藍(lán)孔雀腸道菌群中整合子及其水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性

陶芬，張饒，廖琦，李芬仙，劉壘成，姜玉莎，苗睿，吳培福

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明，650224；2.云南野生動(dòng)物園，昆明，650225）

在過去的幾十年里，抗生素廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的疾病預(yù)防、治療與促進(jìn)生長(zhǎng)，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)抗生素的耐藥性也越來越重視。細(xì)菌耐藥性的傳播在很大程度上是由水平基因轉(zhuǎn)移引起的，耐藥基因常通過某些遺傳元件（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子）傳遞。整合子能夠捕獲并表達(dá)外源基因，可將耐藥基因整合到移動(dòng)元件中，在耐藥基因的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，是衡量耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要指標(biāo)。抗生素的使用對(duì)人和動(dòng)物腸道微生物群的組成有很大影響，越來越多的學(xué)者［1?2］關(guān)注腸道微生物群這一天然的耐藥基因庫(kù)、水平基因轉(zhuǎn)移樞紐［3］，為細(xì)菌耐藥性的發(fā)展提供了一個(gè)良好的平臺(tái)，故腸道菌群中整合子及基因盒攜帶情況的分析在水平基因轉(zhuǎn)移中具有重大意義。

藍(lán)孔雀（Pavo cristatus）是一種極具觀賞性的鳥類，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于藍(lán)孔雀疾病的研究主要集中在寄生蟲方面，包括球蟲?。??5］、絳蟲病、線蟲病和組織滴蟲?。?］，尚未見關(guān)于藍(lán)孔雀整合子、基因盒的相關(guān)分析報(bào)道。動(dòng)物園作為科普宣傳基地，具有物種繁多、人員復(fù)雜和流動(dòng)性大等特點(diǎn)，其細(xì)菌耐藥性的防控對(duì)公共衛(wèi)生安全具有重大意義。本研究以動(dòng)物園藍(lán)孔雀糞便為材料，提取菌群基因組DNA，檢測(cè)臨床分離株中常見整合子、基因盒的流行情況，并對(duì)其進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移分析，以期為細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移研究和藍(lán)孔雀疾病防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

以昆明市2 個(gè)動(dòng)物園的藍(lán)孔雀糞便為研究樣品，其中1～120 號(hào)采集于云南野生動(dòng)物園（相應(yīng)的基因盒編號(hào)為H1～H120），121～139 號(hào)采集于圓通山動(dòng)物園，共計(jì)139 份樣品。樣品采集原則：（1）被采樣藍(lán)孔雀近期未使用抗生素。（2）在早晨清理藍(lán)孔雀糞便前采集新鮮糞便，保證樣品無明顯的雜質(zhì)污染。（3）盡量無菌采集，用高壓滅菌的50 mL 離心管收集樣品，1 個(gè)樣品裝1 個(gè)離心管。（4）原則上采集不同藍(lán)孔雀?jìng)€(gè)體糞便，但動(dòng)物園藍(lán)孔雀為散養(yǎng)模式，無法做到糞便與個(gè)體的統(tǒng)一定位，故采用分散樣地采樣法，即在藍(lán)孔雀活動(dòng)的不同區(qū)域內(nèi)采集，在一定程度上避免同一個(gè)體重復(fù)采樣。（5）采集成形的、代表藍(lán)孔雀?jìng)€(gè)體的糞便，不采集混合糞便。（6）樣品采集后即時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室，?20 ℃保存?zhèn)溆?。在同一時(shí)間段采集2 個(gè)動(dòng)物園的藍(lán)孔雀糞便樣品，在采樣期間，由于圓通山動(dòng)物園中游客量較大，導(dǎo)致藍(lán)孔雀糞便被反復(fù)踩踏，且數(shù)量較少，遵循采樣原則，僅采集到19 份樣品。

1.2 宏基因組提取

參考已有研究方法［7?9］，采用蛋白酶K-CTAB-酚氯仿法提取樣品中菌群宏基因組DNA。提取過程：用丙酮、PBS 緩沖液預(yù)處理樣品，采用差速離心法去除樣品中的雜質(zhì)，吸取懸浮液，離心后收集沉淀，用蛋白酶K 和溶菌酶消化細(xì)菌，最后采用酚氯仿法純化DNA。

1.3 整合子檢測(cè)

引物參考Su等［10］研究，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）?？偡磻?yīng)體系25.0 μL，其中上 游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶1.0 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，牛血清白蛋白（BSA）0.1 μL，ddH2O 為15.4 μL。3 類整合子（I類、Ⅱ類和Ⅲ類，即intI1、intI2和intI3）反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。Ⅰ類整合子基因盒擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。配置1%瓊脂糖凝膠，吸取5 μL PCR 產(chǎn)物加入凝膠孔內(nèi)，在電泳儀（120 V）上電泳30 min。觀察PCR 產(chǎn)物大小，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 用于擴(kuò)增3類整合子的引物Tab.1 The primers used in amplifying three types of integrons

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，分別選取整合子及基因盒的PCR 產(chǎn)物，送往上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序，每類整合子各選取2 個(gè)樣本PCR 產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類和Ⅲ類攜帶的基因盒較少，且有的基因盒較大，普通實(shí)驗(yàn)條件無法擴(kuò)增，Ⅰ類整合子基因盒有多種不同大小的PCR 擴(kuò)增片段，最小片段約為400 bp，最大片段約為2 900 bp，考慮到蛋白編碼基因和耐藥基因的平均大小，僅研究750 bp及以上的擴(kuò)增片段，并對(duì)電泳中較亮的片段進(jìn)行測(cè)序。小片段可能為空整合子，空整合子一般不攜帶耐藥基因，但存在再次整合可移動(dòng)耐藥基因的可能性。

下載NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)及其注釋，比對(duì)所測(cè)序列和數(shù)據(jù)庫(kù)細(xì)菌基因組，找出含95%以上相似性片段的細(xì)菌基因組，查看相似片段上、下游5 kb側(cè)翼區(qū)序列，如有整合酶/重組酶、轉(zhuǎn)座子等關(guān)鍵基因，則可認(rèn)為該基因盒具有水平轉(zhuǎn)移的可能性。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2016 整理和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Chromas 軟件查看測(cè)序結(jié)果。仔細(xì)比對(duì)上、下游引物，選取測(cè)序結(jié)果一致的序列片段，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST程序搜索分析測(cè)序片段的同源性，并用Excel 2016、AI 軟件和R軟件包進(jìn)行相應(yīng)的繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 整合子流行特征

所有樣品中，intI1、intI2和intI3檢出率分別為86.33%、69.78%和11.51%。圖1 展示了云南野生動(dòng)物園和圓通山動(dòng)物園樣品中整合子流行分布特征，intI1和intI2具有相似的分布特征，而intI3在2個(gè)動(dòng)物園間存在差異（圓通山動(dòng)物園樣品中未發(fā)現(xiàn)intI3）。

圖1 3類整合子的分布特征Fig.1 The distribution patterns of three types of integrons

2.2 樣品基因盒擴(kuò)增特征

從樣品中擴(kuò)增出不同大小或類別的Ⅰ類整合子基因盒條帶，考慮到基因平均大小，只統(tǒng)計(jì)750 bp以上的條帶類型（其余小片段見表2）。擴(kuò)增的條帶共有18種，片段大小為750～2 900 bp。每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)共有7種類型（圖2 左上角），共發(fā)現(xiàn)51種不同大小條帶的組合模式（圖2）。從樣品來源看，云南野生動(dòng)物園與圓通山動(dòng)物園樣品基因盒擴(kuò)增模式無明顯區(qū)別，即圓通山動(dòng)物園樣品組合模式分散于云南野生動(dòng)物園的樣品中，但2 條最大擴(kuò)增條帶 2 900 bp均來自圓通山動(dòng)物園的樣品中。

表2 Ⅰ類整合子小片段基因盒統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of integron Ⅰ small fragment gene cassettes

圖2 樣品基因盒的擴(kuò)增模式Fig.2 The PCR patterns of sample integrons

2.3 Ⅰ類整合子基因盒測(cè)序結(jié)果

從Ⅰ類整合子基因盒的擴(kuò)增結(jié)果中隨機(jī)選取條帶較亮且引物二聚體較少的樣品（均為云南野生動(dòng)物園），即7 個(gè)基因盒樣品（H12、H16、H22、H26、H27、H56、H78）進(jìn)行測(cè)序，其中H12和H22樣品基因盒為aadA2基因，H16 和H56 樣品基因盒為aadA1基因，H26 和H27 樣品基因盒為dfrA27基因，H78 樣品基因盒結(jié)構(gòu)分析表明，該基因盒包含aadA2閱讀框、移碼突變的截短基因aac（6'）-Ib片段和arr閱讀框，其中aadA2閱讀框具有與H22一致結(jié)構(gòu)。

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各基因盒序列與腸桿菌科（Enterobacteraceae）的多種細(xì)菌質(zhì)粒和染色體上序列片段有很高的同源性，如大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）等，這些菌株來自不同的動(dòng)物宿主、國(guó)家與分離樣品。部分基因盒相似序列具有共同的菌株來源，H12、H16 和H56 樣品基因盒具有相似序列，H22 和H78、H26和H27具有相似序列（表3）。

表3 各基因盒的共同相似序列（NCBI比對(duì)）Tab.3 The common similarity sequence of each gene cassette（NCBI alignment）

2.4 基因盒水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性

雖然在基因盒測(cè)序結(jié)果中對(duì)序列相似性進(jìn)行了BLAST 比對(duì)分析，并在一定程度上反映了樣品基因盒在不同環(huán)境、菌種、宿主和國(guó)家的分布廣泛性，即整合子基因盒會(huì)在不同環(huán)境、菌種、宿主和國(guó)家間發(fā)生傳播，但上述分析結(jié)果只展示了部分情況，不能在所有菌門、屬或種的水平上反映基因盒分布偏向性或水平轉(zhuǎn)移宿主偏向性，也不能反映基因盒在不同宿主、環(huán)境和國(guó)家分布偏向性。耐藥基因傳播有垂直傳播和水平傳播，水平傳播對(duì)人和動(dòng)物的健康會(huì)造成巨大危害，故本研究從染色體基因組、質(zhì)粒、噬菌體和微生物組角度來分析樣品基因盒與水平轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

2.4.1 基于染色體、質(zhì)粒基因組的相關(guān)性

利用染色體、質(zhì)?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)分析，其中染色體基因組有95 175 個(gè)，質(zhì)?；蚪M有 34 678 個(gè)，經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與H16 和H56 基因盒（aadA1）、H12 和H22 基因盒（aadA2）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門（Proteobacteria）（占絕大多數(shù)）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Acti?nobacteria），但aadA1、aadA2水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌 門中；與H26 和H27基因盒（dfrA27）、H78（aadA2、aac（6'）-Ib、arr）相似性較高的序列片段主要源自變形菌門和放線菌門，且該基因水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門的細(xì)菌間，也見于放線菌門的細(xì)菌間。由此可見，7個(gè)基因盒的水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門的細(xì)菌中，且具有共同的菌株來源（圖3），其中銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌（Salmonella enterica）與所有基因盒間均存在水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性，說明了藍(lán)孔雀腸道菌群中耐藥基因主要由這幾類細(xì)菌傳播。

圖3 基因盒與染色體、質(zhì)?；蚪M的水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性Fig.3 Correlation analysis of horizontal transfer of gene cassette in chromosome and plasmid genome

2.4.2 基于微生物、臨床基因組的相關(guān)性

在整合微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄有154 974個(gè)宏基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與環(huán)境和工程相關(guān)的環(huán)境中，共篩選到120 個(gè)宏基因組數(shù)據(jù)；臨床基因組中，共篩選到192 株具有明顯臨床分離株標(biāo)注特征的基因組數(shù)據(jù)。由表4 可知，即使是不同來源（環(huán)境、臨床）的樣品（基于NCBI 比對(duì)）均可進(jìn)行耐藥基因的傳遞，說明耐藥基因的跨界傳播；在不同宿主細(xì)菌中肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌是各基因組中傳遞耐藥性的主要細(xì)菌，充分說明了這些細(xì)菌在水平基因轉(zhuǎn)移中的重要性。

表4 基于環(huán)境基因組與臨床基因組的水平轉(zhuǎn)移相關(guān)性Tab.4 Horizontal transfer correlation analysis based on environmental genome and clinical genome

2.4.3 基于噬菌體基因組的相關(guān)性

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中，病毒基因組共有11 545 個(gè)，其中涉及細(xì)菌的噬菌體基因組有4 183個(gè)。同上，下載病毒基因組數(shù)據(jù)，并與測(cè)序序列比對(duì)，但噬菌體基因組中沒有與本研究序列相似的片段，說明基因盒基因的水平傳播主要借助質(zhì)粒、整合子和插入元件等可移動(dòng)元件。

3 討論

3.1 整合子及基因盒流行特征

本研 究中，intI1、intI2和intI3檢出率 分別為86.33%、69.78% 和11.51%，均與各基因流行情況［11］保持一致，但又有所不同。馮濤［12］在狐源大腸桿菌分離株中得到的intI1和intI2檢出率分別為62.77%和13.56%，intI3未檢出；王東陽等［13］對(duì)貉源大腸桿菌整合子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)intI1檢出率為72.00%，intI2為9.33%，未檢出intI3，而本研究中3類整合子基因檢出率都較高。在大部分研究中，Ⅱ類整合子常攜帶dfrA1、sat2和aadA1，與Ⅰ類整合子相似；Ⅲ類整合子常攜帶β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類耐藥基因，但該型整合子較為少見［14］。本試驗(yàn)中Ⅱ、Ⅲ類整合子都存在較高的檢出率，一方面說明宏基因組DNA 中檢出率高于單菌株，另一方面說明動(dòng)物園中藍(lán)孔雀種群存在較高耐藥性及耐藥基因轉(zhuǎn)移可能性。

Ⅰ類整合子是廣泛分布于臨床和環(huán)境中的細(xì)菌遺傳元件，尤其在革蘭氏陰性菌中［15］，細(xì)菌的耐藥譜主要受其影響［16?17］，故研究檢測(cè)了其攜帶的基因盒。結(jié)果顯示基因盒主要為氨基糖苷類和甲氧芐啶類耐藥基因，這2 類基因盒常在分離株中被檢測(cè)到［18］。Ⅰ類整合子基因盒組合形式有較高的多樣性［19?20］，在本研究中主要表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度條帶組合的多種譜型，組合形式共計(jì)51種，反應(yīng)了藍(lán)孔雀種群潛在多重耐藥的復(fù)雜性。

3.2 樣品基因盒結(jié)構(gòu)特征及水平轉(zhuǎn)移特性

本研究中，基因盒的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)7 個(gè)樣品均攜帶與水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，且具有完整的基因結(jié)構(gòu)（兩端保守區(qū)域及中間可變區(qū)），因此，這些基因盒具有水平轉(zhuǎn)移的可能性。目前，有研究表征細(xì)菌中Ⅰ類整合子攜帶基因盒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的過程，如陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、沙門氏菌和大腸埃希氏桿菌［11，21?22］，Yu等［11］研究中表征了Ⅰ類整合子攜帶不同類別的基因盒，并驗(yàn)證了其接合轉(zhuǎn)移的能力，進(jìn)一步說明了本研究中基因盒水平轉(zhuǎn)移特性，且這些基因水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在變形菌門中，這與大多數(shù)研究結(jié)果保持一致，如Zhao等［23］研究顯示CTX-M等位基因通過水平轉(zhuǎn)移在臨床大腸埃希氏桿菌和克雷伯氏菌中廣泛傳播，Zheng等［24］將臨床分離株中具ESBL基因（blaOXA-48、blaNDM-1、blaKPC-2和blaSHV-1）的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室大腸埃希氏桿菌中。

在不同基因組數(shù)據(jù)中，7個(gè)樣品基因盒具有相似（>95%）的來源，包括宿主、菌種、分離株和國(guó)家，說明耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的普遍性及全球性，這些片段均具備水平基因轉(zhuǎn)移特征（具整合酶、完整的基因結(jié)構(gòu)等），基因盒可在動(dòng)物、人與環(huán)境之間傳播，與霍瑋［25］的研究結(jié)果保持一致，霍瑋在動(dòng)物園靈長(zhǎng)類（Primates）動(dòng)物活動(dòng)區(qū)域與飼養(yǎng)員體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1基因的大腸埃希氏桿菌分離株（但未證實(shí)來源是飼養(yǎng)員還是環(huán)境）。另外，基因盒相似片段的來源覆蓋世界各地，耐藥基因水平轉(zhuǎn)移具全球性［26］，基因盒主要通過質(zhì)粒傳播，耐藥性轉(zhuǎn)移具廣泛性，其宿主細(xì)菌主要有肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌等，這些細(xì)菌也是臨床檢測(cè)中出現(xiàn)最多的病原菌，表明這些細(xì)菌是耐藥基因的重要來源。

3.3 腸道菌群中宏基因組DNA研究

試驗(yàn)通常通過培養(yǎng)的方法擴(kuò)增單菌株中的耐藥基因，然而約有80%腸道微生物是無法培養(yǎng)的。本研究方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，具有更高的檢測(cè)靈敏度，可檢測(cè)到更多非活菌中的耐藥基因，故直接采用PCR 檢測(cè)，結(jié)果會(huì)比培養(yǎng)之后的檢出率更高，這在本研究Ⅱ類、Ⅲ類整合子檢出率上得到體現(xiàn)。

綜上，Ⅰ類整合子流行性較高，攜帶有不同大小條帶的基因盒，并具水平轉(zhuǎn)移能力，動(dòng)物腸道中有密集的微生物群，發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移的可能性比預(yù)期還會(huì)更高，說明耐藥基因傳播的高風(fēng)險(xiǎn)性。此外，外界環(huán)境在耐藥基因的發(fā)展和傳播中起很大作用［27］，本研究中，與樣品序列相似性高的來源也包括環(huán)境，環(huán)境是耐藥基因的一個(gè)重要儲(chǔ)存場(chǎng)所。