH 為7.45,與CK(pH 7.56)相比顯著降低,表明大球蓋菇菌渣原位還田能夠降低土壤pH,中和土壤酸堿度。

2.2 大球蓋菇菌渣還田對土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響

土壤有機(jī)質(zhì)含量是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)之一,大球蓋菇菌渣原位還田后,處理組土壤有機(jī)質(zhì)含量為2.213%,與CK(有機(jī)質(zhì)含量為1.720%)相比顯著增加了28.66%,表明大球蓋菇菌渣原位還田能夠提高大田土壤的有機(jī)質(zhì)含量,增加大田土壤肥力。

2.3 大球蓋菇菌渣還田對土壤氮、磷、鉀含量的影響

如表1 所示,處理組土壤中全氮、全磷、全鉀、速效氮、堿性速效磷和速效鉀含量分別為0.157%、0.347 mg∕g、5.750 mg∕g、30.992 mg∕kg、26.567 mg∕kg 和85.252 mg∕kg,比CK 分別提高了180.4%、46.4%、3.9%、71.4%、228.3%和33.6%,均差異顯著,表明大球蓋菇菌渣還田能夠顯著提高土壤養(yǎng)分含量。

表1 菌渣還田對土壤氮、磷、鉀含量的影響Table 1 Effects of returning fungus residue to the field on the content of soil nitrogen,phosphorus and potassium

2.4 大球蓋菇菌渣還田對土壤酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶,其活性高低直接影響著土壤中有效磷的供應(yīng)狀況,是評價土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)[7]。 研究發(fā)現(xiàn):大球蓋菇菌渣還田處理組土壤中性磷酸酶活性為3.927 μmol∕(d·g),比CK[2.700 μmol∕(d·g)]提高了45.4%,結(jié)合其堿性速效磷含量也顯著高于CK,說明大球蓋菇菌渣還田顯著提高了土壤堿性速效磷的轉(zhuǎn)化。

土壤脫氫酶屬于氧化還原酶系,可以從一定的基質(zhì)中析出氫或氫的供體進(jìn)行氧化作用,能夠反映土壤微生物新陳代謝的整體活性,常作為衡量微生物氧化還原能力的指標(biāo)[22]。 大球蓋菇菌渣還田處理組土壤脫氫酶活性為0.035 mg∕(d·g),比CK[0.026 mg∕(d·g)]提高了34.6%,差異顯著。

綜上,大球蓋菇菌渣還田可以顯著提高土壤中性磷酸酶和土壤脫氫酶的活性,進(jìn)而增強(qiáng)土壤養(yǎng)分的分解和轉(zhuǎn)化,提升土壤肥力。

2.5 大球蓋菇菌渣還田對土壤真菌多樣性的影響

主成分(PCA)分析可以反映樣本間微生物群落組成的差異和距離,群落組成高度相似的樣品彼此靠近,群落組成差異越大,樣品間的距離越大。從圖1 可以看出,第一主成分和第二主成分貢獻(xiàn)度之和為83.73%,能夠較好地反映樣本中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。 3 組樣本的群落組成均比較集中,說明各組樣本的內(nèi)部差異小。 PC1 能解釋65.39%差異的原因為處理組聚集在PC1 正軸,而CK 聚集在PC1 負(fù)軸,說明PC1 是區(qū)分CK 和處理組差異的主要因素;PC2 則體現(xiàn)了處理組的組內(nèi)差異。

圖1 土壤樣品的PCA 分析Fig.1 PCA analysis of soil samples

Shannon-Wiener 曲線是利用各樣本的測序數(shù)量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建的曲線,能夠反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。 從圖2A 可以看出,曲線在測序基因數(shù)量為20 000 時已趨于平坦,說明測序數(shù)量已經(jīng)足夠大,可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。 從圖2B 可知,處理組HT 和ZT 的Shannon 指數(shù)均低于CK,表明大球蓋菇菌渣還田會降低土壤的真菌多樣性水平。

圖2 菌渣還田對土壤真菌多樣性的影響Fig.2 Effects of fungus residue returning to the field on fungal diversity in soil

2.6 大球蓋菇菌渣還田對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

如圖3 所示,在3 組樣本中,Hypocreales(肉座菌目)、Sordariales(糞殼菌目)、Ascomycota(子囊菌門)3種菌群是主要的優(yōu)勢菌群,相對豐度之和約占總豐度的60%。 與CK 相比,大球蓋菇菌渣還田后,土壤中Hypocreales(肉座菌目) 的相對豐度明顯增加,占總豐度的25%—50%;Capnodiales(煤炱目)、Saccharomycetales(酵母目)、Pezizales(盤菌目)、Russulaceae(紅菇科)的相對豐度也大幅增加;Incertae_Sedis、Pseudoplatyophyra(擬匙口蟲屬)、Aleuria(網(wǎng)孢盤菌屬)、Onygenales(爪甲團(tuán)囊菌目)、Sordariomycetes(糞殼菌綱)、Trichosporon(絲孢酵母屬)的相對豐度明顯下降。

圖3 菌渣還田對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響Fig.3 Effects of fungus residue returning to the field on the structure and composition of fungal community in soil

2.7 大球蓋菇菌渣還田后土壤真菌豐度分布分析

如圖4 所示,與CK 相比,處理組土壤中優(yōu)勢菌群發(fā)生了改變,各組樣本均有其不同于其他樣本的優(yōu)勢菌群。 處理組土壤中Incertae_Sedis、Pseudoplatyophyra(擬匙口蟲屬)、Aleuria(網(wǎng)孢盤菌屬)、Onygenales(爪甲團(tuán)囊菌目)、Trichosporon(絲孢酵母屬)、Sordariomycetes(糞殼菌綱)、Sordariales(糞殼菌目)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)等菌群豐度減小,而Hypocreales(肉座菌目)、Russulaceae(紅菇科)、Pezizales(盤菌目)、Saccharomycetales(酵母目)、Bursaria(袋形蟲屬)等菌群豐度增加,成為優(yōu)勢菌群。

圖4 菌渣還田后土壤真菌豐度分布分析Fig.4 Distribution of fungal abundance in soil after fungus residue returning to the field

3 討論

本研究表明,大球蓋菇菌渣還田對土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量有著顯著影響。 大球蓋菇菌渣還田后,土壤pH 顯著降低,表明大球蓋菇菌渣對于降低土壤酸堿度有明顯作用,與姜淑霞等[23]研究結(jié)果一致。土壤有機(jī)質(zhì)含量對土壤的理化性質(zhì)有著重要影響,不僅影響土壤的結(jié)構(gòu)、持水量和吸熱、散熱能力[24],還與土壤中氮、磷等含量有顯著相關(guān)性[25],在衡量培肥效果時,土壤有機(jī)質(zhì)的提高量是一個重要指標(biāo)[26]。與CK 相比,處理組土壤中有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀及其速效成分含量均顯著增加。 前人[9,27-29]研究表明:大球蓋菇能夠使土壤中有機(jī)質(zhì)和有效磷含量持續(xù)增加,菌渣的施用能夠有效增加水稻生長中后期土壤中有效鉀的供應(yīng)能力,與本試驗結(jié)果一致。

土壤酶參與有機(jī)質(zhì)的降解、礦化及營養(yǎng)元素循環(huán)等過程,是土壤中最活躍的有機(jī)成分之一,是與土壤肥力和環(huán)境質(zhì)量息息相關(guān)的重要指標(biāo)。 本研究中,處理組土壤中的磷酸酶和脫氫酶活性均顯著高于CK,推測是因為菌渣本身的營養(yǎng)物質(zhì)分解后改善了土壤性狀,并且菌渣中含有大量的菌體蛋白,為土壤微生物的生長繁殖提供了大量的碳源和氮源,使得土壤微生物數(shù)量增加、活性增強(qiáng),從而促進(jìn)了酶活性的提高[8]。 可見,大球蓋菇菌渣還田能夠提高土壤酶的活性,增強(qiáng)土壤肥力,有利于土壤生態(tài)環(huán)境的改善。 多項研究表明,菌渣還田能夠提高土壤中脲酶、磷酸酶、脫氫酶、幾丁質(zhì)酶等大多數(shù)土壤酶的活性[7-9]。 但有一些土壤酶在不同研究中呈現(xiàn)不同的結(jié)果:胡留杰等[9]研究認(rèn)為,菌渣還田抑制了土壤過氧化氫酶和蔗糖酶的活性;鄧歐平等[10]研究表明,菌渣還田能夠顯著提高土壤蔗糖酶的活性,且酶活性與土壤養(yǎng)分之間有良好的相關(guān)性;而謝放等[7]研究認(rèn)為,香菇菌渣還田對土壤蔗糖酶的活性影響不明顯。 以上研究結(jié)果不同可能與菌渣種類、土壤類型、種植制度及氣候條件等因素有關(guān)。

高通量測序分析表明:菌渣還田處理的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化,與CK 差異明顯。 大球蓋菇菌渣還田對真菌的生長有一定的抑制作用,與CK 相比,處理組土壤真菌多樣性降低,這在一定程度上增強(qiáng)了土壤的抑病能力,說明菌渣還田可有效改善農(nóng)田土壤的生態(tài)環(huán)境,與胡留杰等[9]、賈明等[30]研究結(jié)果一致。 但有研究認(rèn)為,菌渣還田顯著增加了土壤真菌數(shù)量[31],其原因可能與菌渣種類、土壤結(jié)構(gòu)以及土壤性質(zhì)有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

綜上,大球蓋菇菌渣還田一方面為土壤提供營養(yǎng)物質(zhì),提高了土壤中有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀的含量;另一方面大球蓋菇菌絲作為一種真菌進(jìn)入土壤提高了土壤的酶活性,促進(jìn)了土壤營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。 同時,大球蓋菇菌絲進(jìn)入土壤抑制了土壤中其他真菌的生長,使土壤真菌多樣性降低,減少了植物病原菌的數(shù)量,增強(qiáng)了土壤的抑病能力。