全自動密閉式組織脫水機的應(yīng)用流程探討

鄧桃,周勝理,孔令非

(河南省人民醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450003)

近年來為了滿足臨床及病理診斷的需要,對組織制片的要求也越來越高。而組織蠟塊脫水效果直接影響到組織制片及后續(xù)各項分子的檢測[1-3]?？剖颐磕曛谱鞯南瀴K數(shù)量在11萬左右,所以需要一套完善的固定脫水流程以滿足實際需求。技術(shù)員在全自動脫水機的固定、脫水、透明、浸蠟等脫水流程的摸索中總結(jié)了一套適應(yīng)科室的脫水流程,經(jīng)過實踐后,標(biāo)本的處理效果更加滿意,特別是活檢小標(biāo)本蠟塊質(zhì)量及切片質(zhì)量完全滿足診斷的需要。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集醫(yī)院病理科接受的外科手術(shù)標(biāo)本及各種穿刺、內(nèi)窺鏡夾取小標(biāo)本。

1.2 儀器和試劑儀器:櫻花全自動密閉式組織脫水機Tissue-Tek-VIPR6AI型11臺,每臺配備不銹鋼標(biāo)本框及蓋子各2只,可容納300個塑料大孔包埋盒或330個塑料細(xì)孔包埋盒。試劑:固定液(40 g·L-1的多聚甲醛溶液)、脫水劑(體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、95%、100%的酒精)、透明劑(二甲苯),均購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司;進(jìn)口櫻花石蠟(60～62 ℃)。

1.3 試劑設(shè)置櫻花全自動密閉式組織脫水機附帶12個試劑缸和4個蠟缸,改進(jìn)前固定液、脫水劑、透明劑、浸蠟和清洗液按2∶6∶2∶4∶2配置,按改進(jìn)后按1∶7∶2∶4∶2配置。改進(jìn)前第1、2缸為40 g·L-1的多聚甲醛溶液,第3～8缸為梯度酒精,依次體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精1缸,體積分?jǐn)?shù)為85%的酒精1缸,體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精2缸,體積分?jǐn)?shù)為100%的酒精2缸,第9～10缸為二甲苯,第11～14缸為石蠟,第15缸為清洗液二甲苯,第16缸為清洗液體積分?jǐn)?shù)為100%的酒精;改進(jìn)后第1缸為40 g·L-1的多聚甲醛溶液,第2～8缸為梯度酒精,依次體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精1缸,體積分?jǐn)?shù)為85%的酒精1缸,體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精2缸,體積分?jǐn)?shù)為100%的酒精3缸,第9～16缸同改進(jìn)前。固定液、清洗液需要4.2 L,其余試劑3.7 L。

1.4 脫水機程序改進(jìn)前脫水機只設(shè)1種脫水程序,大小標(biāo)本不分開運行(見表1)。當(dāng)日所有送檢標(biāo)本不進(jìn)行過夜預(yù)固定,新鮮標(biāo)本取材后統(tǒng)一置入有病理編號的標(biāo)本框,入脫水機過夜運行,組織間不留間隙,不需要真空、攪拌。試劑更換不區(qū)分大換和小換,所有試劑在使用1周后全部更換。試劑設(shè)置時前3缸石蠟用于浸蠟,第4個缸的蠟液備用不參與浸蠟。

表1 改進(jìn)前標(biāo)本脫水程序

1.5 脫水機程序改進(jìn)后

1.5.1程序設(shè)定 根據(jù)組織大小設(shè)置常規(guī)脫水和小標(biāo)本脫水2種程序,并固定2臺脫水機負(fù)責(zé)活檢小標(biāo)本的固定脫水、透明、浸蠟。脫水機中試劑溫度設(shè)定常溫、浸蠟溫度63 ℃,不需要真空、攪拌,組織在脫水機中過夜處理。送檢大標(biāo)本組織取材范圍約為1.5 cm×1.5 cm×(0.2～0.3)cm,內(nèi)鏡及各種活檢小標(biāo)本取材全取,取材完畢后統(tǒng)一置入有病理編號的大孔包埋盒內(nèi)和細(xì)孔包埋盒內(nèi)[4],選擇脫水程序進(jìn)行處理(見表2)。

表2 改進(jìn)后常規(guī)大、小標(biāo)本脫水程序

1.5.2試劑更換 試劑更換分為脫水機大換和小換。脫水機大換是將第1缸40 g·L-1的多聚甲醛溶液、第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精、第3缸體積分?jǐn)?shù)為85%酒精倒掉,更換新的試劑;第4缸體積分?jǐn)?shù)為95%酒精倒掉,第5缸體積分?jǐn)?shù)為95%酒精前移,并將第4缸新更換的體積分?jǐn)?shù)為95%酒精放在第5缸的位置;第6 缸體積分?jǐn)?shù)為100%酒精倒掉,依次將第7、8缸體積分?jǐn)?shù)為100%酒精前移,并第6缸新更換的體積分?jǐn)?shù)為100%酒精放在第8缸的位置;將第9缸二甲苯倒掉,第10缸二甲苯前移,并將第9缸新更換的二甲苯放在第10缸的位置;第11缸的石蠟倒掉,后面石蠟依次前移,第14缸的蠟倒入第13缸,第14缸的蠟為新更換的石蠟。清洗液二甲苯和清洗液體積分?jǐn)?shù)100%的酒精隨脫水機大換更換新試劑。脫水機小換是將第1缸40 g·L-1的多聚甲醛溶液和第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精更換,余試劑不更換。

1.5.3試劑更換指標(biāo) 脫水機程序結(jié)束后檢測第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精濃度[5],觀察包埋時組織脫水情況和鏡下組織制片質(zhì)量,同時參考脫水機使用登記表上蠟塊數(shù)量及脫水機換液登記表上機器使用時間(見圖1、2)。

圖1 儀器設(shè)備使用登記表

圖2 脫水機換液登記表

1.6 機器和標(biāo)本框的清洗組織包埋后的標(biāo)本框及蓋子隨脫水機一起清洗。脫水機清洗需要72 min,經(jīng)過60 ℃ 10 min預(yù)熱,然后經(jīng)過4遍二甲苯和2遍體積分?jǐn)?shù)為100%酒精循環(huán)清洗,其間不需要加壓、真空及循環(huán)攪拌。

1.7 組織脫水質(zhì)量評價脫水后組織軟硬程度,組織蠟塊久置,觀察是否發(fā)生干涸、表面是否凹陷變形。并在鏡下觀察組織切片結(jié)構(gòu)的完整性、厚薄均勻程度、染色情況、形態(tài)、組織有無斷裂或破碎情況等。

2 結(jié)果

2.1 組織肉眼觀脫水程序改進(jìn)前部分組織蠟塊脫水不足,組織發(fā)白且發(fā)硬、中心有凹陷(圖3);改進(jìn)后組織軟硬適中、有彈性,久放無凹陷,較硬的組織,如宮頸組織效果明顯,尤其是內(nèi)鏡及活檢小標(biāo)本分開處理后對比明顯(圖4)。

圖3 脫水程序改進(jìn)前部分組織蠟塊

圖4 脫水流程改進(jìn)后肉眼觀

2.2 病理切片鏡下觀察脫水程序改進(jìn)前組織切片易脆、易碎、有裂隙皺褶、染色紅藍(lán)對比不清晰、組織有發(fā)白、變灰及脫水不盡等現(xiàn)象(圖5);改進(jìn)后切片厚薄均勻、染色鮮艷、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、紅藍(lán)對比明顯(圖6)。

A為子宮肌壁標(biāo)本;B為皮下組織標(biāo)本;C為淋巴結(jié)標(biāo)本;D為肌肉組織標(biāo)本。

A為乳腺浸潤性癌術(shù)后標(biāo)本;B為乳腺浸潤性癌穿刺標(biāo)本;C為肝細(xì)胞性肝癌手術(shù)大標(biāo)本;D為肝細(xì)胞性肝癌穿刺標(biāo)本。

3 討論

改進(jìn)后的脫水程序設(shè)定不但根據(jù)試劑的種類及組織的大小,還考慮每一環(huán)節(jié)需要的時間、溫度、壓力等指標(biāo),保證各個指標(biāo)的合理性以達(dá)到最佳的脫水效果。按送檢組織大小設(shè)置2種脫水程序,分別處理手術(shù)標(biāo)本及冰凍轉(zhuǎn)常規(guī)標(biāo)本及穿刺或內(nèi)鏡等直徑小于0.3 cm的標(biāo)本。2種程序把大小標(biāo)本分開處理,既避免大標(biāo)本的脫水不足又避免小標(biāo)本的處理過度,更方便掌握試劑更換時間。一般當(dāng)天下午脫水機開始運行,第2天上午8點程序結(jié)束,開始包埋工作。上機前仔細(xì)檢查組織包埋盒是否扣緊,尤其細(xì)孔小包埋盒,以防組織丟失。

組織處理的第1步是固定,固定的好壞直接關(guān)系到病理制片的優(yōu)良。改進(jìn)后的脫水流程對當(dāng)日送檢的大標(biāo)本進(jìn)行過夜預(yù)固定,第2天取材,但特殊的標(biāo)本如包膜厚的標(biāo)本及空腔標(biāo)本應(yīng)規(guī)范切開再過夜預(yù)固定,固定時間大于12 h,脫水機第1缸為40 g·L-1的多聚甲醛溶液補充固定,固定充分;對于當(dāng)日送檢的活檢及內(nèi)鏡小標(biāo)本則當(dāng)日取材后入脫水機處理,特別小的組織用易透水的薄紙包好后放入細(xì)孔包埋盒,以免組織在脫水機循環(huán)處理中丟失。改進(jìn)后每個標(biāo)本框中的包埋盒數(shù)量不超過規(guī)定數(shù)量,否則組織間會互相擁擠重疊,影響試劑完全浸沒組織。包埋盒太緊會帶出來少量前1缸試劑,其與下1缸試劑混合,影響脫水。一般情況下標(biāo)本框容納135個大孔包埋盒或細(xì)針小孔包埋盒165個,這樣保證了每1個組織完全浸沒,提高了固定效果。

組織脫水是用脫水劑將固定組織內(nèi)的水分逐漸置換出來,便于透明劑和石蠟的滲入,酒精是最常用的脫水劑,且酒精濃度對脫水質(zhì)量影響最為明顯。高濃度的酒精會使蛋白質(zhì)凝固,組織表面變硬,致使酒精無法浸到組織深處;低濃度酒精不能把組織內(nèi)的水分充分置換,組織太軟,蠟塊中心容易出現(xiàn)凹陷,影響制片,所以選用梯度酒精進(jìn)行組織脫水,避免了一刀切的現(xiàn)象。改進(jìn)后的脫水流程首先從低體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精溶液開始,然后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為85%酒精、2缸體積分?jǐn)?shù)為95%酒精、3缸體積分?jǐn)?shù)為100%酒精,使組織內(nèi)的水分脫除干凈有利于二甲苯進(jìn)入透明。同時組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)也存在于酒精中,減弱酒精脫水效果。所以檢測每次脫水后第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的濃度,并肉眼觀察試劑是否渾濁,以便及時更換試劑,更好發(fā)揮脫水機的應(yīng)用。改進(jìn)后的脫水流程中發(fā)現(xiàn)在試劑大換時,在第8缸新更換的體積分?jǐn)?shù)為100%酒精里加入1～2 g的水溶性伊紅[6-7],組織標(biāo)本內(nèi)的水分經(jīng)過梯度酒精脫水,會逐漸置換出來,溶液內(nèi)的伊紅就會浸染進(jìn)去,組織標(biāo)本變成紅色,這樣組織與石蠟、異物在包埋時能直觀辨別出來,對于活檢及內(nèi)鏡小標(biāo)本也更容易區(qū)分,提高組織包埋效率。

二甲苯是常用的透明劑,改進(jìn)脫水程序后組織在二甲苯要過夜處理,中間不需加壓、攪拌,時間不宜超過60 min,透明時間過長,組織容易變硬脆,制片困難。2種脫水程序透明時間不同,程序選擇要正確,這樣組織透明才充分。浸蠟是透明后的組織在熔化的石蠟中浸漬,使石蠟充分滲入組織內(nèi)。櫻花石蠟的熔點60～62 ℃,浸蠟的溫度應(yīng)稍高于石蠟熔點,以63 ℃為佳。改進(jìn)后的脫水程序設(shè)立4個蠟缸,因為第1缸石蠟含少量二甲苯,二甲苯會造成組織硬脆,影響制片,組織標(biāo)本在第1缸石蠟中停留時間稍短,第2～4個蠟缸可以讓組織充分浸蠟,如果偶爾當(dāng)天脫水機運行太晚,影響第2天包埋,也可以當(dāng)脫水程序運行到第4缸蠟時提前20 min終止程序,實踐證明也不影響包埋質(zhì)量及制片效果。

脫水機程序改進(jìn)前單憑試劑使用的時間來更換試劑,不能保證酒精梯度脫水,固定液的效果也大大減弱。改進(jìn)后的試劑是否需要更換[8],不再僅憑試劑使用時間和次數(shù)或蠟塊登記數(shù)量等其中一種因素決定,因為每日處理的標(biāo)本數(shù)量[9]、標(biāo)本組織大小對試劑濃度下降的影響程度都不確定。在日常工作中,通過檢測酒精濃度,發(fā)現(xiàn)了每缸酒精濃度在每個試劑更換周期內(nèi)的變化規(guī)律,并且酒精濃度的變化規(guī)律和累積處理組織蠟塊數(shù)量有一定的關(guān)聯(lián),特別是第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的濃度變化有明顯的一致性,所以工作人員以第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精濃度為指標(biāo),而且體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的濃度很容易測量,使用酒精比重計即可。

當(dāng)酒精比重計檢測第2缸酒精體積分?jǐn)?shù)本應(yīng)為75%卻低于62%,常規(guī)程序處理手術(shù)大標(biāo)本累積850個左右或小標(biāo)本程序處理小標(biāo)本累積450個左右時,同時固定液40 g·L-1的多聚甲醛出現(xiàn)渾濁沉淀,組織經(jīng)脫水處理后如出現(xiàn)制片困難,同時鏡下染色不鮮艷,達(dá)不到優(yōu)質(zhì)切片時,脫水機小換;第2缸酒精體積分?jǐn)?shù)本應(yīng)為75%卻低于62%,脫水機處理大標(biāo)本為1 750個左右或小標(biāo)本850個左右時,40 g·L-1的多聚甲醛固定液出現(xiàn)渾濁沉淀,組織經(jīng)脫水處理后制片困難,同時鏡下染色結(jié)構(gòu)不清晰,達(dá)不到優(yōu)質(zhì)切片,脫水機大換。每次更換試劑不像之前簡單的采用滾動更換試劑的方法[10],而是在脫水機2次大換之間,進(jìn)行1次脫水機小換,既保證了脫水的質(zhì)量,又減少了試劑的浪費。試劑是否需要更換,何時更換,需要脫水機大換還是脫水機小換,不僅以脫水機處理標(biāo)本量作為參考指標(biāo),還要根據(jù)第2缸體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的濃度來衡量,特別在節(jié)假日期間處理蠟塊的累積數(shù)量即使達(dá)不到試劑更換指標(biāo),但時間間隔太長,效果也會下降,所以通常是綜合考慮更換試劑。很多細(xì)節(jié)會影響脫水的質(zhì)量以至影響制片,所以科室也建立了規(guī)范的脫水流程。技術(shù)員每次上機前檢查試劑液面是否到位,試劑順序是否正確,試劑有無污染,試劑缸是否連接緊密,脫水機使用登記表和脫水機試劑更換登記表是否登記,以便更好地發(fā)揮脫水機的優(yōu)勢。

脫水機長期于固定液及脫水劑的環(huán)境中工作,極易產(chǎn)生雜質(zhì)附著在管道中,而這些雜質(zhì)如未及時清理,不僅影響脫水機處理效力,也較易對機器本身造成損害[11]。脫水機脫水程序運行結(jié)束后,應(yīng)用紗布將脫水缸中處于熔融狀態(tài)的蠟擦拭干凈,脫水缸底部有1個過濾漏孔,應(yīng)將過濾器漏孔上附著的雜質(zhì)及脫水缸密封圈上殘留過多石蠟清除。待把脫水機擦拭干凈后將標(biāo)本框置入脫水機內(nèi)隨脫水機走清洗程序一起清洗72 min。若標(biāo)本框未經(jīng)清洗進(jìn)入脫水程序容易堵塞管道,組織脫水不佳,影響制片,所以每次脫水程序運行前一定檢查機器和標(biāo)本框是否清洗,以免影響組織脫水效果。

綜上,通過對全自動密閉式組織脫水機的應(yīng)用探討,病理技術(shù)人員總結(jié)出一套適合于本科室的脫水流程,充分利用脫水機的優(yōu)勢,制作高質(zhì)量的病理切片,滿足病理診斷及臨床的需要。