低溫脅迫對(duì)小粒種咖啡幼苗生理特性的影響

黃麗芳， 龍宇宙， 李金芹， 董云萍， 王曉陽， 陳鵬，王憲文， 閆林.2*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 萬寧 571533； 2.海南省Sim Soonliang院士工作站，海南 萬寧 571533； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099； 4. 保山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 保山 678000）

咖啡是茜草科(Rubiaceae)多年生常綠灌木或小喬木，主要栽培的有小粒種咖啡（Coffea arabica）、中粒種咖啡（Coffea robusta）和大粒種咖啡（Coffea liberica），咖啡作為世界三大飲料作物之首，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值日益提高[1-2]。小粒種咖啡主要種植于云南，面積約12 萬hm2，占全國總面積的98%，產(chǎn)量居世界第13 位，咖啡已成為云南省第4大出口農(nóng)產(chǎn)品，在助力脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興及服務(wù)國家“一帶一路”倡議中發(fā)揮重要作用[3-4]。

作為我國咖啡主產(chǎn)區(qū)的云南省，冬季常有霜害和寒流等低溫危害。當(dāng)月平均溫度降至12.7 ℃時(shí)，小粒種咖啡植株出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象；當(dāng)溫度降至2～-1 ℃時(shí)咖啡樹整株受害，尚未投產(chǎn)的咖啡幼樹植株頂梢、側(cè)梢枯死，寒害嚴(yán)重的導(dǎo)致整株死亡，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。我國熱區(qū)土地面積小，適宜種植咖啡的區(qū)域有限，且由于中國緯度偏高，極端天氣的頻發(fā)也容易給咖啡產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來破壞性影響[6]。因此，培育和篩選抗寒性較高的咖啡品種是中國咖啡育種的重要目標(biāo)，開展咖啡抗寒性探究可以加快咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國外學(xué)者從抗氧化系統(tǒng)的生物學(xué)特性及礦物質(zhì)含量的變化上分析鑒定不同基因型咖啡的抗寒性[7-9]。我國學(xué)者早期采取田間自然鑒定方法篩選抗寒種質(zhì)，從種植地的選擇、栽培管理措施等方面進(jìn)行咖啡的防寒御寒研究[5,10-11]。近期的研究主要集中在低溫對(duì)不同基因型及不同嫁接方式的咖啡葉綠素?zé)晒狻⒐夂蠀?shù)的影響[12-13]。

‘卡蒂姆CIFC7963'是葡萄牙國際咖啡銹病研究中心用時(shí)20 年選育出的卡蒂姆品種的優(yōu)良世代（F6），該品種適應(yīng)性廣、較耐寒耐旱、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性強(qiáng)，在生產(chǎn)上大面積推廣，占云南咖啡生產(chǎn)面積的80%以上，是云南省咖啡生產(chǎn)的主栽品種[14]。本研究通過探究小粒種咖啡‘卡蒂姆CIFC7963'在低溫脅迫下的抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及細(xì)胞膜透性等，了解咖啡防御低溫傷害的機(jī)制，為抗寒性咖啡種質(zhì)資源的篩選奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步研究咖啡抗寒機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小粒種咖啡‘卡蒂姆CIFC7963'1年生實(shí)生苗來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃，材料統(tǒng)一栽植在泥炭土和沙土混合基質(zhì)的塑料盆中，選取生長(zhǎng)正常、無病蟲害和機(jī)械損傷的苗木放入人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫處理 試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)溫度梯度，分別為8、4、0、-2 ℃；光照強(qiáng)度為1萬 lx，光周期為晝夜12 h/12 h，相對(duì)濕度保持在70%左右。分別在低溫脅迫0、12、24、36、48 h 時(shí)采集葉片迅速置于液氮中冷凍，-80 ℃保存，用于測(cè)定葉片生理生化指標(biāo)；采集新鮮葉片立即進(jìn)行電導(dǎo)率的測(cè)定。0 h設(shè)為對(duì)照（CK），各處理3次重復(fù)，每重復(fù)5株。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 采用南京建成生物技術(shù)研究所測(cè)定試劑盒分別測(cè)定葉片的過氧化物酶（peroxidase，POD）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及脯氨酸（proline，Pro）、可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，具體操作參照說明書，每個(gè)處理測(cè)定3次重復(fù)，每重復(fù)5株。

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 隨機(jī)選擇處理后的葉片，避開主葉脈剪成長(zhǎng)寬均為0.2 cm的碎片，稱取0.2 g碎片加入20 mL去離子水，抽真空，放入三角瓶中并蓋上封口膜，在室溫下振蕩8 h，振蕩頻率80 r·h-1。采用雷磁DDS-307A 電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測(cè)定浸泡液的電導(dǎo)率（R1），再將盛有浸泡液的三角瓶置于沸水浴30 min，冷卻至室溫，然后測(cè)定浸泡液的電導(dǎo)率（R2），3次重復(fù)。相對(duì)電導(dǎo)率按以下公式計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)小粒種咖啡滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

低溫脅迫會(huì)影響小粒種咖啡的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，如脯氨酸（Pro）、可溶性糖、可溶性蛋白含量等，植物利用滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓和冰點(diǎn)，從而達(dá)到抵抗低溫對(duì)植株的影響。從圖1 可以看出，8 ℃低溫脅迫時(shí)，小粒種咖啡葉片的Pro 含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)上升的狀態(tài)，在4、-2和0 ℃低溫脅迫時(shí)呈先升后降的趨勢(shì)；Pro含量在8、4、0、-2 ℃脅迫48 h 時(shí)，與0 h 相比均差異顯著（P＜0.05）。從4 個(gè)脅迫處理來看，0 ℃時(shí)小粒種咖啡葉片的Pro 含量相對(duì)增幅較高，-2 ℃時(shí)的相對(duì)增幅較低。

圖1 不同處理下咖啡葉片的脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量Fig. 1 Proline， soluble protein and soluble sugar contents in coffee leaves under different treatments

在低溫處理過程中，可溶性蛋白含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)在8、4 ℃處理呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，0和-2 ℃處理則先上升后下降，0 ℃處理24 h、-2 ℃處理36 h 后可溶性蛋白含量受抑制，呈下降趨勢(shì)。8、0 和-2 ℃低溫脅迫處理組與0 h 差異均顯著（P＜0.05）。

可溶性糖含量與Pro、可溶性蛋白在不同低溫脅迫下的變化趨勢(shì)不同。低溫脅迫后，咖啡自身積累大量可溶性糖來阻止組織受寒害，因此可溶性糖含量均比0 h顯著增加（P＜0.05）。8、4、0、-2 ℃低溫脅迫48 h 時(shí)，小粒種咖啡葉片的可溶性糖含量比0 h 時(shí)分別增長(zhǎng)了0.94、1.14、1.05、0.18 倍。8 ℃處理時(shí)，可溶性糖含量呈逐漸上升的趨勢(shì)；4、0、-2 ℃處理時(shí)，可溶性糖含量先上升后下降，可溶性糖含量在-2 ℃處理36與48 h無顯著變化。

2.2 低溫脅迫對(duì)小粒種咖啡抗氧化酶活性的影響

由圖2 可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，小粒種咖啡總超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同溫度處理下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。8 ℃處理時(shí)，SOD 活性呈一直上升的趨勢(shì)，處理48 h 比0 h時(shí)增長(zhǎng)42.86%，差異顯著（P＜0.05）；4、0 和-2 ℃處理時(shí)，SOD 活性先上升后下降，4 ℃處理在36 h達(dá)到峰值，0 和-2 ℃處理均在24 h 時(shí)達(dá)到最大值，分別比0 h 時(shí)增加了65.08%、42.06%、49.21%，0 和-2 ℃處理48 h 時(shí)的酶活性與0 h 差異不顯著。

圖2 不同處理下咖啡葉片總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性Fig. 2 SOD， CAT and POD activities in coffee leaves under different treatments

過氧化氫酶（CAT）活性與SOD 活性變化趨勢(shì)相似，CAT活性在4個(gè)溫度處理48 h時(shí)均顯著高于0 h時(shí)（P＜0.05）。8 ℃處理48 h時(shí)，CAT活性顯著高于其他處理，比CK高出118.88%；4、0和-2 ℃處理均在24 h 時(shí)達(dá)峰值，分別比0 h 時(shí)顯著提高了121.88%、98.70%和184.11%，隨后活性逐漸下降，說明隨著小粒種咖啡葉片內(nèi)H2O2含量增加，CAT清除能力減弱，組織內(nèi)的過氧化程度加重造成寒害。

過氧化物酶（POD）活性的總體變化趨勢(shì)是先上升后降低，0 ℃低溫處理組與0 h 均差異顯著（P＜0.05），36 h 的POD 活性最高，為0.87 U·mg-1，是對(duì)照的2.9 倍。8、4 和-2 ℃在低溫處理24 h 時(shí)達(dá)到0.67、0.61、0.98 U·mg-1，與0 h 時(shí)相比，差異顯著（P＜0.05）；但處理48 h 時(shí)與0 h 時(shí)差異均不顯著。

2.3 低溫脅迫對(duì)小粒種咖啡丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

不同低溫脅迫下，丙二醛（MDA）含量均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)（圖3）。8和4 ℃處理MDA 含量維持在較低水平，最高不超過99 .00 nmol·g-1。0 和-2 ℃處理48 h 時(shí)MDA 含量較0 h顯著增加，分別為132.00和124.58 nmol·g-1。4 個(gè)溫度處理48 h 時(shí)較0 h 分別增加0.73、0.68、1.32、1.19倍。

相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律相似（圖3）。8 ℃處理組與0 h 均無顯著差異，相對(duì)電導(dǎo)率在30%～40%之間；4 和-2 ℃處理，在脅迫24、36、48 h 時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率較0 h 顯著增加；4、0 和-2 ℃處理，在脅迫48 h 時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率為84.69%、91.29%和98.35%，是0 h 的2.65、2.86 和3.08 倍，說明咖啡葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，咖啡植株受寒害嚴(yán)重。

圖3 不同處理下咖啡葉片丙二醛和相對(duì)電導(dǎo)率的含量Fig. 3 MDA and relative conductivity of coffee leaves under different treatments

2.4 各抗寒指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表1 的相關(guān)性分析表明，POD 活性與CAT 活性、相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；SOD 與CAT、可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；CAT 與Pro、可溶性糖、相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Pro 與可溶性糖、MDA 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；MDA 含量與相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表1 各抗寒性指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 1 Analysis of correlation of indexes for cold resistance

2.5 咖啡單項(xiàng)指標(biāo)主成分分析

對(duì)咖啡8個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析（表2），主因子分析過程相應(yīng)提取了A1、A2、A3 3 個(gè)主成分量，即前3 個(gè)因子對(duì)總方差的貢獻(xiàn)最大。A1、A2、A3的特征值分別為2.70、1.72、1.30，貢獻(xiàn)率分別為33.69%、21.48%、16.28%，累積貢獻(xiàn)率占總方差的71.45%。A1 在CAT、Pro 和可溶性糖含量上有較高載荷量，A2 在MDA 和相對(duì)電導(dǎo)率上有較高載荷量，A3 在可溶性蛋白含量上有較高載荷量。

表2 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 2 Coefficients and contribution rates of various comprehensive indicators

3 討論

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的主要成分，在植物抵抗低溫脅迫時(shí)能平衡細(xì)胞代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)水合。羅新義等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下游離脯氨酸含量增加，植物抗寒性增強(qiáng)；可溶性蛋白是植物光合作用的產(chǎn)物，用于蔗糖合成、維持植物代謝等[16-17]。利容千等[18]研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件下，植物代謝反應(yīng)減弱，水解作用增強(qiáng)，合成作用減小，可溶性蛋白等大分子化合物降解為氨基酸、可溶性糖和肽等物質(zhì)；受低溫脅迫后植物體內(nèi)可溶性糖含量的增加可以降低細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)，增強(qiáng)流動(dòng)性，防止細(xì)胞脫水及蛋白質(zhì)變性，起到防脫水的作用[19]。本研究中，小粒種咖啡在低溫脅迫后脯氨酸（Pro）、可溶性糖和可溶性蛋白含量均不同程度升高，這與在螺旋藻[20]、冬小麥[21]等植物上的研究結(jié)果相似。在低溫條件下，滲透物質(zhì)含量的增加會(huì)使植株的抗寒性得到提升[22]。小粒種咖啡葉片Pro含量和可溶性糖含量處理組較對(duì)照有所增加；可溶性蛋白含量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，先降低后增加，在0 ℃處理36 h 和-2 ℃處理48 h時(shí)可溶性蛋白含量略受抑制，說明在低溫脅迫過程中可溶性蛋白含量水解成糖類物質(zhì)來維持小粒種咖啡葉片細(xì)胞的生理功能。

抗氧化酶活性變化是判斷植物在低溫脅迫環(huán)境中生理機(jī)能的重要指標(biāo)[23]，植物在低溫脅迫下產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，從而造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，POD、SOD和CAT作為植物體內(nèi)的保護(hù)酶，可通過其協(xié)同作用來保護(hù)細(xì)胞膜[24]。研究表明，SOD 將O2-歧化成H2O2，再由POD 和CAT 等酶來完成清除，從而緩解活性氧和自由基帶來的侵害[25]，使植株在一定程度上忍耐和抵御低溫[26]。本研究在經(jīng)過4 個(gè)低溫脅迫處理后，葉片的POD、SOD 和CAT 活性大致呈先升后降的趨勢(shì)，這與王玲麗等[27]的研究結(jié)果相似，表明低溫脅迫誘導(dǎo)了小粒種咖啡植株體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的增強(qiáng)從而提高自身清除活性氧和自由基的能力，以減輕低溫對(duì)細(xì)胞膜的傷害；隨著溫度的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性受到抑制呈不同程度下降[28]。

細(xì)胞膜系統(tǒng)是生命有機(jī)體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，是植物細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境之間的一個(gè)界面，既能接受和傳遞信息，又能對(duì)環(huán)境脅迫做出反應(yīng)[29]，當(dāng)植物遭受到低溫脅迫時(shí)透性增加導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率變大，細(xì)胞膜嚴(yán)重受損[30-31]；丙二醛是低溫脅迫后積累的自由基和活性氧等過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的終端物質(zhì)，會(huì)損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及功能，與細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[32]。本研究中，在低溫脅迫過程中，MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率均呈不同幅度的增加，8 和4 ℃處理MDA 含量增加緩慢，咖啡幼苗對(duì)外界逆境的刺激反應(yīng)能做出較好地調(diào)節(jié)，維持系統(tǒng)平衡，0 和-2 ℃處理MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率急劇增加，說明細(xì)胞膜受到損傷，咖啡葉片細(xì)胞氧化程度較大，葉片受害嚴(yán)重，這與烤煙[33]和葡萄[34]中的研究結(jié)果相似。

綜上所述，小粒種咖啡Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD和CAT活性在8 ℃處理時(shí)呈平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，在4、0、-2 ℃處理時(shí)基本都先升后降；隨著溫度的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，POD 活性也先升高后降低。MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，變化趨勢(shì)也相似，2 個(gè)指標(biāo)都是隨著溫度降低逐漸增加。植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)是復(fù)雜的生理生化和能量代謝變化過程，通過觀察和測(cè)定不同低溫脅迫下小粒種咖啡1 年實(shí)生苗‘卡蒂姆CIFC7963'葉片中的滲透物質(zhì)含量、抗氧化酶活性、MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率的變化，了解了各指標(biāo)的變化規(guī)律及各指標(biāo)間的相關(guān)性，為咖啡抗寒品種的選育奠定基礎(chǔ)，后續(xù)還將在分子層面進(jìn)行更深入研究。