猴樟CbP5CR基因克隆及生物信息學(xué)分析

黃東莉 何敏 紀(jì)洪玲 陸林燕 嚴(yán)功力 張穎 張麗華

摘要 為研究猴樟CbP5CR蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能，克隆猴樟CbP5CR基因CDS序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，編碼269個(gè)氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，相對(duì)分子量28.01 kD，理論等電點(diǎn)7.03，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不存在氨基酸無序化區(qū)域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)。

關(guān)鍵詞 猴樟；轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào) S792? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）04-0022-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）是我國重要的綠化樹種、經(jīng)濟(jì)樹種和林用樹種，主要分布于我國南方地區(qū)。近幾年，猴樟產(chǎn)業(yè)因其生長速度快、抗性強(qiáng)而迅速發(fā)展起來[1]，并逐漸向我國長江以北地區(qū)推廣應(yīng)用，而北方地區(qū)堿性土壤環(huán)境限制了猴樟的生產(chǎn)栽培。植物耐堿性能與其根系適應(yīng)堿脅迫的策略密切相關(guān)，包括膜穩(wěn)定性、抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)和離子平衡等方面，脯氨酸的生物合成和積累是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的主要方式，逆境脅迫下可以作為滲透調(diào)節(jié)物防止細(xì)胞脫水，還是生物大分子的保護(hù)劑和羥基清除劑，同時(shí)還可為植物從脅迫條件恢復(fù)而提供氮源、碳源和還原劑，耐堿性強(qiáng)的品種含有更高的脯氨酸含量[2]。以往研究認(rèn)為，在多種脅迫條件下P5CR、P5CS、δ-OAT基因的表達(dá)量增加，而PDH基因的表達(dá)量降低，脯氨酸積累[3]，但植物體內(nèi)脯氨酸的積累與植物的抗逆性之間的關(guān)系在不同植物之間存在差異，其在賦予耐受性方面的實(shí)際作用仍然存在爭(zhēng)議。該研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆出猴樟脯氨酸合成關(guān)系酶基因序列，并分析其特性，以期為猴樟耐堿性機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為耐堿猴樟變種2年生種苗，于2019年2月上旬播種，2021年4月上旬進(jìn)行移栽。于2022年3月10日取猴樟枝條頂部幼嫩芽片液氮速凍后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA后，用TR Prime Mix（random primer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

1.2 基因克隆

根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得在耐堿性猴樟變種葉片中調(diào)控脯氨酸合成的關(guān)鍵酶基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDS擴(kuò)增引物［F（5'—3'）：ATGGCAACAGCAGAGACG；R（5'—3'）：CTAGAGAGTGTGCTACTC］，PCR反應(yīng)采用25 μL體系[4]，反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TSINGKE，北京），挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）將猴樟CbP5CR基因翻譯成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)氨基酸序列的理化性質(zhì)和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測(cè)；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用Fold Index 軟件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折疊無序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9. 0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件生成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型；利用MEGA 7.0作出與CbP5CR的CDS序列同源性較近的物種序列進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴樟CbP5CR基因的克隆與重組載體構(gòu)建

根據(jù)克隆后的凝膠電泳圖片（圖1），以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到1條約900 bp的條帶，片段大小與預(yù)期一致，通過測(cè)序得到長864 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因進(jìn)行比對(duì)，序列一致性高達(dá)98.88%，具備P5CR的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果顯示，所克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，推導(dǎo)編碼269個(gè)氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbP5CR。

2.2 猴樟CbP5CR蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)分析。利用Protparam軟件對(duì)猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，猴樟CbP5CR蛋白相對(duì)分子量28.01 kDa，理論等電點(diǎn)7.03，表明CbP5CR基因編碼蛋白為中性，化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，原子總數(shù)為3 984，不穩(wěn)定指數(shù)值為37.12，不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)為不穩(wěn)定蛋白，因而該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。脂溶指數(shù)為99.85，CbP5CR基因編碼蛋白為脂溶性蛋白，帶負(fù)電荷的殘基（asp+glu）總數(shù)為26，帶正電荷的殘基（arg+lys）總數(shù)為26。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明（圖2），CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，具備脯氨酸合成酶功能。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)猴樟CbP5CR基因編碼蛋白的親水性進(jìn)行分析（圖3），總平均親水性值（GRAVY）為0.184，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。通常認(rèn)為，氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)，猴樟CbP5CR基因編碼蛋白各氨基酸序列中第43、44位氨基酸分值最低為-2.878，親水性值最強(qiáng)；第99位氨基酸分值最高，為2.544，疏水性最強(qiáng)，就整體分析而言，蛋白序列中36～49、105～115、139～150、218～233位氨基酸均為連續(xù)排列的親水性氨基酸，推測(cè)猴樟CbP5CR基因編碼蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbP5CR蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4），該蛋白組成中135個(gè)氨基酸（50.19%）為α-螺旋、30個(gè)氨基酸（11.15%）為延伸主鏈，104個(gè)氨基酸（38.66%）為隨機(jī)卷曲，因而猴樟CbP5CR主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成；利用Fold Index對(duì)猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)行氨基酸序列折疊無序化分析（圖5），結(jié)果表明，該蛋白不存在氨基酸無序化區(qū)域，折疊無序化指數(shù)為0.299。利用Net Phos 3.1（https：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（圖6），該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點(diǎn)為45個(gè)，其中包含32個(gè)絲氨酸（S）、11個(gè)蘇氨酸（T）和2個(gè)酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果和同源建模分析（圖7），CbP5CR編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與5bse.1.A的氨基酸序列一致性達(dá)68.28%，5bse.1.A序列的編碼蛋白為Pyrroline-5-carboxylate reductase（P5CR）。

2.2.3 猴樟CbP5CR蛋白序列同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)猴樟CbP5CR蛋白序列進(jìn)行blastp比對(duì)，根據(jù)結(jié)果下載比對(duì)得分較高的氨基酸序列，再通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建CbP5CR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白在進(jìn)化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)化樹中大概分3類，其中猴樟與沉水樟歸為一類，其次是絨毛狀煙草、煙草、番茄、蒂羅花、黃連、博羅回和罌粟歸為一類，與猴樟親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的石刁柏、黃石斛、深圳擬蓮、薯蕷、小果野芭蕉、油棕和姜?dú)w為一類。

3 結(jié)論與討論

脯氨酸是植物體內(nèi)水合能力最強(qiáng)的氨基酸，具有分子量小、對(duì)細(xì)胞無毒副作用等特征，外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)植物光合能力和水分利用能力[5]，還能通過誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力。在高等植物體內(nèi)，脯氨酸通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中合成，在線粒體內(nèi)進(jìn)行降解，吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶（δ-OAT）和脯氨酸脫氫酶（ProDH）基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因[2]。該研究結(jié)果表明，克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框，編碼269個(gè)氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域，CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7，相對(duì)分子量28.01 kDa，理論等電點(diǎn)7.03，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不存在氨基酸無序化區(qū)域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究猴樟脯氨酸代謝調(diào)控耐堿性機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

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[3] KIARASH J G，AMIN B，MALIHE A，et al.Effects of salinity stress on proline content and expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase and vacuolar-type H+ subunit E genes in wheat[J].Plant Genetic Resources，2020，18（5）：334-342.

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（責(zé)編：王慧晴）