兒童侵襲性流感嗜血桿菌的臨床特征及血清型和耐藥性

聶曼杰,孫曹瑋,周娟娟,高凱杰

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院,檢驗(yàn)科/鄭州市兒童感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450000)

侵襲性流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)定義為從無(wú)菌體液分離出來(lái)的,可侵入血流引起敗血癥、化膿性腦膜炎、肺炎和化膿性骨關(guān)節(jié)炎等侵襲性感染,患者病情重、進(jìn)展快、病死率高[1]。非b型Hi血清型和不可分型流感嗜血桿菌(non-typeable Hi,NTHi)在臨床感染中檢出率逐漸升高[2],對(duì)抗菌藥物日益耐藥[3],主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶以及fts基因突變。本研究分析臨床分離得到的侵襲性Hi的莢膜血清分型、產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶表型以及抗菌藥物耐藥特點(diǎn),深入了解并監(jiān)測(cè)本地區(qū)兒童感染侵襲性Hi的動(dòng)態(tài),為新疫苗的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù),提高臨床對(duì)Hi侵襲性感染的重視。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源回顧性研究2016年1月至2022年1月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院患兒無(wú)菌部位(血液、腦脊液、胸腹水、骨髓液等)感染Hi的病例,分析其分離菌株;每位患兒取1株分離株,對(duì)于多部位感染的患兒,優(yōu)先選擇來(lái)自腦脊液或胸腹水的分離株[4]。

1.2 儀器與試劑Bact/ALERT 3D血培養(yǎng)儀(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)、Vitek2-Compact微生物鑒定藥敏分析儀(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)、MALDI-TOF Biotyper質(zhì)譜儀[布魯克(北京)科技有限公司]。莢膜分型血清(丹麥SSI Diagnostica公司)、萬(wàn)古霉素巧克力瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景微生物科技有限公司)、HTM培養(yǎng)基(廣州迪景微生物科技有限公司)、E-test條(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)、藥敏紙片(英國(guó)OXID公司)。

1.3 方法

1.3.1臨床資料分析 記錄并分析患兒的體溫、白細(xì)胞、降鈣素原(procalcitonin,PCT)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果以及抗菌治療效果。

1.3.2細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]要求接種到添加萬(wàn)古霉素的巧克力培養(yǎng)基,置35 ℃培養(yǎng)18～24 h,根據(jù)菌落特點(diǎn)和顯微鏡檢查結(jié)果,挑取光滑濕潤(rùn)、呈灰白半透明或無(wú)色透明的菌落,鏡檢為革蘭陰性的小桿菌,用生物質(zhì)譜儀MALDI-TOF Biotyper進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株Hi ATCC 49247購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生與健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.3.3藥敏試驗(yàn) 采用E-test方法檢測(cè)Hi對(duì)氨芐西林的最小抑菌濃度,應(yīng)用K-B紙片法檢測(cè)其對(duì)氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、阿奇霉素、美羅培南、左氧氟沙星等藥物的敏感性。結(jié)果判讀依據(jù)2018年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)文件藥敏標(biāo)準(zhǔn)[6]。用頭孢硝噻吩紙片顯色法試驗(yàn)定性檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶,用金黃色葡萄球菌ATCC29213作為陽(yáng)性對(duì)照,質(zhì)控菌株Hi ATCC 49247購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生與健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.3.4莢膜血清學(xué)分型 用Hi多價(jià)血清(a、b、c、d、e、f)型和b型血清通過(guò)乳膠凝集法對(duì)純化后的侵襲性Hi進(jìn)行血清學(xué)分型,產(chǎn)生凝集反應(yīng)為陽(yáng)性。同時(shí)用9 g·L-1的氯化鈉溶液作為對(duì)照,注意是否存在自凝集菌株。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用WHO細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)提供的WHONET 5.6版本軟件進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析,計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(n)和百分比(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料2016—2022年確診侵襲性Hi的例數(shù)分別為2、5、8、12、2、2、2例;1—12月例數(shù)分別為5、4、0、3、1、4、0、4、3、4、3、2例。33例患兒中血液、腦脊液和骨髓液中同時(shí)檢出2例,血液和腦脊液同時(shí)檢出9例,血液、腦脊液、腹水和胸腔積液分別檢出17、2、2、1例。33例患兒中5例檢出2種及以上細(xì)菌;11例患有基礎(chǔ)疾病(3例頭顱外傷、3例白血病、2例早產(chǎn)兒、1例急性闌尾炎伴穿孔、1例慢性腎病、1例先天性心臟病);最小年齡為1日齡,最大年齡為9歲;1例患兒體溫正常(早產(chǎn)兒血流感染)。2例腹腔感染分別為慢性腎臟病5期在腹膜透析時(shí)感染和急性闌尾炎引起感染,1例胸腔積液感染因外傷致急性呼吸衰竭全身免疫力低下所致。32例患兒發(fā)熱,31例患兒接受了PCT檢查,16例患兒白細(xì)胞異常,22例患兒出現(xiàn)并發(fā)癥。具體見(jiàn)表1。

表1 侵襲性Hi感染患兒的一般資料

2.2 藥敏試驗(yàn)及β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)最初鑒定出46株侵襲性Hi(來(lái)自血液28株、腦脊液13株、骨髓液2株、腹水2株、胸腔積液1株),排除了13株重復(fù)分離株,排除因死亡或自動(dòng)出院未做藥敏試驗(yàn)的4例患兒,共對(duì)29株侵襲性Hi進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析(表2)。另阿奇霉素和美羅培南敏感率為44.8%(13/29)和96.6%(28/29),在β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性中敏感率分別為26.3%(5/19)和94.7%(18/19),在β-內(nèi)酰胺酶陰性中則全部非敏感。環(huán)丙沙星為喹諾酮類抗生素,考慮到兒童安全用藥,故不推薦臨床首選用藥;三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)和美羅培南敏感率高,可為臨床首選用藥。

表2 29株侵襲性Hi對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物敏感性

2.3 Hi莢膜分型用莢膜血清對(duì)29株侵襲性Hi菌株采用乳膠凝集法進(jìn)行分型,與b型血清和多價(jià)血清均無(wú)凝集反應(yīng),29株菌株全部為NTHi。

2.4 治療及轉(zhuǎn)歸針對(duì)29例有藥敏結(jié)果的患兒,其中16例(55.2%)應(yīng)用單一抗菌藥物治療(包括三代頭孢12例、亞胺培南2例、美羅培南1例、阿奇霉素1例);10例(34.5%)聯(lián)合應(yīng)用2類抗菌藥物治療(包括碳青霉烯類聯(lián)合頭孢菌素4例,頭孢菌素聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類、碳青霉烯類聯(lián)合萬(wàn)古霉素、碳青霉烯類聯(lián)合氯霉素類、頭孢菌素聯(lián)合萬(wàn)古霉素、碳青霉烯類聯(lián)合青霉素類、頭孢菌素聯(lián)合青霉素類各1例);3例(10.3%)在病程中先后使用3種及以上抗菌藥物治療(主要為頭孢菌素、碳青霉烯類、萬(wàn)古霉素和青霉素類聯(lián)合應(yīng)用)。臨床治療中根據(jù)藥敏結(jié)果調(diào)整用藥,27例(93.1%)患兒治愈或好轉(zhuǎn)出院,2例(6.9%)死亡或自動(dòng)出院后死亡,為嚴(yán)重外傷或感染的重癥患兒,病程中均使用3種以上抗菌藥物治療。

3 討論

Hi感染主要累及5歲以下尤其是1歲以下患兒[7],本研究中<1歲嬰兒和3～6歲學(xué)齡前兒童易感染侵襲性Hi,嬰兒免疫功能發(fā)育不完善和學(xué)齡前兒童接觸環(huán)境復(fù)雜等因素為其主要易感原因。研究期間兒童侵襲性Hi發(fā)病率在2016—2019年逐漸升高,全年均可發(fā)病,無(wú)明顯季節(jié)性,與其他研究結(jié)果[8]基本一致,但在2020年和2021年有明顯下降趨勢(shì),這可能與新型冠狀病毒大流行背景下,各種防疫措施加強(qiáng)有關(guān)。本研究中11例有基礎(chǔ)疾病,主要為外傷、免疫力低下及先天性疾病,這些因素都為Hi入侵提供了基礎(chǔ)。臨床實(shí)踐中應(yīng)積極采取措施防治?；純阂虬籽』?、血液透析等致免疫力降低,Hi由定植部位入侵無(wú)菌部位引起感染,考慮為院內(nèi)感染,應(yīng)高度警惕此類機(jī)會(huì)致病菌的侵襲性感染。

Hi侵入人體,引發(fā)炎癥反應(yīng),體溫升高,所以發(fā)熱為患者的最主要臨床表現(xiàn),多數(shù)患者的CRP、PCT等炎癥標(biāo)志物水平升高。本研究中患兒高熱及超高熱較多,但白細(xì)胞、細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)無(wú)明顯升高,與其他研究[8]不完全相同,這為患兒診治造成干擾。Hi侵襲性感染易引起敗血癥、化膿性腦膜炎等[9],本研究中血流感染及化膿性腦膜炎占比分別為84.8%(28/33)、39.4%(13/33)。

氨芐西林等β-內(nèi)酰胺酶類藥物既往被認(rèn)為主要的抗Hi藥物[10],但近年來(lái)耐藥率持續(xù)升高[11-12],本研究中侵襲性Hi對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林耐藥率分別達(dá)86.2%、79.3%,侵襲性Hi中65.5%β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性,高于其他研究[8,13]結(jié)果及本實(shí)驗(yàn)室之前的研究[14]結(jié)果,對(duì)侵襲性感染患兒救治提出了較大挑戰(zhàn)。根據(jù)最新美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)藥敏試驗(yàn)規(guī)范,流感嗜血桿菌對(duì)阿奇霉素和美羅培南只有敏感折點(diǎn),高于敏感折點(diǎn)的無(wú)法區(qū)分耐藥或中介故只能按照“非敏感”報(bào)告及統(tǒng)計(jì)。侵襲性Hi對(duì)阿奇霉素非敏感率達(dá)到55.2%,證實(shí)大環(huán)內(nèi)酯類藥物不宜作為治療Hi感染的經(jīng)驗(yàn)用藥;對(duì)三代頭孢、美羅培南的敏感率高,重癥患兒可經(jīng)驗(yàn)性選用。其中1例患兒,前期用美羅培南及萬(wàn)古霉素抗感染,后根據(jù)血培養(yǎng)雙瓶為Hi且對(duì)三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)及美羅培南為非敏感,僅對(duì)氯霉素及環(huán)丙沙星敏感,請(qǐng)臨床藥師會(huì)診后考慮感染嚴(yán)重。環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類抗生素,出于安全性考慮,喹諾酮類藥物在兒童中的應(yīng)用比較謹(jǐn)慎。美國(guó)FDA(食品與藥物管理局)批準(zhǔn)的、兒童中氟喹諾酮類適應(yīng)證包括:治療有并發(fā)癥的尿路感染和腎盂腎炎,以及預(yù)防和治療吸入性炭疽。臨床實(shí)際應(yīng)用中,在充分評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)和獲益的情況下,針對(duì)重癥感染、耐多藥病原菌感染等可酌情使用[15-16]。因此,會(huì)診后給予患兒氯霉素聯(lián)合超廣譜抗生素美羅培南(碳青霉烯類)抵抗感染,療效良好,血培養(yǎng)Hi為陰性,后因病情嚴(yán)重心搏驟停死亡。本研究中大部分患兒應(yīng)用Hi敏感抗生素(三代頭孢、碳青霉烯類等)治療,但抗生素使用種類較多,多種抗菌藥物聯(lián)合用藥不夠合理,如碳青霉烯類或頭孢菌素聯(lián)合青霉素類較多,部分患兒藥敏結(jié)果明確后未及時(shí)調(diào)整用藥,雖與侵襲性感染患兒情況危重有關(guān),但仍需進(jìn)一步提高抗菌藥物合理應(yīng)用。研究中侵襲性Hi對(duì)三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)和美羅培南的耐藥率低、敏感率高,可以考慮作為臨床首選藥物。

有研究顯示107株Hi中67.3% β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性,90.9% NTHi,9.3% β-內(nèi)酰胺酶陰性對(duì)氨芐西林耐藥[17]。四川一項(xiàng)研究表明19株試驗(yàn)菌都是NTHi[18],由于基因水平轉(zhuǎn)移,期相變換,噬菌體等作用,NTHi已擁有了侵襲性莢膜型b型Hi的相關(guān)毒力因子,且致病力比b型Hi疫苗投入使用前更強(qiáng)[19]。而此次研究的29株侵襲性Hi均為NTHi,40.0% β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥,耐藥性強(qiáng),應(yīng)該引起重視。β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株對(duì)抗生素耐藥性普遍高于β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株,表明侵襲性Hi對(duì)抗生素耐藥主要是由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而引起。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶菌株對(duì)氨芐西林和阿奇霉素耐藥性高于非產(chǎn)酶菌株,但跟李靜等[20]的研究結(jié)果有出入,考慮與標(biāo)本類型以及數(shù)量的差異有關(guān)。40.0%侵襲性Hi為β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株,多由細(xì)胞壁青霉素結(jié)合蛋白3編碼基因ftsI突變導(dǎo)致[21]。少數(shù)情況下,有莢膜菌株為適應(yīng)環(huán)境會(huì)停止生成莢膜,故單純血清分型會(huì)被誤判為NTHi[7],需更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡M(jìn)行莢膜基因檢測(cè)。

本研究下一步將收集菌株,擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序,明確耐藥基因的類型及ftsI基因是否有氨基酸置換,結(jié)合基因測(cè)序結(jié)果綜合分析菌株的同源性以及之間的聯(lián)系,進(jìn)一步了解并監(jiān)測(cè)本地區(qū)兒童侵襲性Hi的流行病學(xué)、耐藥機(jī)制、基因突變?cè)谀退幹械挠绊?為新疫苗的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。