不同施肥措施對飼用燕麥土壤細菌群落多樣性的影響

靳建剛， 田再芳， 鄭敏娜， 康佳惠

（1.山西農業(yè)大學生態(tài)農牧研究所，山西 朔州 037200； 2.山西農業(yè)大學高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008）

21 世紀以來，牧區(qū)家畜飼養(yǎng)量逐步減少，牛羊肉和奶類生產的重心逐漸向農區(qū)和農牧交錯區(qū)轉移，畜牧業(yè)的這一發(fā)展趨勢極大地促進了農區(qū)-農牧交錯區(qū)人工草地的快速發(fā)展，人工草地的建設已成為草業(yè)發(fā)展中特別重要的組成部分[1]。近年來，隨著國家草產業(yè)政策的積極推進，飼用燕麥（Avena sativaL.）作為一種優(yōu)質禾本科牧草，其建立的人工草地在黃土高原農牧交錯區(qū)得到了較快發(fā)展，種植范圍逐步擴大，產業(yè)效應已初步顯現(xiàn)。飼用燕麥起源于地中海紅燕麥及其祖先野紅燕麥[2]，是牧區(qū)和農牧交錯區(qū)廣泛種植的一年生草料兼用作物，具有適應性強、營養(yǎng)價值高、耐鹽堿等優(yōu)良特性[3]，主要以燕麥青（干）草、青貯燕麥和燕麥籽實等方式被家畜利用[4]，在農牧交錯區(qū)的畜牧業(yè)生產和生態(tài)經濟建設中發(fā)揮著重要作用。相對于其他禾本科牧草，飼用燕麥具有更高的產量和應用前景，相應地也需要更加合理的營養(yǎng)水平來保障其營養(yǎng)品質和產量。

在現(xiàn)階段飼用燕麥人工草地的生產中，施肥是草地建植和田間管理中重要的管理措施之一。當肥料（包括無機肥和有機肥）等外源物質輸入到土壤后，會對土壤的營養(yǎng)狀態(tài)和微生物群落產生顯著的影響。合理施肥不僅可以改善土壤結構[5-7]，還可以豐富微生物群落和微生物活性[8]，提高肥料利用率[9]。然而，在生產中為了追求高產，農戶經常過量施用化肥，不僅嚴重污染土壤資源，影響土壤養(yǎng)分庫和微生物多樣性的可持續(xù)發(fā)展，還會威脅食品安全、影響全民健康[8]。因此，在飼草燕麥草地生產中，對無機肥、有機肥的施用必須找到一個平衡點，以實現(xiàn)干旱半干旱區(qū)飼用燕麥人工草地土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，國內燕麥主產區(qū)關于無機-有機肥配施對土壤理化性狀影響的研究較多，但對燕麥根際土壤微生物群落的研究較少。因此，為研究晉北生態(tài)區(qū)不同施肥措施對燕麥根際微生物多樣性的影響，以不同施肥處理下飼用燕麥的根際土壤微生物為研究對象，采用高通量測序技術，探討不同施肥處理下燕麥根際土壤細菌群落的多樣性及其結構組成，并結合土壤養(yǎng)分狀況和飼用燕麥植株的生物產量，擬優(yōu)選出最佳施肥模式，為晉北地區(qū)燕麥飼草的種植和提質增效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗于2021年在山西農業(yè)大學生態(tài)農牧研究所的野外試驗基地（39°33′—41°14′N、113°14′—114°44′E）進行。試驗地是典型的北方農牧交錯區(qū)，海拔1 350 m，屬大陸性季風氣候，農業(yè)區(qū)劃為中溫帶干旱區(qū)。試驗地耕層土壤（0—20 cm）容重1.48~1.53 g·cm-3，pH 8.46，土壤有機質含量14.61 g·kg-1。

1.2 試驗材料

選用飼用燕麥品種‘甜燕麥’為試驗材料，由國家燕麥產業(yè)體系大同試驗站提供。試驗所用肥料包括常規(guī)商用化肥和自制有機肥，其中，商用化肥分別為尿素（CO（NH2）2， 含N≥46%）、過磷酸鈣（含P2O512.0%）和氯化鉀（含K2O 60.0%）；自制有機肥以牛糞為主要原料（有機質含量16.5%），添加1%的腐熟劑處理后制成，其N、P2O5、K2O含量分別為0.046 3、 0.021 0、 0.060 1 g·kg-1。

1.3 試驗設計

試驗以不施肥處理為對照（CK），分別設置僅施用商用化肥（T2）及商用化肥與有機肥分別按照 9∶1（T3）、8∶2（T4）、7∶3（T5）、6∶4（T6）和 5∶5（T7）的比例配施，共計7個處理，每處理3次重復，總計21個小區(qū)。其中，T2處理氮、磷、鉀的施用量分別為180、90和90 kg·hm-2；T3、T4、T5、T6、T7處理氮的總用量與T2處理一致，其有機肥施用量按照配施比例計算，磷和鉀的不足部分用相應化肥補足，具體施用量見表1。試驗處理按照完全隨機的方式排列，小區(qū)面積4 m×5 m，小區(qū)間間隔1 m。

表1 試驗各處理的肥料施用量Table 1 Specific information processed by the experiment

飼用燕麥于2021年5月25日條播，播種量150 kg·hm-2，行距25 cm，播種深度4~5 cm。各肥料均采用撒施的方式施入，其中氮肥分別于播種前和拔節(jié)期按6∶4的比例分2次施入；磷肥、鉀肥和有機肥均于播種前一次性施入。試驗期間各小區(qū)其他管理措施基本一致，播前灌水1次，生育期內人工除草，于乳熟期采集土壤樣品和植株樣品。

1.4 樣品采集與測定

1.4.1 株高和干草產量測定 于2021年8月20日（乳熟期）進行取樣、測產。每個小區(qū)去除小區(qū)兩側邊行，隨機選擇10株植株，從植株主莖的地表至穗頂部（不含芒）測量株高（plant height，HP）；并隨機選擇3個2 m樣段齊地面刈割，稱其鮮重，然后于105 ℃烘箱中殺青30 min，65 ℃下烘干至恒重，測定干草產量（yield，Y），以kg·m-2為單位計算。

1.4.2 土壤樣品采集和測定 于2021年8月18日采集土壤樣品。各小區(qū)按對角線采樣法，每個小區(qū)選取6點用土鉆取0—20 cm土層樣品及植物根際0~10 mm的土樣，各樣品混勻后采用四分法取0.5 kg土樣，3次重復。取樣后，將其分為2份，1份裝入離心管液氮封存用于土壤微生物分析；另1份風干后用于土壤pH、有機質（soil organic matter，SOM）、全氮（total nitrogen，TN）、全磷（total phosphorus，TP）、全鉀（total potassium，TK）速效氮（available nitrogen，AN）、速 效 磷（available phosphorus，AP）、速 效 鉀（available potassium，AK）、有機碳（soil organic carbon，SOC）和可溶解性鹽（soluble salt，SS）含量等土壤理化性質的測定，各指標參照鮑士旦[10]的方法進行測定。

1.4.3 土壤總DNA提取及基因擴增 使用MN NucleoSpin 96 Soil（MN，germany）試劑盒進行土壤細菌DNA的提取，每個樣品重復3次，采用PacBio測序平臺的通用引物（正向27F和反向1492R）以細菌16S rRNA基因全長序列（V3~V4）為目的片段進行PCR擴增，擴增體系參照鄭敏娜等[8]的方法。擴增合格樣品送北京百邁克生物有限公司進行PacBio平臺測序分析。

1.5 生物信息學分析

對原始下機subreads進行校正得到CCS（circular consensus sequencing）序列（SMRT link，version8.0），使用lima(v1.7.0)軟件得到符合要求的高質量CCS序列，并進行生物信息學分析。利用QIIME軟件對優(yōu)質序列在相似性≥97%的水平上進行 OUT（operation taxonomic unit）聚類，基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析；利用Mothur v.1.30軟件和R語言工具進行α多樣性分析[9]；利用軟件QIIME進行β多樣性分析[9]等；通過R語言分析作圖。使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤養(yǎng)分及飼用燕麥地上生物量的影響

不同施肥處理下飼用燕麥根際土壤理化特性和生物產量測定結果如表2所示。不同施肥處理對土壤全氮、速效氮和有機碳含量無顯著影響，各處理間差異不顯著；對土壤速效鉀和速效磷含量有顯著影響。各處理的速效鉀含量在189.36~298.99 mg·kg-1，其中T7處理最高，顯著高于其他處理；T4處理次之。各處理的速效磷含量在8.49~11.09 mg·kg-1，其中T4 處理最高，顯著高于其他處理；T5處理次之，但與其他處理間差異不顯著。不同施肥處理對土壤可溶解性鹽含量影響顯著，隨著有機肥施入量的增加，土壤中可溶解性鹽含量逐漸降低，其中CK顯著高于施肥處理；T4、T5、T6、T7處理間差異不顯著，但顯著低于其他處理。此外，T4處理飼用燕麥的株高為107.32 cm，顯著高于除T5處理外的其他處理；干草產量為9 245.52 kg·hm-2，顯著高于除T5和T6處理外的其他處理。

表2 不同處理下土壤理化性質和干草生物量Table 2 Physical and chemical properties of soil and biomass of oats under different treatments

2.2 土壤細菌序列及其多樣性指數(shù)

利用PacBio平臺測序結果顯示，所有土壤樣品共獲得1 605 355個序列讀數(shù)，基于97%的相似性共獲得5 902個OTU，樣本文庫的覆蓋度達99.0%以上。分類學分析將細菌群落劃分為28個門，73個綱，187個目，347個科，533個屬。

從表3可知，T2和T4處理樣品中檢測到的OTU數(shù)量較CK顯著增加14.02%和9.59%。不同施肥處理下飼草燕麥根際土壤細菌群落的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別表現(xiàn)為：T4＞T6＞T5＞T2、T3、CK和T6、T4＞T5＞T2、T3、CK；T6處理細菌群落的Shannon指數(shù)顯著高于除T7處理外的其他處理。

表3 不同改良措施處理下土壤細菌測序及群落α 多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial sequencing and community α diversity index of soil treated with different improvement measures

2.3 不同施肥處理土壤細菌的群落組成

在門水平上，7個處理的土壤細菌群落共檢測到28個類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）的相對豐度較高，累計相對豐度在84.81%以上，為優(yōu)勢菌門（圖1A）。對不同施肥處理進行比較，變形菌門在T2處理中的相對豐度最高，為40.10%，在T7處理中最低，為20.08%；厚壁菌門在T7處理中的相對豐度最高，為26.08%，顯著高于除T6處理外的其他處理；擬桿菌門在 T7、T6和T5處理的相對豐度較CK處理分別提高10.32%、9.78%和9.73%；放線菌門在T4處理中的相對豐度最高，為17.68%，顯著高于其他處理；綠彎菌門在T5、T6、T7處理中的相對豐度顯著低于CK處理；酸桿菌門在T2處理中的相對豐度最高，為11.14%；藍藻細菌門在T4處理中的相對豐度最高，為12.06%。

在屬水平上，7個處理的飼草燕麥根際土壤細菌群被劃分為533個類群，其中相對豐度大于1%的細菌類群包括鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、uncultured_bacterium、乳 酸 桿 菌（Lactobacillus）、uncultured_bacterium_f_A4b（圖1B）。鞘脂單胞菌屬為第1優(yōu)勢菌屬，在CK處理中的相對豐度最高，為 5.39%；uncultured_bacterium_c_Subgroup_6在CK、T2、T3處理中的相對豐度較高，均超過5.50%；uncultured_bacterium、乳酸桿菌、uncultured_bacterium_f_A4b在T7和T6處理中的相對豐度較高，顯著高于其他處理。

圖1 不同施肥處理下細菌的結構組成Fig. 1 Composition and structure of bacterial under different fertilization treatments

2.4 不同處理間細菌的群落差異

主 坐 標 分 析（principal coordinat analysis，PCA）結果（圖2）顯示，不同施肥處理形成了不同的細菌群落。第1坐標（PC1）物種累積百分比方差占33.36%，第2坐標（PC2）物種累積百分比方差占18.97%，累計52.33%，物種差異可用這2個軸來解釋。由圖2可知，T4、T5、T6、T7處理與CK、T2、T3處理間差異較大。

為了進一步確定與不同施肥處理相關的特定細菌類群，根據(jù)分類學組成，使用線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）比較了7個處理的細菌群落組成。結果（圖3）顯示，根據(jù)設定的篩選標準（LDA＞4）共發(fā)現(xiàn)58個類群在統(tǒng)計學上有顯著差異（P＜0.05），其中，T4處理中檢測到24個，主要包括放線菌門（微球菌科Microscillaceae）、綠藻門（束鞘藻目、Coleofasciculaceae和念珠藻目Nostocales）和芽單胞菌門（芽孢菌目Bacillales）；T5處理檢測到21個，包括微菌桿科（Microbacteriaceae）、類芽孢菌科（Paenibacillaceae）等； CK則富集了較多擬桿菌目（Bacteroidales）的細菌菌群。

圖3 不同改良措施下土壤細菌群落系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Cladogram of soil bacterial community under different treatments

2.5 不同處理的細菌群落結構與其環(huán)境因子的關系

在屬水平，采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）進一步分析了差異物種與主要環(huán)境因子之間的關系，結果（圖4）表明，第1個成分（RDA 1）解釋了細菌菌群總變異的21.63%，第2個成分（RDA 2）解釋了細菌菌群總變異的12.71%，累積解釋率34.34%。此外，RDA 表明不同環(huán)境因子對細菌群落的影響不同。相關分析結果（表4）表明，TN、AN、SOC和AP含量與戴沃斯氏菌屬（Devosia）、交替赤菌屬（Alterythrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Bacilllus Sphingomonas）的相對豐富度呈極顯著正相關（P＜0.01），與紅球菌屬（Rhodococcus）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）呈顯著負相關（P＜0.05）；AK含量與短波單胞菌屬（Brevundimonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）的相對豐度呈顯著正相關（P＜0.05），與紅球菌屬（Rhodococcus）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）呈顯著負相關（P＜0.05）。

表4 基于屬水平的細菌群落和環(huán)境因子之間相關分析Table 4 Correlation analysis between bacterial communities and environmental factors at the genus level

圖4 屬水平上不同施肥處理下土壤細菌的相對豐度和土壤環(huán)境因子間的RDA分析Fig. 4 RDA analysis of soil bacteria relative abundance and among soil environmental factors under different fertilization

3 討論

人工草地是我國重要的畜牧業(yè)生產基地。目前，在人工草地的建植與管理中，化肥施用量偏高，有機肥投入不足，從而造成耕地土壤退化，耕性變差，草產品品質下降等問題。因此，在飼用燕麥的生產過程中探索合理高效的有機-無機配施比例有助于土壤和草地的可持續(xù)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在草地農業(yè)生產中增施有機肥可提高土壤中有效鉀和有效磷含量[9,11-12]；但對土壤全氮、有效氮和有機碳含量影響較小[13-14]，這與本研究結果一致。本研究表明，隨著有機肥施用量的增加、無機肥施用量的減少，土壤中可溶解性鹽含量逐漸降低，表明增施有機肥可有效改善土壤結構，降低土壤中鹽分含量；而研究中土壤有機質含量未發(fā)生顯著變化，可能是有機肥施用時間較短，商麗榮等[9]也得出類似的結論。此外，本研究T4處理下的飼用燕麥株高和生物產量最高，一方面可能是由于施用有機肥改善了土壤生態(tài)；另一面該處理下施用的有機、無機肥用量保障了飼用燕麥的正常生長發(fā)育，且氮素利用率達到最大化。

農業(yè)管理措施（例如施肥）作為對土壤擾動的一種重要方式，也會給微生物群落的生物多樣性和豐富度帶來顯著影響[15-18]。本研究表明，不同比例的無機-有機肥配施對細菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均有明顯影響，這可能是因為隨著有機肥施用量的增加，改善了土壤結構，促進了有機物的分解，從而影響了微生物種群結構。對微生物群落結構和組成的分析結果表明，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）為優(yōu)勢菌門，但其在不同處理中的相對豐度又存在差異，與前人研究結果一致[8,19-24]。綠彎菌門（Chloroflexi）含有綠色色素，能夠通過光合作用產生能量[9]，Lino等[25]研究表明，其菌群數(shù)量與植物地上生物量呈顯著正相關。酸桿菌門 (Acidobacteriota) 是近年來新分離的細菌類群[8]，其作用還有待進一步研究。

土壤微生物群落會在不同程度的擾動下表現(xiàn)出不同的響應策略[8]。本研究也表明，不同處理下土壤細菌的群落組成存在差異，其中Microscillaceae、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、第 三 節(jié) 類 芽 胞 桿 菌（Paenibacillaceae）在T4和T5處理中的相對豐度較高，較CK處理的增幅均在5.42%以上；乳酸桿菌（Lactobacillales）是有機物降解的重要參與者，其在T2處理中的相對豐度較高；而Chitinophagales可代謝碳水化合物，是碳代謝的重要參與者[26]，其在CK處理中的相對豐度較高。此外，不同無機-有機肥配施處理引起的環(huán)境因素變化對不同微生物群的影響不同，土壤TN、AP、SOC和AK含量對細菌群落有著更為顯著的影響。

綜上所述，無機肥與有機肥按照8∶2的比例配施不僅能夠有效降低土壤中可溶解性鹽含量，還能提高土壤中有效鉀和有效磷含量，且增加土壤細菌群落的多樣性指數(shù)，使其優(yōu)勢菌群更有利于土壤正向演替，增加植物地上部生物產量。未來，對于不同比例無機-有機肥配施對土壤菌群及微環(huán)境的影響機理還有待進一步深入研究。