海島棉類(lèi)受體胞質(zhì)激酶基因GbRLCK10在抗病中的作用

趙曾強(qiáng)， 張國(guó)麗， 馬盼盼， 李有忠， 王志軍， 謝宗銘*， 孫國(guó)清，2*

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

類(lèi)受體胞質(zhì)激酶（receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）是只含胞內(nèi)激酶域的蛋白激酶，在擬南芥中有147個(gè)成員[1]，水稻中有379個(gè)成員[2]。研究表明，一些RLCK作為模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）復(fù)合體的核心組分[3-4]，可以激活PRR，并與各種早期信號(hào)事件關(guān)聯(lián)[5-6]，參與植物免疫響應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)及防御過(guò)程[7]。

在擬南芥中，AtRLCK-VII亞家族有47個(gè)成員，利用基因敲除技術(shù)敲除在模式觸發(fā)免疫中扮演關(guān)鍵角色的基因并構(gòu)建突變體，分別命名為RLCK VII-1～RLCK VII-9，結(jié)果表明，突變體RLCK VII-5、RLCK VII-7和RLCK VII-8在不同的PRR模式測(cè)定中均能影響活性氧 （reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，表明其成員廣泛地參與多個(gè)PRR信號(hào)傳遞，而RLCK VII-4在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生過(guò)程中存在特異性缺陷，表明RCLK VII-4特異性介導(dǎo)PRR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且RLCK VII-4參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated protein kinase，MAPK）的激活[8]。以上結(jié)果表明，RLCK-VII家族成員參與PRR與MAPK激活的免疫響應(yīng)，在植物抗病過(guò)程中起重要作用[9-10]。 RLCK-VII成 員 BIK1（botrytis-induced kinase 1，BIK1）是研究最深入的成員，在靜息狀態(tài)下，BIK1與FLS2（flagellin sensing 2）蛋白結(jié)合，也可能與BAK1結(jié)合，在flg22被激發(fā)后，BAK1（brassinosteroid insensitive 1-associated kinase 1）與FLS2結(jié)合并磷酸化BIK1；反過(guò)來(lái)，BIK1從PRR復(fù)合體解離之前磷酸化BAK1和FLS2，從而激活下游信號(hào)分子，BIK1和PBS1激酶(PBL)蛋白參與了由elf18、AtPep1和幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)，這是早期不同PRR介導(dǎo)通路的聚合點(diǎn)[11-14]。水稻中，BSR1（RLCK VII）基因參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，過(guò)表達(dá)BSR1基因增強(qiáng)了過(guò)氧化氫(H2O2)的產(chǎn)生，活性氧的積累增強(qiáng)了寄主植物對(duì)親和病原菌的抗性，參與肽聚糖和脂多糖引起的免疫反應(yīng)，提高了植物對(duì)真菌和細(xì)菌病原菌的抵抗力[15]。木薯中，MeRLCK-VII 家族MeBIK基因通常情況下表達(dá)量較低，受鞭毛蛋白flg22刺激后表達(dá)量顯著提高，構(gòu)建MeBIK1基因雙元熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，利用擬南芥atbik1突變體開(kāi)展遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)表明，MeBIKl基因能恢復(fù)擬南芥AtBIK1基因突變減弱的PTI反應(yīng)，且轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃單胞桿菌（XamHN04）抗性提高，對(duì)PstDC3000敏感性增強(qiáng)[16]。小麥中，TaRLCK-VII家族成員TaRLCK1B基因與水稻抗病相關(guān)基因OsRLCK176（RLCKs-VII）的同源性為84.03%，該基因在小麥抗病品種中的表達(dá)量顯著高于感病品種；利用VIGS （virus induced gene silencing）技術(shù)沉默TaRLCK1B后接種麥瘟病菌（R. cerealis），沉默植株對(duì)麥瘟病菌的抗性降低，但其H2O2含量顯著提高，由此可見(jiàn)，TaRLCK1B基因通過(guò)調(diào)控小麥體內(nèi)ROS信號(hào)應(yīng)對(duì)R. cerealis早期免疫應(yīng)答[17]。

綜上所述，RLCK-VII家族基因參與植物免疫響應(yīng)，在調(diào)控植物逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用，但該類(lèi)基因在棉花中的報(bào)道甚少。因此，本研究利用前期從海島棉中獲得的響應(yīng)黃萎病菌和激素（水楊酸salicylic acid，SA；乙烯ethylene，ET；茉莉酸methyl jasmonic acid，MeJA）脅迫的RLCK基因GbRLCK10[18]，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因?qū)霟煵?，研究其在煙草中的功能，為深入研究GbRLCK10基因在海島棉中的時(shí)空表達(dá)及作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)煙草材料為野生型煙草SR1（Nicotiana tabacumpv SR1），根癌農(nóng)桿菌為GV3101，植物基礎(chǔ)表達(dá)載體為pCAMBIA2300-35s-OCS，黃萎病菌菌株為v592，以上材料均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 根據(jù)GbRLCK10基因的開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)引物；通過(guò)酶切、連接構(gòu)建植物表達(dá)載體重組質(zhì)粒（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）；采用電擊法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用菌液PCR法篩選鑒定陽(yáng)性菌株。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程中所需要的培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[19]。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草檢測(cè) T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株篩選：依據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)上游引物35SF1，依據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)下游引物GeneR1，以轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)600 bp左右，PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

T1/2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株篩選：將煙草種子表面消毒后平鋪于含有50 mg·L-1卡那霉素的固體1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，植株正常生長(zhǎng)、葉片為綠色的為轉(zhuǎn)基因植株；植株發(fā)芽后停止生長(zhǎng)、葉片變白的為非轉(zhuǎn)基因植株。選取轉(zhuǎn)基因植株的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)約1 200 bp，引物為目的基因引物（GbRLCK-F和GbRLCK-R），PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 煙草DNA和RNA提取 試驗(yàn)所需DNA和RNA均使用試劑盒提取，分別為 DNAsecure Plant Kit 新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）和EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 煙草抗病性鑒定 將黃萎病菌菌株V592接種至PDA培養(yǎng)基活化，將已活化菌株接種至查氏液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d后，配制為1×107·mL-1孢子懸浮液待用；于煙草幼苗長(zhǎng)至5~6片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的煙草采用灌根法接種黃萎病菌，接種后每天觀察煙草病害的發(fā)生情況[20]，待發(fā)病高峰期統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。按以下標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病級(jí)。0級(jí)：植株無(wú)發(fā)病葉片；1級(jí)：植株有發(fā)病葉片，且發(fā)病葉片少于25%；2級(jí)：植株25%~50%葉片發(fā)??；3級(jí)：植株50%～75%葉片發(fā)?。?級(jí)：植株75%以上葉片發(fā)病。病情指數(shù)計(jì)算公式如下。

1.2.6 抗病相關(guān)基因表達(dá)特性分析 將已活化菌株V592接種至查氏液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d后，配制濃度為1×107·mL-1孢子懸浮液待用；于煙草幼苗長(zhǎng)至5～6片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的煙草采用灌根法接種黃萎病菌，分別在侵染0、24、72、120和168 h采集野生型和轉(zhuǎn)基因植株從上至下的第3片真葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

利用qRT-PCR技術(shù)，以NtActin為內(nèi)參基因，分析NtPR1、NtNPR1、NtEIN4、NtJAZ1、NtNTHK、NtAOS在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株感病前和感病后的表達(dá)模式?；虮磉_(dá)量檢測(cè)所需的試劑盒購(gòu)于中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司。qRT-PCR反應(yīng)體系及程序嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Sequence of pimers

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

2.1.1 重 組 質(zhì) 粒 （pCAMBIA2300-35s-OCS：GbRLCK10）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）導(dǎo)入農(nóng)桿菌，利用菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌株，目的基因?yàn)? 179 bp（圖1）。

圖1 GbRLCK10基因PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification results of GbRLCK10 gene

2.1.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株篩選 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草(圖2A～D)，并獲得T0轉(zhuǎn)基因植株（圖2E和F），分別提取野生型和T0轉(zhuǎn)基因植株DNA，以野生型煙草為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中有11株擴(kuò)增出預(yù)期大小（約600 bp）的目的條帶，初步證明GbRLCK10基因已整合到煙草基因組中（圖2G）。對(duì)T1/2轉(zhuǎn)基因植株提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，利用RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)，11株轉(zhuǎn)基因的煙草均擴(kuò)增出預(yù)期大小（約1 200 bp）的目的條帶（圖2H和I）。由此說(shuō)明，GbRLCK10基因已整合到煙草基因組中，且能夠正常轉(zhuǎn)錄。選取OE2、OE3和OE5共3株轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 GbRLCK10基因轉(zhuǎn)化煙草化及陽(yáng)性植株篩選Fig. 2 Transformation of GbRLCK10 gene into Nicotiana tabacum and screening of positive plants

2.2 抗病性鑒定

采用灌根法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草接種棉花黃萎病菌菌株V592，結(jié)果（圖3）顯示，接種病原菌約7～10 d，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的葉子出現(xiàn)不同程度褶皺，葉脈附近慢慢變黃；轉(zhuǎn)基因煙草在接種20～22 d開(kāi)始發(fā)病，33 d時(shí)達(dá)到發(fā)病高峰期；野生型煙草在接種28～31 d開(kāi)始發(fā)病，42 d時(shí)達(dá)到發(fā)病高峰期。由此表明，與野生型相比轉(zhuǎn)基因煙草更易感病。

圖3 煙草抗病性鑒定Fig. 3 Tobacco disease resistance identification

2.3 抗病相關(guān)基因表達(dá)量分析

接種病原菌前，抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)如圖4所示。野生型煙草中NtNPR1、NtPR1、NtJAZ1基因的表達(dá)量均顯著或極顯著低于轉(zhuǎn)基因植株，而NtEIN4、NtNTHK2、NtJAZ1基因的表達(dá)量均顯著或極顯著高于轉(zhuǎn)基因植株。

圖4 黃萎病菌處理前抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)Fig. 4 Expression of disease resistance-related genes in WT and transgenic plant before treatment with Verticillium dahliae

接種黃萎病菌后，抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)如圖5所示。NtNPR1基因在野生型中的表達(dá)量隨著接種時(shí)間的推進(jìn)先升高再降低，在接種后72 h表達(dá)量最高，為接種前的2.1倍；而轉(zhuǎn)基因植株中NtNPR1基因的表達(dá)量均高于野生型。NtPR1基因在野生型煙草中表達(dá)量在處理時(shí)間段內(nèi)持續(xù)升高，在接種后168 h表達(dá)量最高，約為對(duì)照的380倍；轉(zhuǎn)基因植株在處理時(shí)間點(diǎn)內(nèi)該基因的表達(dá)量均低于野生型。NtEIN4基因在野生型植株中的表達(dá)量隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量均低于對(duì)照；而轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達(dá)量均高于野生型，且隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。NtNTHK2和NtJAZ1基因無(wú)論是在野生型還是在轉(zhuǎn)基因植株中，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)量均低于對(duì)照；但轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均高于野生型。NtAOS基因無(wú)論是在野生型還是在轉(zhuǎn)基因植株中，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因整體表達(dá)量均高于對(duì)照；且野生型中的表達(dá)量高于轉(zhuǎn)基因植株。

圖5 黃萎病菌處理后抗病相關(guān)基因在野生型株系與轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)Fig. 5 Expression of disease resistance related genes in wild type and transgenic strains after treatment with Verticillium dahliae

3 討論

RLCK家族基因位于植物細(xì)胞表面，被稱(chēng)為模式識(shí)別受體（PRRs），通過(guò)感知PAMPs（pathogen-associated molecular patterns）激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21-22]。研究表明，該類(lèi)基因在PTI中起著重要作用，廣泛地參與植物免疫響應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)及防御過(guò)程，在擬南芥中，RLCK VII亞家族成員BIK1 和PBS1是多個(gè)PRR復(fù)合物的直接底物[22]；在水稻中，賴(lài)氨酸基序（LysM）受體樣激酶CERK1是植物對(duì)微生物相關(guān)分子模式（MAMPs）免疫應(yīng)答所必需的輔助受體，屬于水稻RLCK家族VII亞家族，與CERK1相互作用，并正向調(diào)節(jié)對(duì)肽聚糖和幾丁質(zhì)反應(yīng)[23]。由此可見(jiàn)，RLCK家族基因以正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的作用方式參與復(fù)雜的抗病信號(hào)途徑[24]。

本研究前期從海島棉中獲得響應(yīng)黃萎病菌和激素（水楊酸、茉莉酸、乙烯）脅迫的基因GbRLCK10，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)其在煙草中的功能進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，在煙草中過(guò)表達(dá)GbRLCK10基因，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃萎病菌的抗性較野生型有所降低。研究表明，類(lèi)受體胞質(zhì)激酶基因CPK28在擬南芥中過(guò)表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株中BIK1蛋白積累較少，致使免疫受損，對(duì)病原菌的抵抗力下降，而該基因的突變體中BIK1蛋白積累較多，對(duì)病原菌的抗性增強(qiáng)[25]，與本研究結(jié)果一致，但GbRLCK10基因是否如CPK28基因通過(guò)影響某些蛋白的積累從而影響植物對(duì)病原菌的抗性有待進(jìn)一步研究。

研究表明，水楊酸、茉莉酸和乙烯是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號(hào)分子[18]。水稻中，RLCK VII家族成員的OsPBL1基因能被水稻條紋葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)，將其轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)丁香假單胞菌的抵抗性較野生型增強(qiáng)，葉片中過(guò)氧化氫與胼胝體的積累量均高于野生型，水楊酸途徑中關(guān)鍵基因PR1、PR2和PR5的表達(dá)量均高于野生型[26]。編碼類(lèi)受體胞質(zhì)激酶蛋白基因NRRB能被水楊酸、氨基環(huán)丙烷羧酸（l-aminocyclopropane-lcarboxylic acid，ACC）抑制表達(dá)，而MeJA對(duì)NRRB具有雙向調(diào)控，既可以誘導(dǎo)NRRB表達(dá)，也可以抑制NRRB表達(dá)，表明類(lèi)受體胞質(zhì)激酶家族基因參與了水楊酸與茉莉酸信號(hào)通路[27]。以上研究表明，類(lèi)受體胞質(zhì)激酶家族基因參與調(diào)控激素信號(hào)通路基因影響植物抵御外界逆境脅迫。

NPR1基因?qū)λ畻钏嵝盘?hào)途徑中R基因的激活具有重要調(diào)控作用。本研究表明，健康狀態(tài)下，NtNPR1、NtPR1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量高于野生型；接種黃萎病菌后，野生型煙草中NtNPR1基因上調(diào)表達(dá)，NtPR1基因表達(dá)量隨接種時(shí)間持續(xù)升高，轉(zhuǎn)基因植株中，NtNPR1基因表達(dá)量高于野生型，但NtPR1基因表達(dá)量低于野生型。Yan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸通路為SA→NPR1→TGA→PR-1→抗病。將GbRLCK10基因?qū)霟煵莺?，無(wú)論是病原菌接種前還是接種后轉(zhuǎn)基因植株中NtNPR1基因的表達(dá)量均高于野生型，但NtPR1基因表達(dá)量低于野生型，推測(cè)GbRLCK10基因可能通過(guò)調(diào)控TGA轉(zhuǎn)錄因子影響NtPR1基因表達(dá)，從而影響煙草對(duì)黃萎病的抗性。

研究表明，乙烯可以調(diào)控植物對(duì)腐生型病原菌的抗性[29-30]。棉花與黃萎病菌相互作用的機(jī)理非常復(fù)雜，Shaban等[31]認(rèn)為乙烯和茉莉酸信號(hào)通路協(xié)同作用對(duì)抗腐生病原體，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候乙烯下游信號(hào)分子通過(guò)與JA信號(hào)相互作用，參與黃萎病的抗性。本研究結(jié)果顯示，接種黃萎病菌前，轉(zhuǎn)基因植株中NtEIN4和NtNTHK2基因的表達(dá)量均低于野生型；接種黃萎病菌后，NtEIN4基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)模式相反，野生型中，該基因表現(xiàn)為隨著接種時(shí)間下調(diào)表達(dá)，但在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，NtNTHK2基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中均為下調(diào)表達(dá)，但該基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量高于野生型。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的乙烯受體主要包括ETR1、ERS1、ETR2、ERS2、EIN4，這些受體間具有一定功能冗余性，是乙烯信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子[32]。而煙草中乙烯受體基因的研究較少，除上述蛋白受體外，NtNTHK1、NtNTHK2為煙草中的乙烯受體蛋白[33]，研究表明， NtNTHK2蛋白是煙草中乙烯受體第二亞族的成員，NtNTHK2基因與擬南芥乙烯受體基因EIN4、ETR2和ETR1的同源性分別為56.3%、46.4%和32.8%[34]，由此推測(cè)，煙草中NTHK2蛋白功能與擬南芥EIN4功能相似，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)GbRLCK10基因?qū)霟煵莺笸ㄟ^(guò)調(diào)控乙烯受體基因NtEIN4和NtNTHK2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)煙草對(duì)黃萎病的抗性。

茉莉酸在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[35]。擬南芥中茉莉酸信號(hào)通路的核心元件有COIl、JAZ蛋白和轉(zhuǎn)錄因子MYC2，其中JAZ蛋白作為茉莉酸信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控因子在介導(dǎo)植物抗病反應(yīng)中起重要作用[36-38]。當(dāng)JAZ基因缺失或表達(dá)量下降后，擬南芥對(duì)P.syringae的抗性明顯減弱[38]。丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase, AOS）普遍存在于植物組織中，是茉莉酸合成通路的關(guān)鍵酶[39]。當(dāng)植物受到生物脅迫時(shí)該基因表達(dá)，通過(guò)控制茉莉酸的生物合成而參與調(diào)節(jié)植物生理過(guò)程，本研究表明，接種黃萎病菌前，轉(zhuǎn)基因植株中NtAOS基因的表達(dá)量低于野生型，NtJAZ1基因表達(dá)量高于野生型；接種黃萎病菌后，NtAOS基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中均能被誘導(dǎo)表達(dá)，但在野生型中表達(dá)量更高。Yan等[28]通過(guò)分析黃萎病菌侵染海島棉的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，AOS基因在抗性品種中表達(dá)量更高，與本研究結(jié)果一致。在接種黃萎病菌前，NtJAZ1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量高于野生型；而接種黃萎病菌后，該基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量也高于野生型，由此推斷，茉莉酸途徑參與了煙草對(duì)黃萎病菌的響應(yīng)，而GbRLCK10基因通過(guò)調(diào)節(jié)茉莉酸途徑NtJAZ1和NtAOS基因表達(dá)來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃萎病菌的抵抗力。