高通量技術(shù)分析‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌多樣性

趙柏霞， 閆建芳

（1.大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116036； 2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

甜櫻桃（Prunus aviumL.）源于歐洲，因其果實(shí)具有鮮艷的色澤、較高的營養(yǎng)價(jià)值及上乘的口感備受消費(fèi)者喜愛，且其果實(shí)發(fā)育期短、成熟期早、種植效益高，現(xiàn)已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)廣泛栽植。近些年，甜櫻桃在中國也發(fā)展迅速，種植面積和產(chǎn)量都已經(jīng)超過世界排名第一的土耳其，成為一些地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)[1]。

植物內(nèi)生細(xì)菌存在于宿主植物組織[2]，且表現(xiàn)出多種生物活性，如促生長、抗旱、耐熱、抗病蟲害、拮抗病原體、溶磷、解鉀、固氮等[3-10]，還具有降解環(huán)境中污染物和生物修復(fù)的功能[11-12]。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于多種糧食作物和水果、蔬菜及藥用植物中[13-16]，已報(bào)道的約有50多個(gè)屬，上百個(gè)種[17]。然而，對于甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌方面的研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

目前對于甜櫻桃內(nèi)生菌的研究僅停留在分離培養(yǎng)和功能菌株篩選方面，張立新等[18]、郗良卿等[19]在‘紅燈’和‘美早’甜櫻桃果實(shí)中分離到了具有拮抗櫻桃病害的內(nèi)生細(xì)菌。郭建偉等[20]在櫻桃樹皮、1年生枝條及葉片中分離到了21株內(nèi)生細(xì)菌，其中8株具有拮抗流膠病能力，不同組織內(nèi)生細(xì)菌的種群密度表現(xiàn)為樹皮（主干）＞葉＞枝（1年生）。但是，大部分內(nèi)生菌為不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)，因此，通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法獲得的內(nèi)生細(xì)菌具有較大的局限性，其試驗(yàn)結(jié)果不能全面地反映植物內(nèi)生細(xì)菌的群落組成。近年來，高通量測序技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，相比傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，該技術(shù)具有通量高、速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢，可以全面揭示供試微生物的種群結(jié)構(gòu)和多樣性。目前，利用高通量測序技術(shù)對甜菜、蠶豆種子、棕櫚科種子等組織的內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行了研究[21-23]，揭示了內(nèi)生細(xì)菌群落在不同物種、不同生長發(fā)育時(shí)期間都呈現(xiàn)出一定差異。

本試驗(yàn)以‘砂蜜豆’甜櫻桃根、主干樹皮及1年生枝條為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，分析大連地區(qū)‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化規(guī)律，旨在更加全面、準(zhǔn)確地反映內(nèi)生細(xì)菌在不同組織中的分布和差異，豐富和完善‘砂蜜豆’甜櫻桃內(nèi)生菌資源，為進(jìn)一步探討內(nèi)生菌的抗逆、促生等生態(tài)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘砂蜜豆’植株樣品采自遼寧省大連市農(nóng)業(yè) 科 學(xué)研 究 院 甜 櫻桃 試 驗(yàn)園（38°59′32″N，121°25′00″E），砧木為‘馬哈利’，樹齡7年。從每株上分別取根（SG）、枝條（SZ）和主干樹皮（SP）樣品，每3棵樹樣品均勻混樣后四分法作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

采集到的樣品放入無菌樣品袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。先用自來水流水沖洗10 min，無菌濾紙吸干水分，用75%無水乙醇處理4 min，經(jīng)無菌水洗滌后，用3%次氯酸鈉浸泡5 min，再用無菌水沖洗3~5遍，最后1遍無菌水洗滌液經(jīng)涂板檢測無菌后，無菌條件下進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌DNA的提取。

1.2 總DNA提取及16S rRNA基因序列擴(kuò)增

樣品總基因組DNA提取根據(jù)PowerSoil DNA分離試劑盒（MO BIO Laboratories）操作流程進(jìn)行。選用通用引物338F和806R擴(kuò)增16S rRNA V3~V4區(qū)，PCR擴(kuò)增和后續(xù)分析在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)（北京百邁客生物科技有限公司）上進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

測序結(jié)束后，經(jīng)過長度過濾、去除嵌合體得到優(yōu)化序列，然后進(jìn)行聚類，劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，相似性≥97% 的有效序列被聚為相同的OTU。根據(jù)OTU的序列組成與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)行物種注釋及分類學(xué)分析?；贠TU結(jié)果，對樣品在各分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析。通過Alpha多樣性研究單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性，通過Beta多樣性來比較不同樣品間在物種多樣性方面存在的差異 。 采 用 PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件進(jìn)行功能和代謝途徑預(yù)測，將現(xiàn)有的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對比，比較功能基因在生物代謝通路上的豐度差異，從而獲得‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落功能預(yù)測信息[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)

從供試樣品中共獲得有效序列9 665 813條，每條序列平均長度401.07 bp。供試樣品Alpha多樣性指數(shù)如表1所示。根部樣品內(nèi)生細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于主干樹皮和枝條，而主干樹皮和枝條樣品間無顯著差異。因此，大連地區(qū)‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌以根部多樣性及豐富度最高，其他組織部位的多樣性及豐富度減少。

2.2 甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌OTU 分布

在97%的序列相似度下，‘砂蜜豆’甜櫻桃3個(gè)組織部位的內(nèi)生細(xì)菌共劃分為1 386個(gè)OTUs（圖1）。3個(gè)組織部位獲得的OTU 數(shù)量分別為1 302（SG）、1 301（SP）和1 229（SZ），各部位樣品中獲得的OTU數(shù)量差異不顯著；其中，共有OTU分別占各部位內(nèi)生細(xì)菌OTU總量的86.3%、86.4%和91.5%，由此表明，3個(gè)組織樣品中共有的OTU占比較高，特有的OTU占比較少?！懊鄱埂饳烟也煌M織間特有的內(nèi)生細(xì)菌群落組成有著較大差異，部分細(xì)菌種群表現(xiàn)出組織專一性。其中，根部內(nèi)生細(xì)菌的特有OTU 數(shù)量最多，為36個(gè)；枝條和樹皮中分別為17和11個(gè)。除共有物種和特有物種外，不同組織間均有相同或相似物種。

圖1 甜櫻桃3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌OTU 水平韋恩圖Fig. 1 Venn of endophytic bacteria at OTU level in three tissues of sweet cherry

2.3 甜櫻桃不同組織部位細(xì)菌的組成和群落結(jié)構(gòu)

‘砂蜜豆’甜櫻桃3個(gè)組織部位的樣品共檢測到20個(gè)門、43個(gè)綱、79個(gè)目、162個(gè)科和346個(gè)屬，不同組織中的各級細(xì)菌分類階層總數(shù)也存在差異，其中，根中的內(nèi)生細(xì)菌種類最多；枝條次之；主干樹皮的內(nèi)生細(xì)菌種類最少（表2）。

表2 ‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌群落細(xì)菌學(xué)分類階層總數(shù)Table 2 Total numbers of bacterial taxa detected in different tissues of ‘Summit’

在門水平上，對于豐度高于0.1%的門進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2），其中變形菌門（Proteobacteria）是‘砂蜜豆’甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌的最優(yōu)勢菌門，在SG、SP和SZ中的相對豐度分別為49.76%、60.34%和55.06%；其次是厚壁菌門（Firmicutes）（平均豐度18.49%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（平均豐度12.18%）及放線菌門（Actinobacteria）（平均豐度10.71%）。這4個(gè)菌門的相對豐度達(dá)95%以上。而不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌的組成比例也存在一定差異，放線菌門在SG中的相對豐度為22.61%，明顯高于SZ和SP（3.71%和5.81%）；厚壁菌門在SG中的相對豐度為13.96%，明顯低于SZ和SP（24.02%和17.49%）。從門水平上的物種組成可以看出，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織間內(nèi)生細(xì)菌的群落組成具有一定差異。

圖2 3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌門水平上物種組成Fig. 2 Abundance of endophytic bacteria at phylum level in three tissues of sweet cherry

在綱水平，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）是3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌綱（圖3），但在不同組織部位中的相對豐度存在差異，其中，在SP中的相對豐度最高（43.14%）；在SZ中次之（39.04%）；在SG中最低（27.24%）。除α-變形菌綱外，放線菌綱在SG內(nèi)生細(xì)菌中的相對豐度也較高，為20.26%，而在SP和SZ中的相對豐度則較低，分別為4.14%和2.79%。

圖3 3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌綱水平上物種組成Fig. 3 Abundance of endophytic bacteria at class level in three tissues of sweet cherry

在屬水平上，供試樣品中未知種類菌屬的相對豐度最高（圖4）。在SG中，除未知菌屬外，鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度較高，為6.10%；其次為類固醇桿菌屬（Steroidobacter）（5.62%）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（4.67%）。在SZ中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度較高，為7.71%，但其在SP和SG中的相對豐度較低，分別為3.13%和2.76%。在SP中，擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度較高。

圖4 3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌屬水平上物種組成Fig. 4 Abundance of endophytic bacteria at genus level in three tissues of sweet cherry

2.4 甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌差異分析

為進(jìn)一步探究甜櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌的差異，對供試樣品進(jìn)行了LEfSe（line discriminant analysis effect size）分析，在SG中，具有顯著差異的菌門是變形菌門和放線菌門；在SZ中，具有顯著差異的菌門為厚壁菌門；在SP中，具有顯著差異的菌門為變形菌門（圖5）。由此表明，甜櫻桃不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌的菌群存在顯著差異，以根部內(nèi)生細(xì)菌最為豐富。

圖5 各樣品細(xì)菌差異LEfSe 分析圖Fig. 5 Bacterial taxa significantly differentiate responding to the different tissues using LEfSe

設(shè)定LDA（line discriminant analysis）值＞4條件下，SG內(nèi)生細(xì)菌有30個(gè)差異顯著單元；SZ的差異顯著單元為7個(gè)；SP的差異顯著單元最少，僅2個(gè)（表3）。SG內(nèi)生細(xì)菌差異顯著單元中有19個(gè)分布在變形菌門，其中黃單胞菌目（Xanthomonadales）9個(gè)，根瘤菌目（Rhizobiales）3個(gè)，鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）3個(gè)，紅螺菌目（Rhodospirillales）2個(gè)，粘球菌目（Myxococcales）1個(gè)；11個(gè)分布在放線菌門，其中鏈孢囊菌目 (Streptosporangiales) 3個(gè)，小單孢菌目(Micromonosporales) 3個(gè)，鏈霉菌目(Streptomycetales) 3個(gè)。SZ內(nèi)生細(xì)菌的7個(gè)差異顯著單元中6個(gè)分布在厚壁菌門，1個(gè)為擬桿菌門，其中厚壁菌門中4個(gè)屬于乳酸桿菌目（Lactobacillales），另2個(gè)屬于腸球菌科（Enterococcaceae）。SP內(nèi)生細(xì)菌的2個(gè)差異顯著單元均為變形菌門的根瘤菌目（Rhizobiales）。

表3 LEfSe統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of LEfSe statistical test

表3 LEfSe統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of LEfSe statistical test 續(xù)表 Continued

表3 LEfSe統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of LEfSe statistical test 續(xù)表 Continued

2.5 3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌群體聚類分析

采用非度量多維標(biāo)定法（non-metric multidimensional Scaling，NMDS）比較甜櫻桃3個(gè)不同組織部位樣本間群落結(jié)構(gòu)的相似性，如圖6所示。NMDS1把SG、SP和SZ分成不同的組。SP組樣品中的2個(gè)樣品點(diǎn)有些偏離，沒有聚到SP組，這說明取樣時(shí)具有一定的誤差，但是該圖的脅強(qiáng)系數(shù)為0.137 6（＜0.2），說明該分析具有一定的可靠性，可以解釋樣品中所含內(nèi)生細(xì)菌的真實(shí)情況。由此表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃根部組織內(nèi)生細(xì)菌與主干樹皮和枝條部位的內(nèi)生細(xì)菌存在明顯差異，而主干樹皮的內(nèi)生細(xì)菌群落與枝條的內(nèi)生細(xì)菌群落更為相近。

圖6 甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌的NMDS二維排序圖Fig. 6 Two-dimensional sorting map of endophytic bacteria in sweet cherry by NMDS analysis

2.6 不同組織甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌功能基因預(yù)測

采用PICRUSt 軟件預(yù)測內(nèi)生細(xì)菌的功能基因，所有基因序列注釋的功能可以分為6大類，主要涉及新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、人類疾病、細(xì)胞過程及有機(jī)系統(tǒng)。其中，新陳代謝相關(guān)基因的數(shù)量最多，占總數(shù)的73.45%~75.18%，主要包括碳水化合物、氨基酸、能量、輔酶因子和維生素、類脂物代謝等。環(huán)境信息處理相關(guān)基因的數(shù)量占總基因數(shù)的8.0%~9.83%，主要涉及膜運(yùn)輸和信號傳導(dǎo)。遺傳信息處理相關(guān)基因的數(shù)量占總基因數(shù)的8.35%~9.04%，主要為復(fù)制、修復(fù)機(jī)制及翻譯機(jī)制。

3 討論

本文利用高通量測序技術(shù)分析了‘砂蜜豆’甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌的群落特征及不同組織部位間的差異，結(jié)果表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織的內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，且不同組織部位中的群落結(jié)構(gòu)存在差異，其中根部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性以及豐富度最高，且特有OTU數(shù)量也較多；主干樹皮和枝條部位的多樣性及豐富度較低。內(nèi)生菌是由土壤、空氣中微生物入侵宿主，然后與宿主協(xié)同進(jìn)化而來，這些因素共同造成了內(nèi)生細(xì)菌分布的專一性。變形菌門（Proteobacteria）是3個(gè)組織部位內(nèi)生細(xì)菌的最優(yōu)勢菌門，在根部、主干樹皮、枝條中的相對豐度分別為49.76%、60.34%和55.06%。變形菌門在植物體內(nèi)廣泛分布，其物種和遺傳多樣性極為豐富，已應(yīng)用于植物病蟲害防治、土壤修復(fù)、生物固氮等方面[25-27]。厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門在3個(gè)組織中相對豐度也較高，其中放線菌門在根中相對豐度明顯高于在其他部位，而厚壁菌門在根部的相對豐度較低。芽孢桿菌是厚壁菌門中一類在自然界中分布廣泛的革蘭氏陽性化能異養(yǎng)菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、發(fā)酵飼料添加劑以及植物病蟲害生物防治方面應(yīng)用較多[28-29]。放線菌門細(xì)菌是一類非常重要的生防微生物，可以在生長過程中產(chǎn)生大量且種類繁多的抗生素[30]。

在屬水平上，未分類細(xì)菌的相對豐度最高，這說明甜櫻桃中含有豐富的未知種類細(xì)菌。除未知細(xì)菌外，在根部樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度最高；在枝條樣品中，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度最高；在主干樹皮樣品中，擬桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度較高。鏈霉菌、鞘氨醇單胞菌、乳酸桿菌及芽孢桿菌在‘砂蜜豆’甜櫻桃各組織中的相對豐度均較高，這可能是由于他們均具有抗逆、促生等性能，可促進(jìn)甜櫻桃的生長和防治病蟲害。菌群豐度變化為挖掘甜櫻桃具有特定應(yīng)用價(jià)值的微生物種資源指明了方向。研究表明，鏈霉菌屬在細(xì)菌界中不僅數(shù)量最多，而且也是產(chǎn)生生物活性物質(zhì)種類最多的一類細(xì)菌[31]，該屬的功能主要有分泌多種具促生長和拮抗病原菌的代謝物、增強(qiáng)植物抗逆性、改善土壤結(jié)構(gòu)等[32]。近年來，各國學(xué)者不斷研究挖掘新的天然生物活性物質(zhì)，鞘氨醇單胞菌是報(bào)道較多的一種重要微生物資源，它能夠合成生物聚合物、降解芳香族化合物，在環(huán)境生物領(lǐng)域顯現(xiàn)出巨大潛力[33-34]；芽孢桿菌具有產(chǎn)生生長素、解磷、解鉀、固氮及抗菌等功能[35]；乳酸桿菌則具有拮抗病原菌、降解污染物等功能[36-37]。此外，在不同組織中還含有大量未知種屬的微生物類群，這些未知微生物類群為挖掘在促生、抗逆、土壤修復(fù)、環(huán)境、醫(yī)藥等方面有重要應(yīng)用價(jià)值的新有益微生物資源提供了廣闊發(fā)展空間。

研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細(xì)菌群落變化動(dòng)態(tài)受多方面因素的影響，包括宿主植物種類[38-39]、宿主植物生長發(fā)育階段[16,40]、地理位置及宿主植物組織器官[41]等。本研究通過NMDS分析表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃組織器官類型影響內(nèi)生細(xì)菌的群落組成，主干樹皮和枝條部位內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)更為相近，而根部組織內(nèi)生細(xì)菌與其他2個(gè)部位的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)則具有明顯差異。這與郭建偉等[20]研究結(jié)果一致，表明甜櫻桃組織部位是影響其內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與多樣性變化的因素之一。

PICRUSt基因功能預(yù)測分析表明，甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌中與新陳代謝相關(guān)的功能基因相對豐度最高，在其生長過程中發(fā)揮著重要作用。由于甜櫻桃果實(shí)中含有豐富的糖類、有機(jī)酸、維生素和微量元素[42]，因此，其內(nèi)生細(xì)菌基因功能涉及氨基酸類、脂類、多糖、維生素、萜類、酮類及其他次生代謝產(chǎn)物合成等有關(guān)通路。這說明甜櫻桃內(nèi)生細(xì)菌可能參與甜櫻桃中各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，為植株生長發(fā)育提供必需的養(yǎng)分[43]。因此，通過獲得不同組織中內(nèi)生細(xì)菌與甜櫻桃中有效化學(xué)成分合成的相關(guān)信息，為協(xié)調(diào)甜櫻桃中營養(yǎng)成分的生物合成和運(yùn)輸分解、充分挖掘甜櫻桃的內(nèi)生細(xì)菌資源、提升其果實(shí)品質(zhì)提供參考依據(jù)。根部組織中調(diào)控各種代謝的內(nèi)生細(xì)菌物種的相對豐度較高，這與群落多樣性研究結(jié)果一致。

此外，本研究表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌的群落構(gòu)成有著較大差別，同時(shí)又有著一定的共性，各組織內(nèi)均存在大量的未知菌種，這給微生物資源挖掘和差異基因的功能分析提供了新的資源和線索，值得進(jìn)一步深入研究。后續(xù)研究將在本研究基礎(chǔ)上，通過改良菌株培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方法等手段，盡可能多的分離出這些內(nèi)生細(xì)菌菌株，對其進(jìn)行功能評價(jià)，發(fā)掘和篩選在促生效應(yīng)、病蟲害生物防治以及環(huán)境治理等方面具有較大應(yīng)用潛力的微生物菌株。