口咽鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA檢測(cè)的研究進(jìn)展

王潤(rùn)堃, 陸漢強(qiáng), 黃秋生

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,江蘇鎮(zhèn)江 212000

口咽鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of the oropharynx,OPSCC)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的重要組成部分,其常見(jiàn)于舌、咽后壁、腭扁桃體、軟腭等部位[1]。OPSCC分為兩種:由吸煙和飲酒引起的HPV陰性疾病和由性傳播感染人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)引起的HPV陽(yáng)性疾病[2]。

1 口咽鱗狀細(xì)胞癌的流行病學(xué)

目前,OPSCC的全球發(fā)病率基本保持穩(wěn)定,但HPV(+)OPSCC的發(fā)病率卻在逐年增加,2021年全球范圍內(nèi)HPV(+)OPSCC的發(fā)病率約為33%[3]。但HPV(+)OPSCC的發(fā)病率在不同的區(qū)域有著較大的差異,尤其在發(fā)達(dá)地區(qū),其發(fā)病率要明顯高于煙草、酒精引起的HPV(-)OPSCC[4-5]。造成這種差異的原因可能是發(fā)達(dá)地區(qū)的人群對(duì)于性行為思維方式的改變,特別是20世紀(jì)50年代至60年代發(fā)生的性革命,導(dǎo)致人們初次性行為的年齡降低,同時(shí)人們開(kāi)始熱衷于口交[6]?？诮皇钦T發(fā)HPV(+)OPSCC的最大因素[7],口咽部感染HPV的風(fēng)險(xiǎn)很大程度上取決于近3個(gè)月來(lái)口交的性伴侶數(shù)量[8]。容易罹患HPV(+)OPSCC的人群大都有相似的特征,例如多為白種男性人,有過(guò)良好的教育及較高的社會(huì)地位,很少有吸煙或酗酒史[9]。

2 HPV的感染及發(fā)病機(jī)制

HPV通過(guò)性傳播、母嬰傳播等途徑感染皮膚或者黏膜,進(jìn)而引起皮膚或黏膜的良、惡性腫瘤[10]。根據(jù)病毒對(duì)感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度,HPV可以分為兩種亞型:高危險(xiǎn)型和低危險(xiǎn)型。在不同的亞型中,HPV-16、HPV-18是引起HPV相關(guān)疾病的主要亞型。目前,HPV-16被認(rèn)為是導(dǎo)致HPV(+)OPSCC的關(guān)鍵亞型[1]。HPV(+)OPSCC好發(fā)部位大多位于舌根扁桃體和腭扁桃體,一方面其鱗狀上皮可以成為遮蔽病毒的場(chǎng)所,另一方面也為病毒進(jìn)入基底層提供路徑[11]。

持續(xù)感染是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的關(guān)鍵。當(dāng)腫瘤抑制基因被破壞,就會(huì)出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化[12]。HPV是一種無(wú)包膜的小分子環(huán)狀DNA病毒,包括結(jié)構(gòu)蛋白(L1、L2)和功能蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)[13]。E6和E7是主要的癌蛋白,但其余的蛋白在病毒的復(fù)制過(guò)程中同樣至關(guān)重要。例如L1和L2是病毒裝配所必需的,而E1、E2和E4是病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)復(fù)制所必需的[13]。E6和E7已經(jīng)被證實(shí)可以分別抑制腫瘤抑制基因腫瘤蛋白53(tumor protein P53,TP53)和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(retinoblastoma gene,RB)。E6通過(guò)抑制腫瘤抑制基因TP53,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。E7通過(guò)介導(dǎo)RB使得被轉(zhuǎn)錄因子E2F激活的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶抑制劑INK4A被抑制,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,并連續(xù)導(dǎo)致p16過(guò)表達(dá)[13]。同時(shí),E6和E7之間也具有協(xié)同作用,E6可以抵消E2F介導(dǎo)的凋亡,E7可以保護(hù)E6免受INK4A的抑制[14]。

3 口咽鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA的檢測(cè)

隨著對(duì)OPSCC的研究不斷深入,多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明,HPV(+)OPSCC對(duì)輻射的靈敏度要強(qiáng)于HPV(-)OPSCC,并且預(yù)后更好[15]。隨著根據(jù)HPV狀態(tài)選擇降級(jí)化治療的證據(jù)不斷增加,一些研究人員開(kāi)始倡導(dǎo)針對(duì)HPV(+)OPSCC患者進(jìn)行降級(jí)化治療以提高患者的生活質(zhì)量[16]。因此,檢測(cè)OPSCC患者病變部位的HPV具有潛在的治療意義。目前針對(duì)OPSCC中HPV DNA檢測(cè)的方法包括HPV DNA/RNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、p16免疫組織化學(xué)(IHC)和DNA/RNA原位雜交(ISH)檢測(cè)[17]。PCR是目前檢測(cè)HPV DNA的金標(biāo)準(zhǔn),具有高特異度和靈敏度,但存在高成本、耗時(shí)長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高等缺點(diǎn)[18]。p16原位雜交的IHC染色是PCR的替代檢測(cè)標(biāo)記,具有價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn),但其靈敏度和特異度低于PCR[19]。并且其結(jié)果存在病理學(xué)家的主觀偏差,容易導(dǎo)致假陽(yáng)性或者假陰性的發(fā)生[19]。因此,需要一種簡(jiǎn)單、省事且經(jīng)濟(jì)的方法用于檢測(cè)OPSCC患者中HPV的狀態(tài)和亞型。目前,擁有前景的HPV DNA檢測(cè)方法包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、數(shù)字液滴PCR以及第二代測(cè)序技術(shù),以下將對(duì)這三種方法進(jìn)行一一闡述。

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種應(yīng)用等溫條件擴(kuò)增目標(biāo)DNA的技術(shù),是一系列PCR檢測(cè)方法的替代[20]。LAMP通過(guò)設(shè)計(jì)4～6條特異度引物對(duì)目標(biāo)基因的6～8個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行識(shí)別,同時(shí)由于反應(yīng)過(guò)程中焦磷酸鎂的沉淀,結(jié)果通過(guò)肉眼即可觀察,無(wú)需使用昂貴且耗時(shí)的凝膠電泳和分光光度法進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì),不僅節(jié)省了費(fèi)用而且縮短了檢測(cè)的時(shí)間[21]。已有多種基于LAMP的方案用于瘧疾及結(jié)核病的檢測(cè),并且證實(shí)其靈敏度和特異度與PCR相同[22-23]。Hagiwara等[24]在2007年開(kāi)始將LAMP用于檢測(cè)HPV高危亞型引起的生殖器病變。隨后,Livingstone等[25]提出可以將LAMP用于檢測(cè)口咽鱗狀細(xì)胞癌中HPV的高危亞型,指出LAMP具有與PCR相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異度,通過(guò)使用PCR和LAMP分別檢測(cè)OPSCC中HPV的部分高危亞型,結(jié)果顯示,相比于PCR,LAMP的平均靈敏度為99.4%,平均特異度為93.2%。而最容易引起口咽鱗狀細(xì)胞癌的HPV-16、HPV-18,LAMP檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為97.6%、80.0%以及100.0%、97.7%。但在這項(xiàng)研究并未完全指出LAMP的檢測(cè)是否同PCR一樣需要先進(jìn)行DNA純化。因此,Rohatensky等[26]結(jié)果表明,LAMP無(wú)需DNA純化即可對(duì)OPSCC中的HPV亞型進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步凸顯了LAMP在檢測(cè)OPSCC中HPV DNA的潛力。

3.2 數(shù)字液滴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

數(shù)字液滴PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的新型技術(shù)。在進(jìn)行傳統(tǒng)的PCR操作前,將反應(yīng)體系分成數(shù)個(gè)微小的液滴,每個(gè)液滴都包含PCR反應(yīng)所需要的DNA模板以及試劑,從而使得每個(gè)液滴都可以進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增[27]。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,ddPCR可以在不使用校準(zhǔn)曲線的情況下進(jìn)行核酸定量,同時(shí)在模板濃度較低的情況下?lián)碛斜葌鹘y(tǒng)PCR技術(shù)更高的精確度、靈敏度以及檢出率[28]。

目前,使用ddPCR檢測(cè)HPV的方案已經(jīng)在多種組織樣本中得到了證實(shí)。Schiavetto等[29]通過(guò)ddPCR檢測(cè)使用福爾馬林固定石蠟包埋處理的樣本(FFPE)中HPV DNA的含量與p16 IHC進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)結(jié)果具有一致性。同時(shí)指出,p16 IHC與ddPCR聯(lián)合使用時(shí)可以顯著提高診斷HPV(+)OPSCC的特異度,更好的進(jìn)行預(yù)防、篩查和指導(dǎo)治療[29]。Biron等[30]使用市面上售賣(mài)的商用試劑盒從OPSCC組織、細(xì)針穿刺抽吸樣本以及口咽拭子樣本中提取足量的HPV-16 RNA,通過(guò)與p16 IHC對(duì)比發(fā)現(xiàn),ddPCR檢測(cè)HPV E6/E7的靈敏度和特異度分別為91.3%和100%。Isaac等[31]在OPSCC患者的口咽拭子中檢測(cè)到HPV-16,并通過(guò)與p16 IHC檢測(cè)手術(shù)標(biāo)本的結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn),ddPCR檢測(cè)結(jié)果有92%的靈敏度和98%的特異度,進(jìn)一步表明了ddPCR檢測(cè)HPV DNA具有良好的靈敏度和特異度,且無(wú)需進(jìn)行有創(chuàng)的組織活檢。

ddPCR的缺點(diǎn)在于需要使用材料進(jìn)行各亞型的獨(dú)立檢測(cè)。ddPCR的一種替代方法是第二代測(cè)序技術(shù),可以在一次測(cè)試中捕獲多種亞型,并產(chǎn)生更高的靈敏度。

3.3 第二代測(cè)序技術(shù)

第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS),又稱(chēng)為下一代測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)是以第一代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ),以低成本、99%以上的準(zhǔn)確度,1次可對(duì)幾百、幾千個(gè)樣本的幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子同時(shí)進(jìn)行快速測(cè)序分析[32]。基于第二代測(cè)序技術(shù)的病毒宏觀基因組學(xué)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足,有望成為研究病毒的有效技術(shù)[33]。

Lee等[34]在一項(xiàng)前瞻性研究中使用NGS評(píng)估HPV ct DNA在監(jiān)測(cè)局部晚期HNSCC患者在接受初次放化療(CCRT)后疾病的反應(yīng)。這項(xiàng)研究中共納入75例OPSCC患者,其中實(shí)驗(yàn)組47例,對(duì)照組28例。結(jié)果顯示,NGS檢測(cè)HPV ct DNA在確定腫瘤組織中HPV16狀態(tài)具有100%的靈敏度和特異度。Lee等[35]隨后在2020年的一項(xiàng)前瞻性研究中使用NGS檢測(cè)接受放化療的肛門(mén)鱗狀細(xì)胞癌患者血液中的HPV DNA,結(jié)果顯示NGS對(duì)血液中HPV ct DNA的檢測(cè)具有100%的靈敏度和特異度。Sastre-Garau等[36]指出,使用NGS檢測(cè)不同腫瘤部位患者血液中不同HPV ct DNA的靈敏度和特異度分別為95.0%和98.1%;并指出臨床分期與檢測(cè)靈敏度呈正相關(guān),T1期腫瘤檢出率為72.7%,T2為95.9%,T3/T4為100%;所有淋巴結(jié)陽(yáng)性或轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的腫瘤均為HPV ct DNA陽(yáng)性(靈敏度為100%,特異度為97.4%)。

4 小 結(jié)

越來(lái)越多的研究表明HPV的狀態(tài)可能會(huì)對(duì)OPSCC的分期、治療以及預(yù)后產(chǎn)生影響,特別是支持HPV(+)OPSCC患者降級(jí)化治療的專(zhuān)家越來(lái)越多,選擇合適的HPV檢測(cè)方法愈發(fā)重要。目前HPV的檢測(cè)可以通過(guò)PCR、p16 IHC以及ISH單獨(dú)或者聯(lián)合使用來(lái)進(jìn)行。PCR是目前檢測(cè)HPV DNA的金標(biāo)準(zhǔn),p16 IHC是臨床診斷中的替代標(biāo)記物。但不論是PCR還是p16 IHC或者其他檢測(cè)方法,每一種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。選擇最佳的檢測(cè)方法,需要考慮成本、耗時(shí)以及操作難度。目前尚未對(duì)OPSCC中HPV DNA的檢測(cè)達(dá)成共識(shí),但基于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的新技術(shù)被不斷開(kāi)發(fā)出來(lái),并有著較高的靈敏度和特異度。本文并未對(duì)傳統(tǒng)的檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié),而是將目光放在了目前具有前景的HPV DNA檢測(cè)方法,但這些方法仍存在結(jié)果假陽(yáng)性或者假陰性的可能。目前最有前景的檢測(cè)方法是第二代測(cè)序技術(shù),該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在EB病毒(epstein-Barr virus,EBV)相關(guān)的鼻咽癌中顯示出了巨大的前景,隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,檢測(cè)HPV ct DNA很有可能成為新的、有價(jià)值的HPV生物標(biāo)記物。