活性口袋關(guān)鍵色氨酸對(duì)幾丁質(zhì)酶Chi304催化性質(zhì)的研究

田曉倩， 盧海強(qiáng)， 伍寧豐， 田健， 關(guān)菲菲*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

幾丁質(zhì)又稱甲殼素、甲殼質(zhì)，由直鏈N-乙酰氨基葡糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接而成，是一種古老而豐富的結(jié)構(gòu)氨基多糖[1]。幾丁質(zhì)最早在真菌（1811 年）和節(jié)肢動(dòng)物（1826 年）中發(fā)現(xiàn)，之后在各物種中均有發(fā)現(xiàn)，包括原生動(dòng)物、硅藻、珊瑚藻、海綿、珊瑚、蠕蟲、苔蘚、軟體動(dòng)物、昆蟲、蜘蛛以及甲殼類動(dòng)物等[2]。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物為幾丁寡糖（N-acetyl chito oligosaccharide, NACOS），可作為抗菌物質(zhì)、生物活性劑，廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3-6]。幾丁寡糖（DP＞2）在抗癌、抗腫瘤、免疫活性等方面有顯著優(yōu)勢(shì)，如(GlcNAc)6對(duì)移植到小鼠體內(nèi)的Lewis 肺癌（Lewis lung cancer，LLC）細(xì)胞有著顯著的抗轉(zhuǎn)移作用，且能夠抑制局部腫瘤生長[7]。高分子量幾丁寡糖（1～3 kD）比低分子量幾丁寡糖（＜1 kD）對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)氧化和自由基產(chǎn)生的抑制效果更好，此外，幾丁寡糖還可作為潛在的氧化應(yīng)激清除劑[8]。

幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GH），可水解幾丁質(zhì)中的β-1,4 糖苷鍵。根據(jù)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org/, CAZy），幾丁質(zhì)酶主要屬于GH18 和GH19 家族，部分幾丁質(zhì)酶也被劃分到其他GH 家族，例如GH23 和GH48 家族[9]。GH18 家族的幾丁質(zhì)酶來源廣泛，如真菌、細(xì)菌、昆蟲、線蟲以及一些哺乳動(dòng)物等[10]。GH18家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，即8條平行的β-折疊鏈形成1 個(gè)桶狀，α-螺旋依次向外形成1 個(gè)環(huán)[11]。在這個(gè)(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)中，β4由1 個(gè)保守的序列基序（DXDXE，D為天冬氨酸、E為谷氨酸、X為任意氨基酸）形成酶的活性中心位點(diǎn)[12]。GH18 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶又分為3 個(gè)亞家族，分別為A、B 和C[13]。其中A亞家族GH18家族幾丁質(zhì)酶擁有一個(gè)深溝，該類酶通常為外切型水解酶，特點(diǎn)是持續(xù)性水解底物，芳香族氨基酸在水解幾丁質(zhì)過程中發(fā)揮著重要作用[14-15]；B 亞家族GH18 家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶數(shù)量較少，擁有較淺的裂縫，與底物結(jié)合，B亞家族幾丁質(zhì)酶較A亞家族含有更少的芳香族氨基酸殘基[16-17]。

近年來，越來越多的幾丁質(zhì)酶基因被克隆表達(dá)，但普遍存在酶活力弱、熱穩(wěn)定性差等問題，且內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的研究尚淺[18]。GH18 家族的幾丁質(zhì)酶多數(shù)發(fā)揮外切型水解酶活性，主要產(chǎn)物為N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺或二乙酰殼二糖，如從玉米螟中克隆的幾丁質(zhì)酶OfCht5 將幾丁質(zhì)有效降解為(GlcNAc)2與少量GlcNAc，與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶OfHex1 同時(shí)作用可將幾丁質(zhì)完全轉(zhuǎn)化為GlcNAc[19]。典型B 亞家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶SmChiC 是非持續(xù)性內(nèi)切型水解酶，但其熱穩(wěn)定性差，且水解幾丁質(zhì)的主要產(chǎn)物仍是二乙酰殼二糖[20]。

本研究前期從海洋宏基因組文庫中篩選到1個(gè)嗜熱幾丁質(zhì)酶Chi304，在85 ℃顯示出最高酶活力為12.28 U·mL-1，該酶水解膠體幾丁質(zhì)的主要產(chǎn)物為二乙酰殼二糖（DP2），同時(shí)產(chǎn)生少量三乙酰殼三糖（DP3）以及微量N-乙酰氨基葡萄糖胺[21]。該酶熱穩(wěn)定性好，因此，本研究采用理性設(shè)計(jì)的方法分析得到2 個(gè)色氨酸，將其定點(diǎn)突變對(duì)酶進(jìn)行改造，以產(chǎn)物成分DP3/DP2來評(píng)估突變體的效果。期望通過對(duì)現(xiàn)有性能優(yōu)良的幾丁質(zhì)酶改造，使其能夠水解幾丁質(zhì)以快速高效的生產(chǎn)幾丁寡糖（DP＞2）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 質(zhì)粒pET30a(+)-chi304與及表達(dá)菌株BL21(DE3) 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 鎳柱填料購自GE 公司，BCA（bicinchoninic acid）蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，幾丁質(zhì)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，GlcNAc）與六乙酰殼六糖〔(GlcNAc)6〕標(biāo)準(zhǔn)品均購自Megazyme 公司，本試驗(yàn)所用其他試劑為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1、酵母膏5 g·L-1，固體含瓊脂粉15 g·L-1；2% 膠體幾丁質(zhì)制備參照文獻(xiàn)[22]中的方法略做改進(jìn)，2 g 幾丁質(zhì)粉末溶于18 mL 濃鹽酸后，加入182 mL 預(yù)冷的95%乙醇混勻，用蒸餾水洗混合物直至中性后定容為100 mL；DNS（3,5-dinitrosalicylic acid）顯色劑：3.15 g·L-13,5-二硝基水楊酸、0.5 mol·L-1氫氧化鈉、90 g·L-1四水合酒石酸鉀鈉、2.5 g·L-1苯酚、2.5 g·L-1無水亞硫酸鈉。

1.2 方法

1.2.1 同 源 建 模 利 用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/）同源序列建模，用野生型Chi304 氨基酸序列進(jìn)行模板檢索，并將全局模型質(zhì)量評(píng)估值（global model quality estimate，GMQE)按照從大到小排列。

1.2.2 單點(diǎn)突變體的構(gòu)建 按照大腸桿菌密碼子偏好性用Oligo 7 設(shè)計(jì)突變體引物W140A-R: 5'-CCGCTACGGCTCGCGCCACCAAC-3'與W272AR: 5'-GTAACGTTCTCCGCGCCACCGTG-3'（下劃線為突變位點(diǎn)堿基序列），PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆子的測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 蛋白表達(dá)與濃度定量 測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆子培養(yǎng)種子液，種子液以1%接種量加入到卡那霉素抗性培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期（OD600=0.6～0.8），添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG）使其終濃度為0.1 mmol·L-1，于16 ℃、200 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h。離心（8 000×g, 5 min）收集菌體，按相應(yīng)菌液體積的1/10加入20 mmol·L-1Tris-HCl重懸菌體，超聲波破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心（13 786×g 30 min）后上清液用鎳柱進(jìn)行蛋白純化，純化后蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳。BCA蛋白定量按試劑盒說明書中微孔檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 酶活力測(cè)定 采用3、5 二硝基水楊酸（DNS）法[23]測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Chi304 及突變體在85 ℃、pH 9.0 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中水浴反應(yīng)30 min，各成分終濃度膠體幾丁質(zhì)含量5‰，酶濃度0.025 mg·mL-1，緩沖液0.1 mol·L-1，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 的DNS 溶液煮沸顯色10 min，取上清液200 μL于酶標(biāo)儀96孔板中測(cè)定OD540。

幾丁質(zhì)酶活力單位（U）：以膠體幾丁質(zhì)為底物，在最適條件下，每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μmol 還原糖（以生成GlcNAc的量計(jì)算）所需的酶量，稱為一個(gè)酶活力單位（1 U）。

1.2.5 酶水解產(chǎn)物分析 Chi304 及突變體在相同酶活力單位（0.25 U）下水解5 mg·mL-1膠體幾丁質(zhì)，0.05 U 水解1 mg·mL-1(GlcNAc)6，每組設(shè)置3 個(gè)平行，水解條件：85 ℃，pH 9.0 水解30 min，然后加入1 mL 氯仿終止反應(yīng)，12 000 r·min-1離心1 min后取上清液，0.22 μm水相濾膜過濾后，用高效液相色譜分析產(chǎn)物成分。色譜柱：shodex suger KS-802；檢測(cè)器：Shimadu RID-20A；分離相：HPLC水；流速：0.6 mL·min-1；檢測(cè)時(shí)間：30 min；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.6 酶水解六乙酰殼六糖時(shí)程分析 0.002 U的 酶 水 解1 mg·mL-1的(GlcNAc)6，水 解 條 件：85 ℃，pH 9.0，水解時(shí)間分別為0、2、5、10、30、60、120 min，每組設(shè)置3 個(gè)平行。反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 氯仿終止反應(yīng)，12 000 r·min-1離心1 min 后取上清液，0.22 μm 水相濾膜過濾后，用高效液相色譜分析產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶Chi304結(jié)構(gòu)分析

利用Swiss-Model 同源建模方法構(gòu)建Chi304蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，GMQE 最大值為0.5，對(duì)應(yīng)蛋白為5zl9.1.A，以此為模板對(duì)Chi304 進(jìn)行同源建模，得到Chi304 的三維結(jié)構(gòu)信息，如圖1A 所示。Chi304 屬于GH18 家族，含有644 個(gè)氨基酸，活 性 位 點(diǎn)Y49、F79、D176、D178、E180、M264、Y266、D267、Y323、W420 均位于中間桶8 個(gè)β-折疊的末端上。高度保守176DIDWE180催化活性中心水解底物，催化水解機(jī)制是經(jīng)典的反轉(zhuǎn)機(jī)制，酸堿催化需要2 個(gè)酸性谷氨酸殘基，一個(gè)作為酸（質(zhì)子供體），另一個(gè)作為堿（親核試劑），天冬氨酸為輔助殘基[24]。在Chi304 底物結(jié)合口袋附近存在2 個(gè)暴露于表面的芳香族氨基酸W140 與W272，這2 個(gè)位點(diǎn)均在連接β-折疊的loop 上（圖1B）。這2 個(gè)色氨酸的側(cè)鏈苯環(huán)結(jié)構(gòu)可能與酶和底物的結(jié)合有關(guān)[25]。后續(xù)研究將這2 個(gè)色氨酸突變?yōu)闊o側(cè)鏈的丙氨酸，以打開酶與底物的結(jié)合通道。

圖1 Chi304結(jié)構(gòu)信息Fig. 1 Structure of Chi304

2.2 Chi304及突變體的表達(dá)

將成功構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后的蛋白用鎳柱進(jìn)行純化并使用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。Chi304和突變體W140A、W272A的蛋白均表達(dá)較好，目標(biāo)條帶單一，且與理論大小一致，約71 kD。DNS法檢測(cè)酶活結(jié)果表明，突變體與野生酶均有活力，但突變體W140A與W272A的酶活力較野生型分別下降44.7%與43.0%。

圖2 Chi304突變體SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of Chi304 mutants

2.3 Chi304及突變體水解產(chǎn)物

為了解析突變體活力降低是否與內(nèi)、外切活力改變相關(guān)，將Chi304 與突變體稀釋成相同的酶活力，檢測(cè)其水解膠體幾丁質(zhì)和六乙酰殼六糖生成幾丁寡糖的能力。將野生型Chi304 和突變體W140A、W272A稀釋為相同酶活力單位0.25 U，于85 ℃、pH 9.0緩沖液中同時(shí)水解膠體幾丁質(zhì)（終含量50 mg·mL-1）30 min，水解產(chǎn)物成分為GlcNAc、(GlcNAc)2和(GlcNAc)3。分析產(chǎn)物成分DP3與DP2的比例，W140A與W272A分別較野生型提高23.3%與45.7%（圖3）。進(jìn)一步解析水解可溶性寡糖(GlcNAc)6，結(jié)果顯示生成(GlcNAc)3的量較野生型分別提高3.2 與2.7 倍；生成(GlcNAc)2的量較野生型分別降低25.2%與33.8%。因此，突變體W140A與W272A呈現(xiàn)出與野生型不同的機(jī)制，突變體內(nèi)切底物長鏈幾丁質(zhì)獲得(GlcNAc)3的活力明顯提升，外切獲得(GlcNAc)2的活力明顯下降（圖3）。綜上所述，這2個(gè)位點(diǎn)可能是影響Chi304外切活力與內(nèi)切活力的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖3 Chi304及突變體的水解產(chǎn)物Fig. 3 Hydrolysate of Chi304 and mutants

2.4 雙點(diǎn)突變體W140A/W272A 的構(gòu)建與功能鑒定

為了進(jìn)一步研究這2 個(gè)位點(diǎn)的作用，設(shè)計(jì)了雙點(diǎn)突變體W140A/W272A。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)鎳柱純化后，用SDS-PAGE 蛋白電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)量，突變體W140A/W272A成功表達(dá)，且蛋白分子量與理論計(jì)算大小一致，約71 kD，目標(biāo)條帶單一（圖4）。DNS 法檢測(cè)酶活力表明，突變體W140A/W272A的酶活力仍能保留野生型的40%。分別取相同酶活力單位0.25 U，將野生型及雙點(diǎn)突變體均于85 ℃、pH 9.0條件下水解底物膠體幾丁質(zhì)，水解產(chǎn)物用HPLC 分析，雙點(diǎn)突變體W140A/W272A的產(chǎn)物成分DP3/DP2較野生型提高80%，說明雙點(diǎn)突變體的內(nèi)切長鏈幾丁質(zhì)獲得(GlcNAc)3的活力明顯提升，外切獲得(GlcNAc)2的活力下降。

圖4 W140A/W272A的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of W140A/W272A

2.5 突變體W140A/W272A水解（GlcNAc）6解析

為了進(jìn)一步探究突變體積累(GlcNAc)3的機(jī)制，分別在0、2、5、10、30、60和120 min下用0.002 U的Chi304與W140A/W272A于85 ℃、pH 9.0條件下分別水解可溶性幾丁寡糖(GlcNAc)6。結(jié)果顯示，Chi304 與W140A/W272A呈現(xiàn)出不同的水解模式。野生Chi304 水解(GlcNAc)6的最終產(chǎn)物只有GlcNAc、(GlcNAc)2與(GlcNAc)3，底物充足時(shí)迅速 水 解(GlcNAc)6生 成(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4；(GlcNAc)6被 消 耗 完 后，(GlcNAc)4繼續(xù)被水解直至消耗完全；隨著時(shí)間延長，(GlcNAc)3也會(huì)被繼續(xù)水解（圖5A）。以上結(jié)果說明野生型Chi304 主要發(fā)揮外切活性。與Chi304 不同，雙點(diǎn)突變體W140A/W272A水解(GlcNAc)6的最終產(chǎn)物 有GlcNAc 、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4，當(dāng)?shù)孜?GlcNAc)6充足時(shí)迅速生成(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4；(GlcNAc)6被 消 耗 完 后，W140A/W272A會(huì)繼續(xù)水解(GlcNAc)4，但水解效率明顯降低，說明W140A/W272A的外切活力明顯減弱，導(dǎo)致幾丁寡糖（(GlcNAc)3與(GlcNAc)4）的積累（圖5B）。

圖5 Chi304與W140A/W272A水解（GlcNAc）6分析Fig.5 Analysis of hydrolyzed （GlcNAc）6 by Chi304 and W140A/W272A

3 討論

本研究將幾丁質(zhì)酶Chi304水解底物的2個(gè)關(guān)鍵芳香族氨基酸（色氨酸）定點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，突變體W140A、W272A與W140A/W272A水解底物幾丁質(zhì)產(chǎn)物成分DP3/DP2較野生型分別提高23.3%、45.7%與80.0%，表明W140 與W272 為水解長鏈幾丁質(zhì)的關(guān)鍵位點(diǎn)，具有調(diào)控幾丁質(zhì)酶與底物結(jié)合的能力。

GH18 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶A 亞家族擁有與底物結(jié)合的深裂縫，表現(xiàn)出外切酶活力，能夠持續(xù)性地水解底物，其芳香族氨基酸在底物水解過程中發(fā)揮著重要作用。B 亞家族擁有較淺的底物結(jié)合裂縫，B 亞家族較A 亞家族含有更少的芳香族氨基酸殘基[26]。來源于Serratia marcescens的GH18家族的 ChiA、ChiB 和ChiC 中，ChiA 與ChiB 擁有1個(gè)深裂縫，表現(xiàn)出沿幾丁質(zhì)長鏈滑動(dòng)時(shí)切割二糖的持續(xù)性外切酶活性；ChiC有1個(gè)淺裂縫，表現(xiàn)出非持續(xù)性內(nèi)切酶活性，可隨機(jī)切割幾丁質(zhì)長鏈，但3 種酶最終的水解產(chǎn)物均以二乙酰殼二糖為主[27]。幾丁質(zhì)酶Chi304 的蛋白結(jié)構(gòu)顯示也有1 個(gè)深溝，水解底物膠體幾丁質(zhì)的主要產(chǎn)物為 (GlcNAc)2及少量(GlcNAc)3和微量GlcNAc，同時(shí)也存在關(guān)鍵的芳香族氨基酸。

芳香族氨基酸對(duì)于酶的持續(xù)性水解發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如幾丁質(zhì)酶AnChiB能夠降解黑曲霉菌絲體 廢 物產(chǎn)生(GlcNAc)2，發(fā) 現(xiàn)W106 和W118 是AnChiB 的重要活性位點(diǎn)[28]；將幾丁質(zhì)酶SmChiA中的W167、W275 和F396 以及SmChiB 中的W97、W220和F190芳香族殘基（色氨酸殘基）突變?yōu)楸彼釙?huì)導(dǎo)致能酶的結(jié)合自由能下降，使酶的持續(xù)性能力降低[29-30]。脂肪族氨基酸對(duì)幾丁質(zhì)酶非持續(xù)性水解底物幾丁質(zhì)以及(GlcNAc)6起著重要作用，例幾丁質(zhì)酶NtChiV 和SmChiB 具有相似的酶與底物結(jié)合位點(diǎn)，但NtChiV 表現(xiàn)出非持續(xù)性水解底物，而SmChiB會(huì)持續(xù)性水解底物生成主要產(chǎn)物(GlcNAc)2，且在SmChiB的底物結(jié)合裂縫中發(fā)現(xiàn)的芳香族氨基酸殘基在NtChiV 中被脂肪族氨基酸殘基取代[25]。本研究中Chi304 存在2 個(gè)芳香族氨酸W140 與W272，這2 個(gè)色氨酸對(duì)于裂縫暴露面積的大小有直接作用，將其突變?yōu)楸彼岷竽軌虮┞兜孜锱c酶的結(jié)合通道。突變體W140A與W272A水解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物成分DP3/DP2明顯提升，分別較野生型Chi304 提升23.3%與45.7%；對(duì)于水解可溶性底物(GlcNAc)6，生成產(chǎn)物(GlcNAc)3的量較野生型分別提高3.2 與2.7 倍。色氨酸在幾丁質(zhì)酶Chi304 持續(xù)性水解長鏈幾丁質(zhì)生成(GlcNAc)2起著重要作用，將其突變?yōu)楸彼岷螅猱a(chǎn)物中(GlcNAc)3的量明顯提升。而芳香族氨基酸對(duì)于糖苷水解酶的持續(xù)性水解長鏈聚糖有普適性，例如在纖維素酶中芳香族氨基酸也能起到持續(xù)性外切纖維素的能力[31-32]。

近年來，雖然對(duì)幾丁質(zhì)酶表達(dá)與應(yīng)用的研究逐漸增多，但幾丁質(zhì)的降解仍以化學(xué)或物理方法為主，一方面是由于幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性差，另一方面是酶活力弱[10,33]。報(bào)道的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶更少，典型的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶ChiC1 水解幾丁質(zhì)的產(chǎn)物仍是二乙酰殼二糖[34]。研究發(fā)現(xiàn)，芳香族氨基酸對(duì)于水解長鏈寡糖起重要作用，可以通過對(duì)關(guān)鍵芳香族氨基酸的定點(diǎn)突變，調(diào)控酶的內(nèi)、外切活力，從而生產(chǎn)較高聚合度的幾丁寡糖，尤其是對(duì)于熱穩(wěn)定性良好幾丁質(zhì)酶的改造為生產(chǎn)幾丁寡糖（DP＞2）奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)W140 與W272為幾丁質(zhì)酶Chi304 水解長鏈幾丁質(zhì)的關(guān)鍵氨基酸，將其定點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷髢?nèi)、外切活力發(fā)生變化，為后續(xù)水解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖（DP＞2）提供了新思路。