大蠟螟幼蟲腸道微生物聚乙烯降解酶基因的表達(dá)及性質(zhì)分析

柳春雨， 門麗娜， 連雅琴， 張宇宏， 張志偉*， 張偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 晉中 030801； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

聚乙烯（polyethylene，PE）是C、H元素組成，由乙烯為單體進行聚合而成的聚合物，可表示為-[CH2-CH2]n-[1]。聚乙烯具有的飽和線性碳?xì)滏?、高拉伸強度、低氣體滲透性以及低成本等特性，使其成為應(yīng)用最廣泛的塑料品種之一[2-4]。然而，塑料污染對環(huán)境和健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。微塑料目前已經(jīng)在全球各個水域都有發(fā)現(xiàn)，由于其體積小，鳥類和魚類很容易攝入并且在體內(nèi)逐漸累積，最終導(dǎo)致死亡[5-6]，且微塑料在食物鏈中的富集最終可能對人類健康產(chǎn)生不利影響[7-9]。

在過去的幾十年，填埋[10]和熱處理[11]是塑料廢物最常用的處理方法。但這些方法會對土壤和大氣造成污染，目前常用的塑料垃圾處理方法是機械回收[12]、能源回收[13]和生物降解[14]。相較于其他處理方法，生物降解是一種綠色經(jīng)濟的污染解決途徑，在塑料垃圾處理方面顯示出明顯的優(yōu)勢和前景[15]。生物降解是指在生物和酶的作用下將有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化成簡單無機物的過程。聚乙烯的生物降解過程十分復(fù)雜，其研究方向主要有兩個：一是降解聚乙烯微生物的分離純化并進行解析[16]；二是研究復(fù)雜環(huán)境中存在的混合降解菌系，如海水、土壤、昆蟲腸道微生物等[17]。北京航空航天大學(xué)楊軍教授團隊發(fā)現(xiàn)大蠟螟（Galleria mellonellaL.）幼蟲可以取食聚乙烯，幼蟲腸道微生物作用于塑料，會發(fā)生解聚反應(yīng)[18]。此外，楊軍教授團隊還順利從印度谷螟（Plodia interpunctella）幼蟲腸道中分離到2株聚乙烯降解細(xì)菌，分別是芽孢桿菌YP1和腸桿菌YT1[19]。

盡管聚乙烯降解菌被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但其中參與聚乙烯降解的關(guān)鍵酶卻較少被報道。目前研究認(rèn)為聚乙烯降解酶主要有錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和細(xì)胞色素P450酶等[15,20]。這些酶參與聚乙烯降解過程，如末端氧化、鏈斷裂和脂肪酸代謝等[21]，但詳細(xì)催化機制還需進行深入研究。最近結(jié)合量子力學(xué)的一項研究表明，利用氧化酶或加氧酶解聚聚乙烯的碳碳鍵是有可能實現(xiàn)的[22]。因此，本研究基于高通量宏基因組測序技術(shù)從大蠟螟的腸道微生物中挖掘到2個過氧化物酶基因，并將其在大腸桿菌中成功表達(dá)，對重組酶進行純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，使用接觸角測試法進一步確定其對聚乙烯的降解效率，為生物降解聚乙烯提供了新的依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 腸道中微生物菌群來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護實驗室飼養(yǎng)的大蠟螟幼蟲，該蟲種群繼代培養(yǎng)20代以上。

大腸桿菌（Escherichia coli）克隆菌株Top10和表達(dá)菌株BL21(DE3)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pET30a(+)質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 試劑和材料 試驗使用的聚乙烯塑料膜片為中國燕山石化生產(chǎn)的低密度聚乙烯（low density polyethylene，LDPE）膜。DNA聚合酶和同源重組酶購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；過氧化氫購自上海阿拉?。ˋladdin）生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)無碳源培養(yǎng)基：NaCl (0.005 g·L-1)、MgSO4·7H2O (0.7 g·L-1)、KH2PO4(0.7 g·L-1)、K2HPO4(0.7 g·L-1)、MnSO4·H2O (0.001 g·L-1)、ZnSO4·7H2O (0.002 g·L-1)、 NH4NO3(1.0 g·L-1)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，最后加入用0.22 μm濾膜過濾的FeSO4·7H2O (0.002 g·L-1)。

1.2 研究儀器

試驗儀器包括PCR儀（Bio-Rad 公司）、搖床（江蘇太倉市科教器材廠）、超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）、?KTATM蛋白純化儀（美國GE Healthcare公司）、酶標(biāo)儀（Thermo-354，美國熱電公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 大蠟螟幼蟲排泄物的收集 將5齡期的大蠟螟幼蟲按照飼料組（D組）、塑料組（PE組）、饑餓組（C組）進行飼養(yǎng)，每組3個生物學(xué)重復(fù)。其中，D組一直飼喂飼料；PE組幼蟲只被提供PE塑料膜；C組一直饑餓至研究結(jié)束。飼養(yǎng)1周后將幼蟲取出空置24 h，然后收集其排泄物進行傅立葉變換紅外吸收光譜（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析。

1.3.2 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物分析 飼養(yǎng)1周后隨機挑選健康的大蠟螟幼蟲，解剖出的腸道內(nèi)容物用1 mL滅菌生理鹽水沖洗，-80 ℃冷凍備用。大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物的宏基因組分析委托北京奧維森基因科技有限公司進行，宏蛋白質(zhì)組分析委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所進行。

1.3.3 聚乙烯降解關(guān)鍵酶目的片段的擴增 根據(jù)組學(xué)分析結(jié)果預(yù)測聚乙烯降解關(guān)鍵酶，并設(shè)計酶基因擴增引物(8747-F:inf-CACATGGACAGCC CAGATCTATGAGCACGTCAGACGAGACCAATA;8747-R: TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCTTCA CGTCAAAACGGTCCAAA；5341-F: AAGAAGGA GATATACATATGATGTCCTTGATTAACACCAAA ATTA;5341-R: CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGA TTTTACCGACCAGATCCAAAGAT)和載體擴增引物(30a-cF:CACCACCACCACCACCACTGAGAT;30a-cR:CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA AAATT)。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的大蠟螟幼蟲腸道宏基因組DNA作為模板進行PCR擴增，得到2個聚乙烯降解酶POD8747 和AhpC5341的DNA片段，對擴增到的序列片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá) 通過BglⅡ和NotⅠ 酶切，或PCR方式獲得pET30a(+)載體質(zhì)粒片段，然后經(jīng)同源重組方式連接目的片段，將連接體系置于50 ℃金屬浴中，連接15 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliTop10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行PCR擴增驗證和DNA測序驗證，驗證正確的菌落即可擴大培養(yǎng)提取得到重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒pET30a(+)-POD8747、pET30a(+)-Ahpc5341轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)菌株，涂布于含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆轉(zhuǎn)接至含有卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm吸光值為0.6~0.8時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)蛋白18~20 h。

1.3.5 重組蛋白純化 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，用適量20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸，超聲波破碎細(xì)胞壁，破壁菌液經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min后，收集上清液（粗酶液），用裝有鎳（Ni2+）親和層析柱的?KTATM蛋白純化儀對粗酶液進行純化。

1.3.6 重組過氧化氫酶活力測定 將30% H2O2溶液用 0.2 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋49倍后得到H2O2工作液，將1 mL 0.2 mol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液和0.9 mL H2O2工作液混合均勻，放入37 ℃水浴鍋中孵育3 min，然后加入0.1 mL酶液反應(yīng)5 min，加入32.4 mmol·L-1鉬酸銨溶液以鈍化過氧化氫酶活性，靜置10 min后在405 nm波長下用酶標(biāo)儀測定光吸收值。1個酶活單位（U）定義為在37 ℃、 pH 7.0條件下每分鐘消耗1 μmol H2O2所需要的酶量。

1.3.7 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析 最適溫度測定：在50 mmol·L-1pH 7.4 的 Na2HPO4-NaH2PO4底物緩沖液中，于20~90 ℃測試樣品過氧化氫酶活力。

最適 pH的測定：在50 ℃條件下，分別在pH 5.0~6.0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6.0~8.0 (50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4）、pH 8.0~9.0 (50 mmol·L-1Tris-HCl)、pH 9.0~10.0 (50 mmol·L-1甘氨酸-NaOH)和pH 10.0~11.5 (BR緩沖液-NaOH)的底物緩沖液下測定樣品過氧化氫酶活力。

1.3.8 重組酶降解聚乙烯性能分析 將PE膜裁剪成4 cm×4 cm膜片，在75%乙醇溶液中浸泡3 h，取出晾干后在紫外燈下照射1 h，用滅菌超純水沖洗3次后作為標(biāo)準(zhǔn)PE膜備用。將標(biāo)準(zhǔn)PE膜放入已滅菌的磷酸鹽緩沖液中，加入酶液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置7 d，膜取出后用10%的SDS溶液浸泡清洗，然后經(jīng)超純水浸泡清洗3次，干燥處理后進行疏水性測試。

1.3.9 蛋白序列分析 使用VectorNTI 11.5軟件預(yù)測蛋白理論分子量和等電點，使用SignalP-5.0平臺（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析信號肽，使用BLASTP工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蠟螟幼蟲腸道排泄物分析

對大蠟螟幼蟲腸道排泄物進行FTIR分析，結(jié)果如圖1所示。PE組和D組在C-O (1 000 cm-1)和R-OH (3 000~3 500 cm-1)存在特征峰，說明這2組幼蟲排泄物存在氧的摻入，發(fā)生了生物氧化反應(yīng)，而C組的幼蟲排泄物沒有氧的摻入。

圖1 大蠟螟幼蟲排泄物的傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 1 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of Galleria mellonella L. larvae frass

2.2 聚乙烯降解酶基因篩選

結(jié)合大蠟螟幼蟲腸道宏基因組和宏蛋白組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了聚乙烯降解酶候選基因庫（表1），并從中篩選過氧化物酶POD8747和烷基過氧化氫酶AhpC5341進行重組表達(dá)和降解性質(zhì)分析。

表1 聚乙烯降解酶候選基因庫Table 1 Candidate gene library of polyethylene degrading enzyme

2.3 目的基因的擴增、載體構(gòu)建

POD8747蛋白含726個氨基酸，理論分子量為79.4 kD，預(yù)測等電點5.09， SignalP 5.0軟件預(yù)測無信號肽，與來自腸桿菌Enterobacter cancerogenus的過氧化氫酶（登錄號WP_006179188）序列相似性達(dá)到99%。AphC5341蛋白含187個氨基酸，理論分子量為20.6 kD，預(yù)測等電點5.02，SignalP 5.0軟件預(yù)測無信號肽，與來自腸桿菌屬Enterobacter的烷基過氧化氫酶（登錄號WP_006177103）序列相似性達(dá)到100%。

從大蠟螟幼蟲腸道宏基因組中擴增得到了POD8747和AhpC5341基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，觀察到有明亮單一的特異性條帶，POD8747和AhpC5341基因分別為2 181和564 bp（圖2）。利用同源重組技術(shù)將目的片段連入pET30a(+)載體，并進行測序驗證確認(rèn)。

圖2 PCR擴增目的基因核酸電泳分析Fig. 2 DNA electrophoresis analysis of PCR amplified target gene

2.4 聚乙烯降解酶的表達(dá)和純化

將POD8747和Ahpc5341基因連接pET30a(+)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）后進行誘導(dǎo)表達(dá)。2種酶蛋白的理論分子量分別為79.4和20.6 kDa，經(jīng)SDS-PAGE分析（圖3），POD8747和AhpC5341在超聲破碎上清液和沉淀中對應(yīng)目的條帶均與理論分子量相符，說明重組蛋白成功在BL21（DE3）中正確表達(dá)，但有部分為不可溶性蛋白。經(jīng)鎳親和層析純化，在洗脫液中獲得純化后的POD8747和AhpC5341酶蛋白用于后期分析。

圖3 聚乙烯降解酶蛋白重組表達(dá)和純化Fig. 3 Recombinant expression and purification of polyethylene degrading enzyme protein

2.5 聚乙烯降解酶酶學(xué)性質(zhì)分析

酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果（圖4）表明，POD8747在50 ℃時過氧化氫酶活性最高，溫度超過50 ℃后，其活性明顯下降；AhpC5341的最適溫度也是50 ℃，但其在30~40 ℃仍能維持80%以上的活力。在50 ℃條件下，POD8747和AhpC5341的最適pH均為8.0（圖4）。

圖4 POD8747和AhpC5341最適溫度和最適pHFig. 4 Optimal temperature and optimal pH of POD8747 and AhpC5341

2.6 聚乙烯降解酶處理PE效果分析

使用重組酶液對PE膜處理7 d，通過測試PE膜表面接觸角表征塑料。結(jié)果（圖5）表明，未經(jīng)處理的PE膜接觸角為100°，經(jīng)POD8747處理后的PE膜接觸角為(90.07±3.45)°，經(jīng)AhpC5341處理后的 PE 膜接觸角為(91.73±1.70)°，說明 POD8747和AhpC5341對PE塑料具有降解效果。

圖5 PE膜接觸角分析Fig. 5 Polyethylene contact angle test

3 討論

大蠟螟幼蟲可以咀嚼PE薄膜，F(xiàn)TIR檢測結(jié)果顯示，幼蟲取食塑料后排泄物中出現(xiàn)了含氧官能團的特征峰，表明塑料在幼蟲腸道中發(fā)生了有氧催化反應(yīng)。羥基/羧酸基團的增加驗證了酶處理PE膜后從疏水到更親水的表面特性轉(zhuǎn)變，說明PE經(jīng)幼蟲腸道后發(fā)生氧的摻入，這與Liu等[23]和Gao等[24]的研究結(jié)果一致，再次證明大蠟螟幼蟲具有降解PE塑料的能力。

挖掘聚乙烯降解菌株和降解酶的常規(guī)方法是先從環(huán)境中篩選可培養(yǎng)的降解菌株，然后從中挖掘降解酶[15-16,19-20]。本研究不依賴可培養(yǎng)菌株的篩選，基于大蠟螟腸道宏基因組和宏蛋白組信息，挖掘得到對聚乙烯有降解作用的過氧化物酶POD8747和烷基過氧化氫酶AhpC5341，說明宏組學(xué)方法可用于篩選新的聚乙烯降解酶，且后期通過大量數(shù)據(jù)的篩選，仍有挖掘大量聚乙烯降解酶的潛力。為了確認(rèn)酶蛋白降解聚乙烯的生物學(xué)活力，本研究采用接觸角進行活性表征。PE膜表面為疏水結(jié)構(gòu)，降解酶與PE膜接觸較為困難，經(jīng)POD8747和AhpC5341處理后，PE膜接觸角變小，說明POD8747和AhpC5341可以催化PE膜表面氧化，進而表面親水性增加，可促進其他多種降解酶進一步降解PE。研究表明，大多數(shù)過氧化物酶的催化機制是相似的，包含3個步驟。首先，在催化循環(huán)中產(chǎn)生了具有高能量的Fe(IV)AO，并將其假定為氧化劑來氧化PE薄膜表面，酶對高密度聚乙烯（high density polyethylene, HDPE）表面氧化的機制為在反應(yīng)開始時，苯酚優(yōu)先被氧化，隨后被分解成相應(yīng)的苯氧基自由基；其次，苯氧基自由基從聚乙烯鏈中提取氫，并在高密度聚乙烯鏈上形成一個表面自由基；最后，形成的自由基（聚乙烯自由基）與空氣接觸后，迅速轉(zhuǎn)變成過氧化物，然后通過過氧化酶分解將極性基團引入HDPE薄膜[25]。

有研究者在大腸桿菌中克隆了3個烷烴羥化酶基因alkb、alkb1和alkb2，并發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的重組菌株能夠降解低分子量的PE塑料[26]。Sanlnisverdes等[27]使用電子顯微鏡來分析蠟螟的唾液，并將它們對塑料的降解追溯到2種酚氧化酶，這些酶共同作用在PE塑料表面，幾個小時內(nèi)PE膜產(chǎn)生凹坑并且被氧化，這2種酶被視為對抗塑料降解的新武器，但仍需要其他多種酶的協(xié)同作用。本研究篩選到的PE降解酶能夠增加PE膜的親水性，利于其他降解酶與PE膜的接觸，這種多酶協(xié)同酶系有利于PE的高效降解。

本研究從大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物宏組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選到2個PE降解候選酶，它們具有在PE膜表面定植和降解PE的潛力。通過氧化PE膜增加其親水性，這有利于其他降解微生物的定植，促進形成細(xì)菌、酶和PE膜催化體系。后期通過多種酶的組合作用，有望進一步提高PE膜親水性，促進多酶協(xié)同催化PE塑料的生物降解。