低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥氮素轉(zhuǎn)移特征

陳軍， 李靜雯*， 王立光， 朱天地， 陳琛， 包奇軍， 歐巧明

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院啤酒大麥研究所，蘭州 730070）

大麥（barley）種植歷史悠久，具有耐旱、耐瘠薄、抗逆性強、適應(yīng)性廣等特性[1]。大麥是啤酒生產(chǎn)的主要原料，需求量大，每年我國需從國外進口啤酒大麥200萬t左右，占世界啤酒大麥用量的60%~70%[2]。籽粒蛋白含量是決定啤酒大麥商業(yè)品質(zhì)的重要因素，一般的啤酒大麥品種蛋白含量均高于釀酒標準，如何降低大麥籽粒蛋白含量成為研究者關(guān)注的一個重要科學問題[3]。

目前，關(guān)于大麥籽粒蛋白含量的研究多集中于栽培措施的優(yōu)化、氮高效利用新品種的培育、調(diào)控籽粒蛋白含量的基因克隆等方面。Mascher等[4]認為培育氮高效利用型大麥品種可降低大麥生產(chǎn)成本并提高大麥籽粒品質(zhì)。研究表明，適量施氮可有效提高大麥籽粒的蛋白質(zhì)含量[5-9]。隨著研究的深入，不同作物中與氮素利用有關(guān)的基因陸續(xù)被克隆，小麥TaNRT2.1、水稻OsNRT1.1a、西紅柿LeNRT2.3和大麥HvNRT2/3基因均與氮素轉(zhuǎn)運相關(guān)[10]。但是，施氮栽培一般會導致大麥籽粒蛋白含量偏高。目前，氮高效利用品種較少，克隆的基因也無法應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。醇溶蛋白作為大麥胚乳中主要的儲藏蛋白，但不承擔重要的生理功能，因此可以忍受較多的突變。研究表明，醇溶蛋白與麥芽品質(zhì)及啤酒渾濁度、泡沫形成、高級醇及酯的形成等息息相關(guān)。Jonassen等[3]發(fā)現(xiàn)不同生長條件下的氮素營養(yǎng)會影響成熟籽粒中不同醇溶蛋白組分的比例。因此，通過基因工程手段降低大麥籽粒中醇溶蛋白含量成為解決該問題的突破點。

項目組前期采用RNAi成功抑制B-hordein合成，獲得醇溶蛋白含量較對照顯著降低的轉(zhuǎn)基因大麥穩(wěn)定株系[11]，而該材料的生長特性、產(chǎn)量、品質(zhì)、氮素利用特性等一系列科學問題亟待解決。因此，本研究利用此穩(wěn)定遺傳的低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥為試驗材料，以其受體為對照，探究氮肥施用量對其花后各營養(yǎng)器官氮素積累、分布及轉(zhuǎn)運的影響，明確該低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥花后至籽粒形成過程中氮素的變化規(guī)律，為大麥氮素轉(zhuǎn)運的生理機制及生產(chǎn)施肥實踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大麥為甘肅農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所創(chuàng)制的以‘Golden Promise’（GP）[11]為受體獲得的帶有hpt基因的RNAi B-hordein轉(zhuǎn)基因大麥純系穩(wěn)定株系（T），其醇溶蛋白含量較對照顯著降低，總蛋白含量降低1%~2%；以其受體‘Golden Promise’作為對照（CK）。2019—2020年將2種材料在甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ脺厥疫M行土培盆栽試驗。供試土壤采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學院試驗地，其基本理化性質(zhì)為有機質(zhì)16.65 g·kg-1，全 氮 1.1 g·kg-1，堿 解 氮 88.95 mg·kg-1，有 效 磷19.6 mg·kg-1，速效鉀 206 mg·kg-1，pH 8.57。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分別設(shè)置 0（本底氮，N0）、160（低氮，N160）、230（正常施氮，N230）和300 mg N·kg-1土（高氮，N300）4個供氮水平，每處理3次重復，采用完全隨機排列。采用陶制花盆（有托盤）進行土培盆栽試驗，每桶裝土10 kg。供試肥料為尿素（N 46%）、磷酸二氫鉀（P2O552%、K2O 34%）和硫酸鉀（K2O 54%）。其中，氮肥分2次施入，70%作為基肥施用，30%在拔節(jié)期作為追肥施用；磷、鉀肥均作基肥施用；其他管理按常規(guī)要求實施。

1.3 試驗方法

分別于揚花期（flowering period，F(xiàn)P）、灌漿期（filling stage，F(xiàn)S）和成熟期（maturity period，MP）3個關(guān)鍵時期采集植株地上部樣品，用蒸餾水潤洗，吸水紙擦干，再按莖稈、葉、穗分開，分別裝入信封袋內(nèi)置于烘箱105 ℃殺青30 min，于80 ℃烘至恒重，粉碎備用。

測定各營養(yǎng)器官的干物質(zhì)量；采用KDY9820型定氮儀測定全氮含量；采用近紅外谷物分析儀（Foss Tecator，Infratec 1241，Grain Analyser v.3.40）測定籽粒蛋白含量；收獲時測定株高、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量，每重復測定10株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 20.0進行相關(guān)分析（Pearson分析法）和差異顯著性檢驗（Duncan法）。按照以下公式計算氮素積累量（nitrogen accumulation，NA）、氮素轉(zhuǎn)運量（nitrogen transport，NT）、氮 素 轉(zhuǎn) 運 率（nitrogen transfer rate，NTR）、氮 肥 生 產(chǎn) 效 率（nitrogen production efficiency，NGPE）、氮素轉(zhuǎn)運量對穗的貢獻 率（contribution rate of nitrogen transfer to ear，CRNTE）、氮 肥 農(nóng) 學 效 率（nitrogen agronomic efficiency，NAE）、氮肥偏生產(chǎn)力（nitrogen partial productivity，NPP）、氮 肥 吸 收 利 用 率（nitrogen absorption and utilization rate，NAUR）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對轉(zhuǎn)基因大麥產(chǎn)量構(gòu)成及籽粒蛋白的影響

由表1可知，相同施氮量水平下，轉(zhuǎn)基因大麥的單株籽粒產(chǎn)量高于對照；株高和千粒重較對照顯著降低，有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)較對照顯著增加。由此表明，轉(zhuǎn)基因大麥通過增加分蘗和有效穗數(shù)補償產(chǎn)量配給，實現(xiàn)增產(chǎn)，說明其具有較強的籽粒產(chǎn)量形成能力，與前期研究結(jié)果一致[11]。

表1 不同處理下大麥的產(chǎn)量構(gòu)成及籽粒產(chǎn)量Table 1 Yield composition and grain yield of barley in different treatments

由圖1可知，同一施氮量水平，轉(zhuǎn)基因大麥的地上部生物量顯著高于對照，且在揚花期至灌漿期增幅較大，灌漿期至收獲期增幅減緩，說明揚花期至灌漿期是大麥干物質(zhì)積累的重要時期。各生育期轉(zhuǎn)基因大麥的地上部生物量均顯著高于對照，說明該轉(zhuǎn)基因材料的氮素吸收利用效率高于對照。

圖1 不同生育期地上部生物量Fig. 1 Aboveground biomass in different growth periods

大麥籽粒蛋白含量隨施氮量增加而增加[12-13]。由圖2可知，相同施氮量水平下，轉(zhuǎn)基因大麥的籽粒蛋白含量顯著低于對照，較對照降低0.58%~2.40%；隨著施氮量增加，轉(zhuǎn)基因大麥和對照的籽粒蛋白含量均有所增加，說明增施氮肥有利于提高大麥籽粒蛋白含量。

圖2 籽粒蛋白含量Fig. 2 Grain protein content

2.2 施氮量對轉(zhuǎn)基因大麥營養(yǎng)器官的氮素吸收、積累與轉(zhuǎn)運的影響

2.2.1 不同生育時期轉(zhuǎn)基因大麥植株的氮素含量 同一生育時期，大麥葉、莖稈的氮素含量隨施氮量增加而提高，且施氮量影響氮素的轉(zhuǎn)運效率[14]；而隨生育進程推進，莖稈、葉中氮素含量逐漸降低，穗部氮素含量逐步升高[15]。由圖3可知，隨著施氮量的增加，對照穗中的氮素含量逐漸增加，而轉(zhuǎn)基因材料穗中的氮素含量先增加后降低，在N160處理最高；對照葉中的氮素含量先增加后降低，在N230處理最高，而轉(zhuǎn)基因材料在N300處理最高；對照莖稈中的氮素含量也先增加后降低，在N160處理最高，而轉(zhuǎn)基因材料在N300處理最高。轉(zhuǎn)基因大麥各營養(yǎng)器官的氮素含量分布表現(xiàn)為：穗＞葉片＞莖稈，且在揚花期穗中的氮素含量最高，說明充足的花前氮素積累主要集中在穗部，為后期灌漿結(jié)實奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 穗、葉和莖稈中氮素含量Fig. 3 Nitrogen contents of ear， leaf and stem

2.2.2 不同生育時期轉(zhuǎn)基因大麥植株的氮素積累量及占比 氮素在植株體內(nèi)的分配決定了氮素的再利用效率。由表2可知，同一施氮量水平下，隨著生育進程的推進，轉(zhuǎn)基因材料穗的氮素積累量逐步增加；葉的氮素積累量逐漸降低；莖稈的氮素積累量先增加后降低。同一生育時期隨著施氮量的增加，轉(zhuǎn)基因材料穗的氮素積累量先增加后降低，在N230處理最高；葉的氮素積累量逐漸降低；莖稈的氮素積累量先降低后升高。各營養(yǎng)器官的氮素積累量表現(xiàn)為：穗＞葉＞莖稈，說明穗是氮素再分配的重要組織器官；而不同生育時期表現(xiàn)為：揚花期＞灌漿期＞成熟期，說明揚花期是影響大麥氮素再利用的關(guān)鍵時期。

比較氮素積累比例結(jié)果（表2）表明，對于穗部，揚花期為23.59%~44.00%，灌漿期為31.04%~69.99%，成熟期為36.50%~68.01%；對于葉片，揚花期為35.00%~49.98%，灌漿期為8.21%~32.55%，成熟期為18.49%~32.67%；對于莖稈，揚花期為20.94%~29.72%，灌漿期為21.00%~44.40%，成熟期為12.10%~34.08%。由此表明，隨著生育進程的推進和施氮量增加，各營養(yǎng)器官的氮素積累占比發(fā)生變化，說明施氮量會影響氮素在大麥各營養(yǎng)器官的轉(zhuǎn)移和再分配，進而調(diào)控大麥籽粒的形成及進程。

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2.2.3 轉(zhuǎn)基因大麥的氮素轉(zhuǎn)運及利用 養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運量和轉(zhuǎn)運效率是表征營養(yǎng)體養(yǎng)分向籽粒轉(zhuǎn)移量的重要指標。植物利用氮主要涉及氮的吸收、同化、轉(zhuǎn)運、循環(huán)和再活化。不同植物對氮素的利用效率不同，同一作物不同品種對氮素的利用效率也存在差異。由表3可知，轉(zhuǎn)基因材料營養(yǎng)器官的氮素轉(zhuǎn)運量、氮素轉(zhuǎn)運率及氮素轉(zhuǎn)運量對穗的貢獻率和氮轉(zhuǎn)移量在中氮水平下較高，在高氮水平下有所降低；而對照在高氮水平下較高。轉(zhuǎn)基因大麥氮肥農(nóng)學利用率、氮肥偏生產(chǎn)力均隨著施氮量的增加逐漸降低，即在低氮水平下較高。

表3 不同大麥營養(yǎng)器官的氮素轉(zhuǎn)運量、轉(zhuǎn)運率、干物質(zhì)轉(zhuǎn)運量、轉(zhuǎn)運率及氮肥農(nóng)學利用率和氮肥偏生產(chǎn)力Table 3 Nitrogen transfer rate， transfer rate， dry matter transfer rate， transfer rate， agronomic utilization rate of nitrogen fertilizer， partial productivity of nitrogen fertilizer in different barley vegetative organs

2.3 不同生育時期，轉(zhuǎn)基因大麥籽粒產(chǎn)量與各營養(yǎng)器官氮素含量的相關(guān)性

花后氮素的同化和轉(zhuǎn)運是氮素再利用效率高低的重要影響因子。由表4可知，植株穗、葉中的氮素含量與籽粒產(chǎn)量形成和氮利用效率關(guān)系密切，主要表現(xiàn)為籽粒產(chǎn)量與揚花期穗的氮素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.988；與灌漿期和成熟期穗氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.890；與揚花期、灌漿期葉氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.900和0.866；與揚花期、灌漿期莖稈氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.923和0.908。隨著生育進程的推進，單株產(chǎn)量與各營養(yǎng)器官氮素含量的相關(guān)性逐漸降低，說明揚花期是籽粒產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期，且籽粒氮素來源更多依賴于前期地上部營養(yǎng)體中的氮素轉(zhuǎn)移。

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3 討論

氮素是植物生長必需的大量營養(yǎng)元素，參與植物蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、葉綠素等的生物合成。氮肥運籌是作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培的重要內(nèi)容，研究各生育期根、莖、葉、穗中氮素積累、轉(zhuǎn)移和再分配對作物高產(chǎn)具有重要意義[16]。沈會權(quán)等[17]研究表明，施用氮肥可顯著提高不同時期葉和莖稈中的氮素含量及籽粒中的蛋白質(zhì)含量。蔡劍[18]研究表明啤酒大麥的花前植株氮素積累量和轉(zhuǎn)運量均隨著施氮量的增加呈上升趨勢。如何降低氮肥投入、減輕作物對氮素依賴、提高作物的氮素利用效率、剖析作物的低氮耐受性機理成為植物營養(yǎng)研究的熱點。

植株生長發(fā)育過程中氮素的運轉(zhuǎn)和利用主要經(jīng)歷3個階段：①種子萌發(fā)階段，儲藏的氮素活化為萌發(fā)提供能量；②揚花期至灌漿期營養(yǎng)生長階段，包括氮素的同化、分配及轉(zhuǎn)運；③成熟期，植株逐漸衰老，根、莖稈和葉中的氮素回歸自然[19]。花后是禾谷類作物籽粒形成的關(guān)鍵階段，大部分營養(yǎng)器官的氮素和碳水化合物向籽粒轉(zhuǎn)移[20]。本研究中低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥揚花期穗的氮素積累量較高，成為籽粒氮素的主要來源，且主要通過增加植株分蘗數(shù)、保證有效穗數(shù)來確保籽粒產(chǎn)量?；ê蟮氐耐娃D(zhuǎn)運是氮素再利用效率高低的重要影響因子。小麥開花期葉片、莖桿、穗及成熟期籽粒氮素積累量與籽粒產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)[21]。本研究也表明轉(zhuǎn)基因大麥穗、葉中較高的氮素積累和分配與籽粒產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。

養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運量和轉(zhuǎn)運效率是表征營養(yǎng)體養(yǎng)分向籽粒轉(zhuǎn)移量的重要指標。氮素在植株體內(nèi)的分配情況決定了氮素的再利用能力[22]。不同植物對氮素的利用效率不同，同一作物不同品種對氮素的利用效率也存在差異。左青松等[23]研究表明，在作物生長后期土壤中的氮素被吸收耗盡，植株營養(yǎng)器官中的氮素最大化轉(zhuǎn)移給穗部以完成籽粒后熟，而葉和莖稈衰老凋零，進而實現(xiàn)氮素的高效利用。董桂春等[24]認為作物根系吸收的氮素由莖稈逐漸流動到葉和籽粒，各器官間氮素的同化和流動影響籽粒氮素的積累，從而影響作物生育后期的氮素再利用效率，并最終影響籽粒產(chǎn)量。徐壽軍等[16]研究表明，隨著施氮量的增加大麥花后氮素積累率及其對籽粒的貢獻率均呈上升趨勢，而各器官氮素轉(zhuǎn)運率及對籽粒的貢獻率呈下降趨勢，且高氮與低氮處理間差異顯著。本研究表明，低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥地上部的氮素積累量在不同生育期表現(xiàn)為：揚花期＞灌漿期＞成熟期，且揚花期氮素積累量較高，說明充足的花前氮素積累為花后灌漿結(jié)實奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；從地上部植株氮素總積累量來看，轉(zhuǎn)基因材料在各氮素水平下的氮素總積累量均高于對照，說明轉(zhuǎn)基因材料的氮素吸收利用能力較強。

高潤紅等[25]研究表明，氮利用率的提高主要是由于氮素吸收效率提高引起的。德木其格[26]認為，在施氮量為180 kg·hm-2時大麥的氮素利用率達到峰值，其葉片和莖稈的氮素轉(zhuǎn)運率及其對籽粒貢獻率、氮肥生產(chǎn)效率、氮肥生理效率均隨著施氮量的增加呈先降低后升高趨勢，氮肥農(nóng)學效率和氮肥偏生產(chǎn)力呈降低趨勢。蘇丙華等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒產(chǎn)量隨著施氮量的增加逐漸增加，而氮肥農(nóng)學利用率、氮肥生產(chǎn)效率和氮肥吸收效率均逐漸降低。張如標等[28]研究顯示，增施氮肥雖可顯著提高大麥產(chǎn)量，但降低了氮肥偏生產(chǎn)力和氮肥農(nóng)學利用效率。張金燦等[15]研究表明，大麥的氮素轉(zhuǎn)運效率和氮肥生理利用率隨著施氮量的增大均表現(xiàn)為先增大后減小。本研究表明，隨著施氮量的增加，低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥的氮肥農(nóng)學利用率和氮肥偏生產(chǎn)力均逐漸降低，在160 mg N·kg-1土時氮肥農(nóng)學利用率和氮肥偏生產(chǎn)力最高，分別為5.42%和11.74。