烘烤期煙葉霉?fàn)€病生防菌株的篩選與應(yīng)用

尚海麗,楊發(fā)祥,,華小兵,郭山虎,趙崇鈞,盤文政,*,李 誠,趙學(xué)通,張 琪,肖勇飛,朱永立,張志紅,李榮海

(1.云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司,云南 昆明 650217;2.云南云葉化肥股份有限公司,云南 昆明 650217;3.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,湖南 長沙 410014)

0 引言

【研究意義】煙葉烘烤過程中常發(fā)生烤青煙、蒸片煙、黑糟煙、掛灰煙及煙葉霉?fàn)€等“烤壞煙”,對煙葉生產(chǎn)和煙農(nóng)造成重大損失[1-3]。其中,煙葉霉?fàn)€是由于煙葉烘烤過程中變黃期溫度過低、相對濕度過高,煙葉受病原微生物侵染引起的潛在病害,極大降低煙葉的使用價值[4-5]。因此,開展霉?fàn)€病研究,開發(fā)有效的防治措施,對減少煙農(nóng)損失、提高煙葉質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】長期以來,由病原物引起的煙葉霉?fàn)€病及其造成的損失未引起人們足夠的重視,常常被認為是“烘烤不當(dāng)”所造成的[5]。目前,關(guān)于烘烤期間煙葉霉?fàn)€病防治措施的研究主要集中在優(yōu)化烘烤工藝、噴施藥劑和熏蒸滅菌等方面。針對變黃期低溫高濕的狀況,丁海龍[6]研究提出稀裝煙、提前排濕及穩(wěn)轉(zhuǎn)火等技術(shù)措施以控制煙葉霉?fàn)€病;黃寧等[7]探索出點火后快速升溫、縮短變黃期及降低濕度等技術(shù)措施避免煙葉的霉變;蘇家恩等[8]對比不同抗微生物制劑對烤后煙葉霉?fàn)€病的防控效果表明,天然抗微生物制劑防控效果優(yōu)于化學(xué)合成抗微生物制劑,天然抗微生物制劑中0.2%納他霉素防控效果最好,達87.99%。王永棟等[9]提出,在嚴(yán)格控制裝煙密度的前提條件下,烤前、烤中采用二氧化氯熏蒸消毒,對霉?fàn)€病的總體防治效果達62.62%～69.57%。已有研究指出,在煙葉上添加優(yōu)勢微生物,對煙葉中的霉菌有明顯抑制作用,可用于倉儲過程中煙葉霉變的防治[10]。經(jīng)過近幾年的持續(xù)研究,逐步明確各省主要煙區(qū)烘烤期煙葉霉?fàn)€的主要病原菌是米根霉(Rhizopusoryzae)[11-13]?！狙芯壳腥朦c】上述技術(shù)措施防控?zé)熑~霉?fàn)€病均有一定的局限性,通過快速升溫降低濕度控制霉?fàn)€病發(fā)生的方法,需解決變黃期縮短與烤后煙葉質(zhì)量之間的矛盾;化學(xué)藥劑消毒存在安全風(fēng)險;采用二氧化氯熏蒸消毒,在鮮煙葉帶菌的情況下防效不理想。生防菌具有繁殖快速、安全無毒、抑菌殺菌等特點,因此,篩選出烘烤過程中對煙葉霉?fàn)€病具有較好防控效果的生防菌,有利于科學(xué)防控?zé)熑~霉?fàn)€病及保障煙葉質(zhì)量安全。【擬解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)以菌治菌的原理,采用共培養(yǎng)的方法篩選對米根霉具有明顯抑制作用的生防菌株,并結(jié)合室內(nèi)和田間應(yīng)用研究其防治效果,以期探明烘烤期煙葉霉?fàn)€病生防功能菌株的種類及其防治效果,為高效、安全防治煙葉霉?fàn)€病,降低烘烤損失,增加煙農(nóng)收入,提高煙葉安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試生防菌 15株生防菌均為耐熱芽孢桿菌,保存于云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司菌種庫。

1.1.2 供試病原菌 煙葉霉?fàn)€病病原菌米根霉,課題組前期從云南省楚雄州武定縣白路鎮(zhèn)發(fā)生霉?fàn)€病的煙葉中分離、純化獲得,保存于云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司菌種庫。

1.1.3 供試健康煙葉 煙葉樣品(含葉柄)采自云南省楚雄州武定縣白路鎮(zhèn)平地村,烤煙品種為云煙87。

1.2 方法

1.2.1 生防菌篩選 用無菌挑針挑取供試生防菌菌株,劃線接種于新鮮LB平板內(nèi),置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3 d。制備濃度為105cfu/mL的米根霉孢子懸浮液,并取100 μL孢子液涂布于PSA平板,置于32℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 h;然后取出平板,用無菌挑針分別挑取活化的15株生防菌單菌落分別接種于PSA平板上,置于32℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng);2 d后觀察平板內(nèi)細菌的生長情況及是否出現(xiàn)抑菌圈。每個處理3次重復(fù)。

1.2.2 生物防治

1) 室內(nèi)。用自來水和無菌水依次沖洗田間采集的煙柄3次,并在70%酒精中浸泡30 s后用無菌水沖洗3遍,放在超凈工作臺內(nèi)自然風(fēng)干(下同)。選取抑菌效果最好的菌株制備104cfu/mL的米根霉孢子懸浮液,均勻噴施在煙柄表面,待自然風(fēng)干后分別置于濃度為107cfu/mL(A1)、106cfu/mL(A2)和105cfu/mL(A3)的生防菌液內(nèi)浸泡10 min后取出,再次自然風(fēng)干后轉(zhuǎn)入50 mL無菌燒杯內(nèi),用保鮮膜封口,再用挑針在其上扎20個小孔后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗保濕培養(yǎng)。每天觀察菌落生長動態(tài),4 d后記錄各處理煙柄的發(fā)病情況。每個處理10個煙柄,3次重復(fù)。以用無菌水浸泡的煙柄作為對照(CK)。結(jié)合常規(guī)葉面病害統(tǒng)計方式設(shè)病情分級標(biāo)準(zhǔn):0級,未感染;1級,發(fā)病面積占總面積的5%以下;3級,發(fā)病面積為5%～25%;5級,發(fā)病面積為25%～50%;7級,發(fā)病面積為50%～75%;9級,發(fā)病面積占總面積的75%以上。計算病情指數(shù),發(fā)病率和相對防治效果。

發(fā)病率=發(fā)病樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100%

病情指數(shù)=[∑(各級樣本數(shù)×相應(yīng)級數(shù))/(總樣本數(shù)×9)]×100

相對防治效果=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%

2) 田間。在云南省楚雄州武定縣隨機選取一個自然發(fā)病烤房進行田間防治試驗。試驗烤房為普通氣流上升式4層密集式烤房,裝煙室規(guī)格為8.0 m×2.7 m×4.1 m,裝煙層距地面高度分別為1.2 m、2.0 m、2.8 m和3.6 m。制備活菌數(shù)為1.5×106cfu/mL、7.5×105cfu/mL及1.5×105cfu/mL生防菌液備用。采用浸泡葉柄和噴淋葉柄2種方式進行煙葉霉?fàn)€病防治:第1種為浸泡葉柄,將田間采集的新鮮煙葉基部(40～50 cm)分別在不同濃度生防菌液中浸泡10 min后取出,然后將煙葉在陰涼處晾干后按常規(guī)烘烤方式烘烤;第2種為噴淋葉柄,將不同濃度的生防菌液在烤煙烘烤前進行葉柄噴淋,噴淋完成后將煙葉在陰涼處晾干,然后按常規(guī)方式烘烤。以常規(guī)作對照,即不施用生防菌液,按照常規(guī)采烤方法進行烘烤。田間試驗方案設(shè)置見表1。每個處理3次重復(fù),每個重復(fù)100片煙葉,隨機排列掛牌標(biāo)記。初烤結(jié)束后,參考王永棟[12]的方法記錄發(fā)病情況,并計算病情指數(shù)、發(fā)病率和相對防效。煙葉霉?fàn)€病病情等級劃分:0級,正常煙葉;1級,煙稈發(fā)霉小于1 cm,葉片不發(fā)病;2級,煙稈發(fā)霉大于1 cm,葉片不發(fā)病;3級,煙稈發(fā)霉,且葉片發(fā)霉面積達1%～25%;4級,煙稈發(fā)霉,且葉片發(fā)霉面積達26%～50%;5級,煙稈發(fā)霉,且葉片發(fā)霉面積達50%以上。

發(fā)病率=發(fā)病葉數(shù)/調(diào)查總?cè)~數(shù)×100%

病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×5)]×100

相對防治效果=[(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]×100%

表1 田間試驗處理設(shè)置Table 1 Treatment design for the field test

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016整理相關(guān)數(shù)據(jù),采用SPSS 22.0進行單因素方差分析,各處理間采用Duncan's新復(fù)極差法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的抑制效果

從表2看出,15株生防菌對米根霉的抑菌圈直徑為0.00～3.03 cm,其中,有4株菌株對米根霉有拮抗作用,其分別是解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、膠質(zhì)芽孢桿菌YWF-17-0005及枯草芽孢桿菌YWF-17-0011,其抑菌圈直徑為0.94～3.03 cm,依次為YWF-17-0001>YWF-17-0011>YWF-17-0005>YWF-17-0006,以解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的抑菌效果最好,抑菌圈直徑達3.03 cm,顯著高于菌株YWF-17-0006和YWF-17-0005,與菌株YWF-17-0011差異不顯著,其余菌株間差異不顯著。解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001可作為備選菌株進行后續(xù)研究。

表2 不同生防菌株對米根霉的抑制效果Table 2 Inhibition effect of different biocontrol strains against R. oryzae

2.2 生防菌株對米根霉的防治效果

2.2.1 室內(nèi)防效 觀察發(fā)現(xiàn),在接種培養(yǎng)2 d后,對照(CK)煙葉的煙柄表面長出微量白色菌絲;隨培養(yǎng)時間的推移,霉?fàn)€病的發(fā)病情況不斷加重。各處理(A1～A3)較對照晚1 d左右發(fā)病,且米根霉的感染率大幅降低;4 d后,各處理的產(chǎn)孢量較對照明顯減少。從表3看出,A1～A3煙葉的發(fā)病率為0.00%～23.22%,病情指數(shù)為0.00～2.59,均表現(xiàn)為A3>A2>A1,且均顯著低于CK(80.00%,53.33),A1顯著低于A3和A2,A2與A3差異不顯著。A1～A3的相對防治效果為95.14%～100.00%,表現(xiàn)為A1>A2>A3,即隨解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001處理濃度降低,對米根霉的室內(nèi)防治效果呈下降趨勢,當(dāng)濃度為105cfu/mL時(A3)防治效果最差;當(dāng)濃度達107cfu/mL時(A1),煙柄未出現(xiàn)霉變現(xiàn)象,防治效果達100.00%。表明,較低濃度的解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001菌液對米根霉有較好的防治效果。

表3 解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的室內(nèi)防治效果Table 3 Indoor control effect of strain YWF-17-0001(B. amyloliquefaciens) against R. oryzae

2.2.2 田間防效 從表4看出,解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001各處理濃度對煙葉霉?fàn)€病均有較好的防治效果。發(fā)病率:隨處理濃度下降煙葉發(fā)病率呈上升趨勢,各處理的發(fā)病率為0.33%～5.00%,表現(xiàn)為T6>T5>T4>T3>T2>T1,其中,T1～T6煙葉的發(fā)病率均顯著低于對照(50.00%),T1～T3煙葉的發(fā)病率差異不顯著,但均顯著低于T4～T6,T4～T6差異不顯著。病情指數(shù):隨處理濃度下降煙葉的病情指數(shù)呈上升趨勢,各處理的病情指數(shù)為0.04～0.38,表現(xiàn)為T6>T5>T3>T4>T2>T1,其中,T1～T6煙葉的病情指數(shù)差異均不顯著,但均顯著低于對照(21.11)。相對防治效果:各處理濃度的相對防治效果為98.20%～99.81%,表現(xiàn)為T1>T2>T4>T3>T5>T6,各處理間抑制作用差別較小,表明,用1.5×105cfu/mL的菌液浸泡或噴施煙柄,防治效果均超過98.00%。說明,在煙葉烘烤前,噴施或浸泡解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001菌液能夠有效防控烘烤期的煙草霉?fàn)€病。

表4 解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的田間防治效果 Table 4 Control effect of strain YWF-17-0001 (B. amyloliquefaciens) against R. oryzae in field

3 討論

烘烤期煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)和經(jīng)濟效益,如何進行控病減損,綠色、安全、高效地減少霉?fàn)€病的發(fā)生,也越來越得到行業(yè)的重視[14]。煙葉烘烤過程中霉菌污染主要發(fā)生在葉片變黃期,烤房內(nèi)溫度36～40℃、相對濕度75%～85%時最有利于米根霉的生長[15]。利用微生物防控的原理,從變黃期的特定溫濕度條件出發(fā),有針對性地篩選抗病、耐熱且易于定殖的微生物[16],并進行開發(fā)利用,結(jié)合烘烤工藝流程的微調(diào)整,從而實現(xiàn)煙葉霉?fàn)€病的生物防治,既滿足人們對綠色食品的需要,又符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。解淀粉芽孢桿菌[17]、枯草芽孢桿菌[18]、膠質(zhì)芽孢桿菌[19]及貝萊斯芽孢桿菌[20]等對煙葉霉變菌具有較強的拮抗作用。本研究從15株生防菌株中篩選出4株能明顯抑制煙葉霉?fàn)€病病原菌米根霉生長的菌株,包括解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、膠質(zhì)芽孢桿菌YWF-17-0005及枯草芽孢桿菌YWF-17-0011,其抑菌圈直徑為0.94～3.03 cm,其中,解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001的抑菌效果最好,室內(nèi)噴施濃度為105cfu/mL及以上時對煙草霉?fàn)€病的防效達95%以上;煙葉烘烤前用YWF-17-0001菌液1.5×105～1.5×106cfu/mL噴施或浸泡煙柄,對煙葉霉?fàn)€病的防治效果達98%以上。趙文姬[17]研究也表明,解淀粉芽孢桿菌對煙葉霉變菌具有較強的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌,具備產(chǎn)生多種酶類和抗菌活性物質(zhì)的能力,能夠促進生物膜形成,定殖在植物體內(nèi),與植物形成共生關(guān)系,促進植物生長,并對多種植物病原菌形成抑制作用[21];應(yīng)用在煙葉烘烤過程中無毒無害,不會對煙葉品質(zhì)產(chǎn)生不利影響,是一種綠色、安全且高效的煙葉霉?fàn)€病生物防控制劑。

煙葉烘烤過程中霉?fàn)€病對煙葉質(zhì)量影響較大,采用以菌治菌是目前煙葉霉?fàn)€病防治較為綠色環(huán)保的方法,本試驗取得了初步的研究成果,但要推廣應(yīng)用,菌株YWF-17-0001發(fā)酵底物篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化及田間應(yīng)用技術(shù)等有待進一步試驗,其對煙葉品質(zhì)的影響也有待進一步研究。

4 結(jié)論

從15株耐熱芽孢桿菌中篩選出1株能夠明顯抑制米根霉生長的生防拮抗菌——解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001,其室內(nèi)和田間對煙葉霉?fàn)€病的防效均達95%以上。解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001具有拮抗煙葉霉?fàn)€病病原菌的能力,可作為一種煙草霉?fàn)€病生物防控候選菌株進一步深入研究。