月季花形態(tài)建成及花期調(diào)控的研究進展

熊智穎， 于蕊， 胡子祎， 張玉滿， 劉青林*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院，北京100193； 2.中國科學院微生物研究所，北京100101）

中國古老月季的優(yōu)秀品種在18 世紀先后傳入英國和法國，通過復合雜交和多次回交，1876年育成了連續(xù)開花的現(xiàn)代月季 ，成為世界現(xiàn)代月季的里程碑和與古老月季的分水嶺。1998—2018年間我國月季育種機構共計30 余個，育成月季新品種共計168 個，月季育種目標已經(jīng)從最初只集中在外部形態(tài)(觀賞性)上，如花型、花色、株型以及花香等，轉(zhuǎn)變?yōu)槌獠啃螒B(tài)外，更多地關注月季的栽培品質(zhì)，包括其耐寒性、耐熱性、抗病蟲害的能力以及瓶插壽命[2]。

開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的樞紐，在植物生長和發(fā)育中起核心作用。植物成花同時受內(nèi)部生理狀態(tài)和外部環(huán)境因素的雙重影響，具有復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡[3]。花朵的數(shù)目、形狀、顏色及其開花習性是觀賞植物的重要性狀，決定了其觀賞價值和經(jīng)濟收益。現(xiàn)代月季有著豐富的花型及花色，花型包括平開狀、杯狀、高芯狀、高芯翹腳狀、球狀、蓮座狀；花色可以分為紅色系、粉色系、黃色系、白色系、橙色系、黑色系、紫藍色系、綠色系、復色系和表里雙色系。月季還具有連續(xù)開花的性狀，此性狀源自我國的月季花（Rosa chinensis）和香水月季（Rosa×odorata），作為少有的能夠連續(xù)開花的木本花卉，月季的花期調(diào)控途徑以及花形態(tài)建成受到國內(nèi)外學者的普遍關注[4-6]。本文對近幾年月季花期調(diào)控與花形態(tài)建成的分子機制的研究進展進行了綜述，以期為月季分子生物學研究和分子育種提供參考。

1 月季花發(fā)育研究進展

植物花發(fā)育是一個內(nèi)部生理狀態(tài)和外部形態(tài)發(fā)生復雜變化的調(diào)控過程，可以分為以下5 個發(fā)育階段：①成花誘導（flower induction），植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的過程；②花發(fā)端（flower evocation），花原基開始分化的過程；③花器官發(fā)育（floral organ development），花分生組織最后形成花器官；④花的成熟；⑤開花。

1.1 成花誘導途徑

月季開花同時受環(huán)境因素與自身狀態(tài)的影響，目前已知的成花誘導（花期調(diào)控）途徑有光周期途徑、春化途徑、溫敏途徑、赤霉素途徑、自主途徑和年齡途徑共6 條[5]。其中，光周期途徑、春化途徑和溫敏途徑受外界環(huán)境因素的影響，赤霉素途徑、自主途徑和年齡途徑受自身狀態(tài)控制，這些途徑形成了彼此獨立又相互交聯(lián)的精密的成花調(diào)控網(wǎng)絡（圖1）。即使環(huán)境因子調(diào)控的開花途徑，植物也有響應環(huán)境的受體、信號傳導和靶基因等一系列內(nèi)在的調(diào)控網(wǎng)絡，本質(zhì)上也受內(nèi)在的生理和遺傳控制。

圖1 月季開花調(diào)控途徑Fig. 1 Schematic diagram of flowering regulation pathway of rose

1.1.1 光周期途徑 光周期途徑是指植物依賴一定的日長或夜長而開花的調(diào)控途徑。植物特異的光受體會感受不同波長的光，繼而將光信號傳遞給生物鐘，生物鐘進一步將光信號輸出給CO(COSTANS)。CO是FT(FLOWERING LOCUS T)和SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)的上游基因。FT被CO激活后，進而激活AP1(APETALA 1)、LFY(LEAFY)等花分生組織特異性基因，最終啟動成花進程[7-8]。月季作為一種日中性植物，在長日照和短日照下均可開花。月季的日中性是受COL4（CONSTANS-LIKE 4)和CO分別在長日照和短日照條件下綜合調(diào)控FT所獲得的。在連續(xù)開花的‘月月粉Old Blush'中，RoCO在長日照條件下高表達，促進RoFT的表達，使月季在長日照下可以開花；RoCOL4則在短日照下高表達，通過與RoCO 蛋白的互作，促進RoCO與RoFT啟動子CORE 元件的綁定，進而促進RoFT在短日照下表達，使得月季在短日照條件下也能開花，表現(xiàn)出日中性[9]。月季開花也會受光照強度的影響，表現(xiàn)為強光促進開花，弱光抑制開花。在弱光條件下，光信號通路的核心轉(zhuǎn)錄因子RoPIF1 （PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 1）、RoPIF3 和RoPIF4 與RoCO 互作，形成RoCO-RoPIF 復合體，抑制CO 與FT 啟動子結合，從而抑制其開花；在強光下，則不會形成復合體，CO 會促進FT的表達，促進開花[10]。但也有研究表明月季并不是嚴格的日中性植物，月季品種‘Cara Mia'在長日照或連續(xù)光照下能促進營養(yǎng)生長，短日照可促進開花，屬于數(shù)量型短日照植物[11]。

1.1.2 春化途徑和自主途徑 春化途徑和自主途徑是相對的，無需春化（和光周期）即可開花，即為自主途徑。對不同開花習性的月季春化處理的結果表明，一季開花的月季必須經(jīng)過春化處理才能開花；而連續(xù)開花月季‘Meijikatar'不經(jīng)過春化處理也可以開花，但春化處理可以增加每個植株上花的數(shù)量[12]。本團隊將連續(xù)開花月季‘月月粉'（Rosa chinensiscv. Old Blush）、‘梅朗口紅'（Rosacv. Rouge Meilland）和一季開花月季‘變色粉團薔薇'（Rosa multifloracv.Discoloring Cluster）、單瓣月季花（Rosa chinensisvar.spontanea）進行春化處理，也得到類似的結果，因此推測一季開花月季存在春化途徑，而連續(xù)開花月季不需要春化，可能是自主途徑。

1.1.3 赤霉素途徑 赤霉素（gibberellins，GA）對調(diào)控植物開花具有重要的作用，雖然在許多草本植物中GA 可解除開花抑制，促進成花；但在月季中外施GA 會抑制其成花。Randoux 等[13]在不同季節(jié)分別對月季噴施外源GA 和GA 抑制劑多效唑（paclobutarzol, PCB），發(fā)現(xiàn)對一季開花月季噴施GA 會使其不能在春季開花；但在夏季對其噴施PCB，并不能促進一季開花月季在夏季開花。研究發(fā)現(xiàn)，月季中存在FT的同源基因RoTFL1c（RoKSN)，該基因的啟動子區(qū)域存在GA相應的cis元件，當對一季開花月季外施高水平的GA 時，會導致RoTFL1c大量表達，抑制下游AP1以及LFY等開花基因的表達，從而抑制開花；RoTFL1c是已被證實的控制連續(xù)開花性狀的基因之一，在一季開花月季中能正常的積累與表達，而在連續(xù)開花的月季中由于RoTFL1c第2 個內(nèi)含子中插入了1個9 kb的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，導致RoTFL1c的mRNA不能正常積累，使月季在夏秋季也可開花，獲得連續(xù)開花習性[14-15]。但RoTFL1c的雜合度也會決定其對連續(xù)開花性狀的影響程度，如‘紫枝玫瑰'(Rosa rugosa‘Purple branch')連續(xù)開花習性的獲得是由于RoTFL1c雜合，表達量減半導致的[16-17]。事實上，薔薇屬連續(xù)開花的性狀是受多基因控制的數(shù)量型質(zhì)量性狀，有一季開花的野薔薇、一季半開花的玫瑰和部分藤本月季品種、多季和連續(xù)開花的現(xiàn)代月季[18]。

1.1.4 溫敏途徑 環(huán)境溫度對于成花的影響表現(xiàn)為在一定溫度范圍內(nèi)，高溫促進成花而低溫抑制成花，這一調(diào)控方式稱為溫敏途徑[5]。溫室切花月季的最低生長溫度為16 ℃，在≤10 ℃時生長緩慢，凍害（霜、雪、冰凍）和≤10 ℃的天氣過多會使“盲枝”率大幅提高；在≥30 ℃時生長不良。當生長期溫度在18～30 ℃時，月季從修剪到開花的時間隨溫度升高呈線性縮短；低夜溫和低日溫會延遲花芽形成和開花時間[19]。顯然，切花月季的成花受溫敏途徑的調(diào)控，但相關的基因和調(diào)控機理尚未見報道。

1.1.5 年齡途徑 年齡途徑是一條與年齡增長密切相關的開花調(diào)控途徑。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like) 家 族 和 miR156(microRNA 156)、miR172(microRNA 172)是年齡途徑的重要調(diào)控基因[20-21]。與月季花品種‘月月粉'相比，‘綠萼'（R. chinensiscv. Viridiflora）中的miR172在花瓣、雌蕊、雄蕊中表達均顯著降低，預測其靶基因RcAP2的表達量顯著升高，同時也預測了miR156的靶基因為SPL[22]。對月季基因組內(nèi)SPL家族成員進行檢索分析表明，月季中共含15個SPL基因，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，RoSPLa可能參與調(diào)控成花轉(zhuǎn)變，將RoSPLa轉(zhuǎn)入擬南芥中過表達，可使轉(zhuǎn)基因植株開花時間提前[23]。月季雜交育種的實踐表明，如果雜交后代在當年開花，則為四季開花的月季；反之，如果雜交后代在第2 年才開花，則為一季開花的薔薇。月季的童期只有4～5周，而薔薇的童期超過1年，這種童期的巨大差異是年齡途徑相關基因表達的變化還是越冬的春化作用，有待進一步研究。

通過媒體傳播是塑造城市文化形象的基本手段。影視媒介研究表明，采用系列影視片能夠?qū)κ鼙娫趥鬟f信息和影響人們觀點、意見方面有著明顯的效果。因此，本地區(qū)主流媒體更應該深入廠區(qū)、發(fā)掘歷史、深挖典型人物、典型事件、結合當前黨中央、國務院大力振興東北老工業(yè)基地精神，制作出人民群眾所喜聞樂見的影視紀錄片，擦亮齊齊哈爾“國家工業(yè)明珠”這張亮麗的城市文化形象名片。

1.2 花芽分化

1.2.1 花芽分化的時期 植物莖尖分生組織接收到成花誘導信號后就進入了花發(fā)端階段，開始進行花芽分化?；ㄑ糠只话惴譃樯矸只托螒B(tài)分化2 個過程。芽內(nèi)生長點在生理狀態(tài)上向花芽轉(zhuǎn)化的過程，稱為生理分化，生理分化為花芽分化提供生理環(huán)境和物質(zhì)基礎。此后開始的花芽發(fā)育的形態(tài)變化過程，稱為形態(tài)分化，形態(tài)分化能更直接的確定花芽分化及發(fā)育的關鍵時期[24]。環(huán)境因子會影響花芽分化進程，如不同品種月季在不同溫度下花芽分化持續(xù)時間不盡相同，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高花芽分化所需時間越短[25]；遮蔭可以在一定程度上延緩‘梅郎口紅'（Rosacv.Rouge Meilland）花芽分化進程[26]。

目前以石蠟切片作為觀察花芽分化的主要手段。胡祖坤[25]制作并觀察了月季花芽的石蠟切片，將月季花芽從分化前期到開花前期分為了16 個時期。薔薇屬植物的成花轉(zhuǎn)變一般可劃分為3 個生長期：①營養(yǎng)生長期-腋芽的莖尖分生組織出現(xiàn)三角形小突起；②營養(yǎng)生長錐轉(zhuǎn)化期-分生組織迅速擴張，由營養(yǎng)生長組織轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L組織；③生殖生長錐分化初期-分生組織向上突起逐漸加寬伸長呈寬圓錐形[27-28]。對‘梅郎口紅'的花芽用體視顯微鏡結合石蠟切片觀察的方法，可將營養(yǎng)生長錐轉(zhuǎn)化期和生殖生長錐分化初期細分為：①萼片原基分化期-萼片原基分生組織細胞基本形成；②花瓣原基分化期-萼片原基伸長、變寬且向內(nèi)彎曲，花瓣原基分生組織朝著各個方向分裂；③雄蕊原基分化期-杯狀花托上部形成多輪雄蕊原基，雄蕊群輪狀分布，多層分化；④雌蕊原基分化期-雌蕊原基邊緣的細胞體積小、數(shù)量大且分裂旺盛，隨著發(fā)育的進行而形成更多雌蕊原基[26]。通過花芽大小也可大致區(qū)分花芽分化階段，通過對‘月月粉'花芽進行石蠟切片發(fā)現(xiàn)腋芽長度8 mm 是重要節(jié)點之一，當腋芽長度大于8 mm 時，月季才普遍開始花芽分化[29]。

1.2.2 開花整合子 雖然存在多種成花誘導調(diào)控途徑，每條調(diào)控途徑都能獨立完成從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，但是又彼此關聯(lián)，多條途徑最終作用于LFY、FT、SOC1等基因，促進植物花芽分化，這類基因被稱為開花整合子。RoLFY作為花分生組織特性基因，促進花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，維持花分生組織的正常功能與成花啟動，上游受開花抑制子TFL1基因的調(diào)控，下游可促進開花整合子AP1的表達，從而促進植物成花。不同開花習性月季LFY的表達量存在顯著差異，在花芽形成至開花這一發(fā)育階段，在連續(xù)開花月季中LFY的表達量一直在降低，在一季開花月季中LFY表達量先升高后降低[30]。FT 可與LFY共同促進AP1的表達從而促進成花，F(xiàn)T 蛋白可從韌皮部運輸至花分生組織，激活花分生組織特性基因的表達[31]。在油用玫瑰‘Bao White'中轉(zhuǎn)入梅花的FT基因，其開花時間明顯提前[32]。SOC1屬于MADS-box家族成員，在月季各器官中均有表達，但在頂芽中表達量最高。在擬南芥中過表達RoSOC1，可使轉(zhuǎn)基因植株開花時間提前[33]。因此，多條成花誘導途徑共同作用于開花整合子，形成一個彼此關聯(lián)、錯綜復雜的成花調(diào)控網(wǎng)絡。

1.3 花形態(tài)建成分子生物學進展

1.3.1 花器官發(fā)育 決定月季花形態(tài)建成的基因是花器官特性基因（MADS-box同源異型基因），包括A、B、C、D 和E 類功能基因，構成ABCDE 模型。對ABCDE 模型可簡要解釋為，A+E 調(diào)控萼片發(fā)育，A+B+E 調(diào)控花瓣發(fā)育，B+C+E 調(diào)控雄蕊發(fā)育，C+E 調(diào)控心皮發(fā)育，C+D+E 調(diào)控胚珠發(fā)育，A 和C相互拮抗[34]（圖2）。在月季中，部分控制花器官特性的MADS-box基因已被克隆并進行功能驗證，如A 類 基 因cAP1、RhFUL、RcAP2L[35-36]，B 類 基 因RhPI、RhAP3、MASAKO B3、MASAKO BP[37]，C 類基因RhAG、MASAKO C1等[38-39]。通過轉(zhuǎn)錄組也檢測到了月季D 類基因RhSTK（SEEDSTICK）、RhSHP（SHATTERPROOF），E 類 基 因MASAKO S1、MASAKO S3[40]。對于月季花形態(tài)建成的研究，主要集中在重瓣性與綠萼這2種特殊的觀賞性狀上。

1.3.2 重瓣性是A、C 類基因表達邊界位移的結果 花瓣的數(shù)量對于觀賞植物的花型和觀賞價值有著重大意義，重瓣也是花期延長的重要基礎。月季的重瓣性狀為單個基因控制的顯性性狀；花瓣的數(shù)量受多個數(shù)量性狀基因位點（quantitative trait loci， QTLs）控制，溫度、外源激素等外界信號也會對重瓣性有一定的影響。目前普遍認為月季的重瓣性狀以雌雄蕊瓣化為主，是外部環(huán)境與內(nèi)源調(diào)控共同作用的結果[41-42]。在月季中，通過定位確定了與重瓣性狀有關的遺傳區(qū)間，該區(qū)間存在A 類功能基因RcAP2L（APETALA2-like gene）的突變等位基因，該等位基因?qū)iR172 不敏感，存在TE 的插入[36]。通過比較單瓣花與重瓣花中是否存在該插入，確定了該等位基因的存在與重瓣性狀有關。研究表明，月季的重瓣性主要受AG、AP2等基因的控制，在重瓣花中，RhAG的表達量較單瓣花低，原位雜交發(fā)現(xiàn)，在重瓣花中RhAG的表達域內(nèi)縮，從而造成花瓣數(shù)量增多，雄蕊數(shù)量減少[43]。同時，低溫也會通過提高RhAG啟動子特定區(qū)域的甲基化水平，降低RhAG的表達量，從而增加花瓣數(shù)量[44]。

1.3.3 ‘綠萼’的形成與A、C和E類基因的表達變化有關 ‘綠萼'是中國古老月季的代表品種，其花型奇特，花瓣、雌雄蕊均為綠色萼片狀?！G萼'（R. chinensis‘Viridiflora'）是花器官的同源異型突變體，花瓣、雄蕊、雌蕊均突變?yōu)檩嗥ㄝ嗥?981 年，Krussman[45]報道‘綠萼'是單瓣月季花（R.chinensis‘Jaquin'）的自然突變體。對于‘綠萼'形成的原因有2種推測：（1）C類AG基因在雌雄蕊的表達受到抑制[46]，A、C類基因的異常表達導致花器官的萼片化。試驗證實‘綠萼'中A 類基因RcAP2在雌雄蕊中表達量顯著升高，C 類基因RcAG的表達量顯著下降，但RcAG如何被抑制、RcAP2的表達量如何上升的分子機制還不明確[47]。（2）E 類MASAKO S3基因在4輪花器官的超表達，使得花器官均發(fā)育成萼片（圖2）。無獨有偶，擬南芥的E類基因sep1、sep2和sep3三重突變體的雄蕊和心皮均轉(zhuǎn)化為萼片[48]，與月季花‘綠萼'表型很相似。

圖2 月季花器官發(fā)育的ABCDE模型Fig. 2 ABCDE model of organ development in rose

2 花期調(diào)控途徑

2.1 溫度

氣溫是調(diào)控月季開花的重要因子，月季屬于常綠或半常綠植物，高溫干旱會促使月季進入休眠或蓮座化，低溫有利于恢復月季植株的生長活性[49]。需要對月季花期進行調(diào)控時，可根據(jù)預計花期，依據(jù)當?shù)厍闆r，對溫度進行調(diào)節(jié)，使夜溫保持在8～10 ℃，并根據(jù)月季植株和花蕾生長情況，進行晝夜溫度調(diào)節(jié)。當花的采收高峰提前時，白天開窗降溫，使溫室內(nèi)溫度維持在20～22 ℃，夜間溫度維持在8～9 ℃，可延緩花的采收時間；當花的采收高峰推后時，白天溫室中進行溫度調(diào)節(jié)，使溫室內(nèi)溫度維持在24～26 ℃，夜間溫度維持在12～13 ℃。進入采收期后注意夜間保溫和加溫，并調(diào)節(jié)溫度減小晝夜溫差[19]。

2.2 生長調(diào)節(jié)劑

植物激素參與調(diào)控月季生長發(fā)育的各個方面，向月季幼枝噴施GA3可以解除休眠，增加開花枝條的數(shù)量，促成長花枝。研究證明噴施300 mg·L-1的GA3，對株高、花枝長、花柄長均有促進作用，增加了葉片長寬比[50]。用1～10 mL·L-1的1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene,1-MCP）熏氣處理數(shù)小時也能有效延長月季的開花時間[51]。此外，利用乙烯利在月季展葉期進行噴灑或澆灌,可以延長或促成月季開花[52]。

2.3 修剪措施

在實際工作中,露天月季因生長溫度無法調(diào)節(jié),主要依靠修剪來控制月季花期，提高月季花的數(shù)量和質(zhì)量。修剪要遵循“疏弱留強、去橫留直”的原則，有利于維持樹勢及植株更新,提高花的品質(zhì)。在調(diào)控月季花期時，除了根據(jù)月季植株綜合長勢、修剪季節(jié)溫度和植株品種特性外，還要根據(jù)花芽的發(fā)育情況選擇適宜的修剪部位，以確保按預期開花和花的質(zhì)量。在適宜月季生長的季節(jié)，輕度修剪（修剪花下2～5 葉處），發(fā)出花枝短,現(xiàn)蕾早，修剪后20 d左右開花，花朵較?。恢卸刃藜簦ㄐ藜艋ㄏ?～9 葉處），圓芽發(fā)出的花枝長，現(xiàn)蕾時間較長,修剪后30 d 左右開花,花朵大；重度修剪（修剪枝條基部），芽活性低，發(fā)枝慢，易發(fā)徒長枝，花枝現(xiàn)蕾時間通常為40 d，花朵較大[53]。

3 結語

薔薇屬不同種類甚至同一種的不同品種都具有不同的開花習性，這里涉及到成花轉(zhuǎn)變和花芽分化。赤霉素途徑通過GA促進RoTFL1c的表達，抑制下游開花整合子的表達而抑制開花，形成一季開花；反之，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入引起RoTFL1c的突變，是連續(xù)開花的分子基礎。長日照條件下調(diào)控的RoCO和短日照條件下調(diào)控的RoCOL4是月季感受光周期信號，表現(xiàn)日中性的分子基礎。月季的開花習性與低溫、適溫和童期有關，其成花轉(zhuǎn)變表現(xiàn)出與春化途徑、年齡途徑和溫敏途徑的相關性。雜交試驗遺傳分析的結果也表明，月季的開花習性由多基因控制?？梢?，尋找RoTFLC1c和赤霉素途徑以外的開花途徑和開花習性相關的基因，是目前的研究重點。

月季的重瓣性和綠萼這2 種性狀與ABCDE模型中相關基因的突變有關，其中重瓣性受AG、AP2等基因的控制，綠萼的出現(xiàn)與A、C 類基因的異常表達有關，還可能與E類基因的過表達有關。重瓣性既是月季觀賞價值的重要體現(xiàn)，也是低溫傷害的結果和花朵開放的障礙，對于切花月季產(chǎn)業(yè)具有重大影響，需要找到有效的調(diào)控途徑。

月季具有生命周期短、花芽分化時間短、高度可變的倍性水平以及較完善的基因組，可作為木本植物花發(fā)育研究的模式植物[5]。目前，由于月季的轉(zhuǎn)化體系不夠穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因植株獲得困難，因此大多數(shù)月季基因的功能驗證在異源系統(tǒng)中進行。同時，月季的品種較多，雜合性較高，已測得的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)十分有限。今后可從基因組和轉(zhuǎn)錄組信息挖掘新基因，對成花關鍵基因的表達模式、成花轉(zhuǎn)錄因子的靶點分析等方面進行研究，不斷推進對月季成花機理和花形態(tài)建成的全面和深入理解。