小麥IQM基因家族鑒定及非生物脅迫下表達分析

梁婷， 左靜紅， 陸青， 楊東， 唐益苗， 郭春曼*，汪德州*， 王偉偉*

（1.長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025； 2.北京市農(nóng)林科學院雜交小麥研究所，北京 100097）

鈣離子（Ca2+）是細胞內(nèi)重要的第二信使之一，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫等生物學過程中發(fā)揮重要作用[1]。植物主要通過鈣離子傳感器監(jiān)測細胞質(zhì)中Ca2+水平變化，進而調(diào)控一系列下游反應[2-3]。鈣離子傳感器分為4類：鈣調(diào)素 (calmodulin，CaM)、鈣調(diào)素類似蛋白 (calmodulin like protein，CML)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B 樣蛋白 (calmodulin B-like，CBL)和鈣依賴型蛋白激酶 (calcium dependent protein kinase，CDPK)[4-5]。其中，鈣調(diào)素是一種高度保守的小型酸性蛋白，自身沒有酶活性，在結(jié)合Ca2+后產(chǎn)生構(gòu)象變化，激活其下游靶蛋白-鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin binding protein，CaMBP）行使其功能。CaM 與CaMBP 結(jié)合類型分為2 類，需要Ca2+參與的為Ca2+依賴型，不需要Ca2+參與的為Ca2+不依賴型[6]。Ca2+不依賴型中存在含有IQ 基序（IQxxxRGxxxR）的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)域和所含IQ 基序數(shù)量的不同，將此種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白分為5類，分別是IQM (IQ motif containing protein)、CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)、IQD (IQ67-domain containing protein)、CNGC(cyclic nucleotide-gated channel)和myosin。其中，IQM 只含有1 個能與鈣調(diào)素結(jié)合的IQ 基序，且該基序位于氨基酸序列N端[7]。IQM 廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實等器官中，是鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族基因中非常重要的一類，與其他鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族相比，植物特異性IQM基因僅在擬南芥、水稻中進行了全面分析，其他物種中甚少報道。報道顯示，IQM基因在各種不同組織及不同脅迫條件下的表達量有顯著變化，其可能參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫等多種生理調(diào)控過程[8]。

擬南芥中已鑒定出6 個IQM基因家族成員(IQM1～IQM6)，其 蛋 白 質(zhì)N 端均含有1 個IQ 基序[2]。AtIQM1與AtCaM5能在酵母和植物細胞中結(jié)合，并以Ca2+依賴型方式通過影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量來調(diào)節(jié)氣孔運動[9]，AtIQM1的突變體氣孔開度顯著減小，且不受外因（光照、黑暗等）誘導，過表達AtIQM1植株在光誘導氣孔開放處理后氣孔開放度明顯增大[10]。此外，AtIQM1在調(diào)控根系生長、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）生物合成及防御灰霉病過程中也發(fā)揮重要作用[2,11]；AtIQM2參與擬南芥根的生長發(fā)育及開花調(diào)控，AtIQM2突變體成花時間推遲[12]；AtIQM3通過調(diào)控擬南芥光周期途徑進而影響開花時間[13]；AtIQM4對植物生長發(fā)育起正調(diào)控作用，在種子休眠和萌發(fā)期發(fā)揮重要作用[14]；AtIQM5通過參與調(diào)控年齡途徑影響擬南芥開花時間[15]；AtIQM6基因突變致使遠軸面表皮毛的發(fā)生晚于野生型[16]。水稻中已報道7 個IQM基因家族成員，研究顯示OsIQMs通過與OsCaMs相互作用參與多種通路調(diào)控，并且OsIQMs中的IQ 基序是OsIQMs與OsCaMs結(jié)合所必需的，幾乎所有的OsIQMs基因都是ABA 和MeJA 響應基因，OsIQM1通過與OsWRKY24共同作用參與植物病害反應[7]。

小麥是最重要的糧食作物之一，提高小麥抗逆性、增加小麥產(chǎn)量，是解決糧食安全問題的關(guān)鍵因素。植物特異性IQM基因參與逆境脅迫調(diào)控，但小麥中IQM基因家族成員及功能尚未進行系統(tǒng)報道。本研究在小麥全基因組水平下共鑒定出23 個TaIQM基因家族成員，對其染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、非生物脅迫下的基因表達模式等進行了系統(tǒng)分析，篩選得到了一些可能參與小麥逆境脅迫相關(guān)的候選基因，為深入研究小麥IQM基因的重要生物學功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取小麥標準栽培品種中國春(Chinese spring, CS)為試驗材料，將種子置于25 ℃的光照培養(yǎng)間水培，待長到2 葉1 心期，對小麥幼苗分別進行PEG-6000 溶液、低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）、NaCl (0.2 mol·L-1)和ABA（0.15 mol·L-1）脅迫處理，設3 次生物學重復，以0 h 未處理的地上部和地下部組織作為對照（CK），在處理1、3、6、12、24 h 后取地上部和地下部組織，液氮冷凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥IQM基因家族鑒定 從Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥、水稻IQM 家族蛋白序列及小麥全基因組CDS 和蛋白序列，利用HMMER 軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型，使用SMART(http://smart.emblheidelberg)、Pfma(https://pfam.xfam.org/)確 認是否含有完整的IQ 結(jié)構(gòu)域[17]。使用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站獲取小麥IQM 家族成員蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)、分子量等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。使用Euk-mPLoc 2.0 server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)網(wǎng)站在線進行亞細胞定位預測分析。

1.2.2 小麥IQM基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 運用MEGA X 中的Align by Clustal W 對小麥、水稻、擬南芥IQM 基因家族蛋白序列進行多序列比對，參數(shù)設置為默認值，Bootstrap 值設置為1 000，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，構(gòu)建所得進化樹使用 Evolview(https://evolgenius. info//evolview-v2/#login)在線工具進行處理。

1.2.3 小麥IQM基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析使用GSDS 軟件(http://gsds.gao-lab.org/)分析小麥IQM 基因家族成員基因結(jié)構(gòu)，使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行保守基序測定，最大Motif 數(shù)量設置為10，其他參數(shù)為默認值，利用TBtools 軟件中的Gene Structure View 程序進行可視化。

1.2.4 小麥IQM基因啟動子順式作用元件預測從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中提取小麥IQM基因起始密碼子上游2 000 bp 序列，使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子順式作用元件[18]，利用TBtools 軟件中Gene Structure View程序進行可視化。

1.2.5 小麥IQM基因組織表達模式分析 利用WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32/)查找并下載中國春不同組織不同時期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，分析小麥IQM基因的組織表達特異性，使用TBtools軟件中的HeatMap程序繪制表達模式熱圖。

1.2.6 小麥IQM基因成員非生物脅迫表達模式分析 依據(jù)數(shù)據(jù)庫中下載的小麥IQM基因CDS序列，避開保守結(jié)構(gòu)域設計qRT-PCR 引物（表1）。采用Trizol 法提取脅迫處理小麥材料總RNA 后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時測定OD260/280值。使用HiScript?Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板進行qRT-PCR 分析。反應體系為20 μL，包括Taq Pro Universal SYBR Qpcr Master Mix(諾唯贊生物科技股份有限公司) 10 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、cDNA 模板2 μL(100 ng)，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃變性15 s，擴增曲線和熔解曲線鑒定引物特異性。3 次生物學重復，采用2-△△CT法[19]計算相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers 續(xù)表Continued

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 TaIQM基因家族鑒定及序列分析

利用生物信息學方法獲得23 個TaIQM基因家族成員。Pfam 分析表明，TaIQM 蛋白均含有IQ結(jié)構(gòu)域。按照其在小麥染色體上的位置依次命名為TaIQM1～TaIQM23（表2）。染色體定位顯示TaIQM基因不均勻的分布在18條染色體上，其中，5A、5B、5D、6B 和6D 染色體上均含有2 個IQM基因，其他染色體上均只含有1個IQM基因。對23個TaIQM 蛋白的氨基酸數(shù)目、相對分子量、等電點等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析結(jié)果顯示，TaIQM基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)目在424～669 個之間，相對分子量在47 667.67～74 779.20 Da之間，等電點在6.14～9.67 之間，TaIQM 蛋白間氨基酸數(shù)目存在較大差異，相應的蛋白相對分子量、等電點也存在較大差異。亞細胞定位預測顯示TaIQM家族基因主要存在于細胞核中。

表2 小麥IQM基因家族蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of TaIQM genes 續(xù)表Continued

表2 小麥IQM基因家族蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of TaIQM genes

2.2 TaIQM基因家族蛋白系統(tǒng)進化分析

為研究小麥IQM基因與水稻、擬南芥的系統(tǒng)進化關(guān)系，將23 個小麥 (Triticum aestivumL.)、8 個水稻(Oryza sativa)和6 個擬南芥(Arabidopsis thaliana)的IQM蛋白序列進行多序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果顯示，IQM基因家族成員可分為3個亞家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，Ⅰ中共有15個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因9個，TaIQM4、TaIQM5、TaIQM6與OsIQM5在一個分支上，表明他們之間進 化 關(guān) 系 相 近；TaIQM10、TaIQM11、TaIQM12與OsIQM2、TaIQM6在 一 個 分 支 上；TaIQM14、TaIQM16、TaIQM18與OsIQM3在一個分支上，他們都與AtIQM2和AtIQM6屬于同一亞家族。Ⅱ中含有11個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因6 個，TaIQM1、TaIQM2、TaIQM3與OsIQM4在同一分支上；TaIQM7、TaIQM8、TaIQM9與OsIQM1在同一分支上，他們都與AtIQM1、AtIQM4和AtIQM5屬于同一亞家族。Ⅲ中含有11 個IQM基因家族成員，其中小麥IQM基因8個，TaIQM13、TaIQM15、TaIQM17、TaIQM19、TaIQM20、TaIQM21、TaIQM22、TaIQM23與OsIQM7、OsIQM8、AtIQM3屬于同一亞家族。所有亞家族中小麥與水稻IQM家族成員進化關(guān)系較近，同源性較高，與擬南芥親緣關(guān)系較遠，表明IQM家族基因在單子葉植物和雙子葉植物進化過程中發(fā)生了分離。

圖1 IQM蛋白進化樹分析Fig. 1 Phylogeny analysis of IQM proteins

2.3 TaIQM基因家族成員結(jié)構(gòu)特性

TaIQM基因結(jié)構(gòu)分析顯示，所有TaIQM基因均含有內(nèi)含子、外顯子，家族成員間基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性（圖2A）。TaIQM基因含有外顯子數(shù)量在5～10 個之間，其中，TaIQM3只含有5 個外顯子；TaIQM4、TaIQM5等5 個 基 因 含 有7 個 外 顯 子；TaIQM9、TaIQM11等5 個基因含有8 個外顯子；TaIQM1、TaIQM10等11 個基因含有9 個外顯子；TaIQM2含有11個外顯子。除TaIQM2、TaIQM8和TaIQM20外，其他都含有3'UTR。蛋白基序分析顯示（圖2B），TaIQM基因家族中有16個基因均含有10 個相同基序；TaIQM1、TaIQM2、TaIQM7等5 個基因只含有9 個Motif，不含有Motif10；TaIQM3僅含有6個Motif；所有TaIQM基因都含有Motif6（IQM基因家族保守結(jié)構(gòu)域）（圖2C）。以上說明相似度較高的TaIQM基因間可能有相同進化方向。

圖2 TaIQM家族成員結(jié)構(gòu)特征和保守基序分析Fig. 2 Structure and conservative motif analysis of the TaIQM

2.4 TaIQM基因順式作用元件

TaIQM基因包含多種脅迫響應順式作用元件(圖3)，如干旱誘導(MBS)、厭氧(ARE)、低溫(LTR)、防御與應激(TC-rich repeats)響應元件，還包含多種激素響應順式作用元件，如脫落酸(ABRE)、生長 素(TGA-element)、赤 霉 素(GARE-motif、P-box、TATC-box)和水楊酸(TCA-element)響應元件，推測TaIQM可能參與脅迫響應和激素響應過程。此外，TaIQM基因還包含一些保守的順式作用元件(如CAAT-box、TATA-box 等)和一些光響應(ACE、G-box)、分生組織表達調(diào)控(CAT-box)、晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)和胚乳表達調(diào)控(GCN4-motif)等元件，預示著TaIQM家族可能還參與其他多種生物學過程。

圖3 TaIQM啟動子順式作用元件預測Fig. 3 Cis-acting elements analysis of TaIQM genes

2.5 TaIQM基因組織表達特性

根據(jù)網(wǎng)站中已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，繪制23 個TaIQM基因的組織表達量熱圖（圖4）。結(jié)果顯示，不同TaIQM基因間表達量差別明顯，同一TaIQM基因在不同組織的不同時期間表達量也存在差別。其中，TaIQM2在不同組織中都有較高的表達量；TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12在不同組織中表達量極低；TaIQM4和TaIQM5在拔節(jié)早期的莖中表達量較高；TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在分蘗早期和開花后2 d 的葉中表達量較高；TaIQM13在1 葉期的根中表達較高；TaIQM6、TaIQM15和TaIQM17在拔節(jié)早期的穗中表達量較高；TaIQM18在根的不同時期中表達較高；TaIQM19、TaIQM21和TaIQM23在開花后2 d 的籽粒中表達量較高?；虻谋磉_量變化表明在不同的發(fā)育時期各個TaIQM基因功能各不相同。

圖4 TaIQM基因在不同組織中的表達量熱圖Fig. 4 Heat map of relative expression level of TaIQM genes in different tissues

2.6 非生物脅迫下TaIQM基因qRT-PCR分析

TaIQM基因家族成員對非生物脅迫存在不同程度的響應，相對表達量存在明顯差異（圖5）。低溫處理下，7 個TaIQM基因在地上部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12；3個TaIQM基因在地下部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM1、TaIQM2、TaIQM3。高 溫 處 理 下，2 個TaIQM基因在地上部呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，如TaIQM7和TaIQM9；全部TaIQM基因在地下部均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達趨勢。NaCl 處理下，11個基因在地上部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM4、TaIQM5和TaIQM6；9 個基因在地下部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。ABA 處理下，2 個基因在地上部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM11和TaIQM12；6 個基因在地下部呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM13（圖5A）。干旱處理下，17個TaIQM基因在地上部均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達趨勢，如TaIQM10、TaIQM11和TaIQM12，其余6 個TaIQM基因在地上部呈下調(diào)表達趨勢；所有TaIQM基因在地下部均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達趨勢（圖5B）。推測在小麥苗期地下部，干旱脅迫對所有TaIQM基因的表達存在促進作用。

3 討論

IQM基因廣泛存在于植物中，參與調(diào)控眾多生理生化過程，在擬南芥、水稻中已有系統(tǒng)研究，而在小麥中還未見報道。本研究在小麥全基因組中鑒定出23個IQM 基因家族成員，對獲得的TaIQM基因染色體位置、蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、表達模式等進行全面分析。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，IQM基因家族被劃分為3 個亞族。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系揭示了IQM 蛋白之間的進化關(guān)系，同一亞科中最近緣的成員在保守蛋白序列和基序結(jié)構(gòu)上相似，每個亞家族的IQM 蛋白可能具有相似的功能[20]。保守蛋白序列分析顯示，小麥IQM基因均存在6 個相同的Motif，其中Motif 6是位于蛋白序列N端且包含IQ基序的IQM基因家族保守結(jié)構(gòu)域[7]。IQ 結(jié)構(gòu)域與鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，報道顯示，IQD 蛋白與玉米、毛竹和擬南芥中的CaMs 相互作用[21]，擬南芥中，IQM 蛋白與CaMs 相互作用[2]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)基因的3'端和5'端都含有UTR，且都存在7～10個外顯子。在Motif相同情況下，內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)差異是推動多基因家族演變的關(guān)鍵因素之一。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)TaIQM基因存在大量與生長發(fā)育、脅迫應答、激素調(diào)節(jié)相關(guān)的順式作用元件，推測TaIQM基因可能通過與干旱誘導、脫落酸、赤霉素等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相互作用調(diào)控干旱應答，但還需相關(guān)試驗進一步驗證。鈣調(diào)素信號轉(zhuǎn)導途徑是調(diào)控植物生長發(fā)育、逆境脅迫的重要信號組成部分，主要由鈣離子、鈣調(diào)素及鈣調(diào)素結(jié)合蛋白組成[5]。目前，已報道的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白多達90 種以上，如MYB、NAC、WRKY、CBP60、CAMTA/SR 等轉(zhuǎn)錄因子[3]，它們通過協(xié)同作用調(diào)控植物生長發(fā)育及脅迫反應，如OsWRKY24通過與OsIQM1協(xié)同作用應對植物病害反應。23個TaIQM基因在不同發(fā)育階段和不同組織中表達差異顯著，這些基因可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用參與調(diào)控小麥生長發(fā)育過程。

植物中的IQM基因在干旱、低溫等非生物脅迫應答中起重要作用[22]，且在不同時空條件下參與調(diào)節(jié)不同的脅迫反應[21]。報道顯示，AtIQM1介導CaM、光和部分非生物脅迫信號的轉(zhuǎn)導[2]，AtIQM4在擬南芥中與AtIQM1協(xié)同參與光和ABA對氣孔運動的調(diào)控[23]，鹽和滲透脅迫均可降低擬南芥苗期AtIQM1和AtIQM4的表達水平，脫水、低溫處理均能提高AtIQM4的表達水平，AtIQM4在植物非生物脅迫響應中起重要作用[14]。水稻中7 個IQM基因在重金屬鹽CdCl2和Pd(NO3)2處理下的擬南芥幼苗中全部顯示上調(diào)表達。OsIQM3和OsIQM5在PEG 脅迫反應中顯示較高的轉(zhuǎn)錄水 平[7]。TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9與AtIQM1、AtIQM4進化關(guān)系相近，干旱脅迫下TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在地下部顯著上調(diào)表達，與AtIQM4的表達模式相似，基因表達模式為研究基因功能提供重要依據(jù)，這些基因在小麥干旱脅迫應答反應地下部中均呈現(xiàn)正向調(diào)控，結(jié)合組織表達數(shù)據(jù)中TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9在根和葉組織中偏好表達，表明TaIQM7、TaIQM8和TaIQM9可能參與調(diào)控小麥苗期地下部抗旱反應。這些基因可作為抗旱候選基因進一步深入研究。

本研究在小麥全基因組水平上系統(tǒng)鑒定和分析了23 個小麥IQM基因，對其生物信息學及非生物脅迫下表達模式進行了系統(tǒng)分析。進化樹分析表明小麥IQM基因分為3 個亞家族(I～III)，基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列分析表明這些基因在每個亞家族中都相對保守。非生物脅迫下的表達模式分析表明絕大多數(shù)IQM基因?qū)EG、NaCl、冷和 ABA 處理有反應，說明它們參與植物響應非生物脅迫調(diào)控過程。本研究結(jié)果為深入探究小麥IQM家族各成員的生物學功能及非生物脅迫作用機制和小麥抗逆分子育種提供一定參考。