華南虎源乳酸菌的分離篩選及體外益生特性

杜雪晴，陳武，李婉萍，邵慧婷，周妞，薩家祺，王晨，吳亞江，翟俊瓊，呂夢娜，單芬

（1.廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣州市生態(tài)園林科技協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州，510070；2.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州，510006）

華南虎（Panthera tigris amoyensis）是我國特有的虎亞種，數(shù)量稀少，國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物，目前華南虎在野外已接近滅絕［1?2］。在圈養(yǎng)華南虎的飼養(yǎng)管理中，由于近親繁殖、運(yùn)動量少及食物種類單一等原因，造成華南虎出現(xiàn)偏食、消化不良和胃腸炎等消化系統(tǒng)問題［2］。對于大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonellasp.）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等致病菌導(dǎo)致的華南虎胃腸道疾病，獸醫(yī)一般采用抗生素治療，但抗生 素的使用，會導(dǎo)致幼虎腸道菌群失調(diào)，代謝紊亂，發(fā)生胃腸炎、便秘、腹瀉和死亡等情況［1?2］，抗生素的使用還會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性及生態(tài)環(huán)境問題。據(jù)報(bào)道，在幼齡東北虎（Panthera tigris altaica）奶粉中添加乳酸菌素類或雙歧桿菌的活菌制劑，可調(diào)節(jié)胃腸道菌群、維持菌群的生態(tài)平衡，有效防治胃腸道疾?。?］。

乳酸菌作為益生菌被廣泛用于人和動物的飲食中，提高腸道消化吸收及機(jī)體非特異性免疫力。乳酸菌具有廣譜、高效、穩(wěn)定和安全的特點(diǎn)，通過產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)抑制病原菌的生長，加強(qiáng)宿主機(jī)體腸道微生物的屏障作用，從而提高動物的健康水平和抗病力［4?6］。目前關(guān)于野生動物益生菌的研究有大熊貓（Ailuropoda melano?leuca）［7］、川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）［8］和歐洲獾（Meles meles）等［9］，但市場上暫無專門針對野生動物的益生菌產(chǎn)品［5］，相關(guān)產(chǎn)品主要集中在人和畜禽，乳酸菌制劑質(zhì)量參差不齊，同源的乳酸菌對宿主發(fā)揮的作用最佳［10］。因此，本研究擬從健康華南虎糞便中分離篩選乳酸菌，對其分類鑒定，評價(jià)抑菌能力、耐酸和耐膽鹽性能、溶血性和抗生素耐藥性，以期篩選出具有潛在益生特性的乳酸菌，為開發(fā)適用于華南虎的益生菌制劑提供備選菌種。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集廣州動物園圈養(yǎng)健康華南虎的新鮮糞便 23 份，取1 g 新鮮樣品放入9 mL 滅菌生理鹽水中，振蕩搖勻后，取1 mL注入含MRS液體培養(yǎng)基的厭氧瓶內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)36 h。

1.2 材料與試劑

MRS 培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）和哥倫比亞血瓊脂平板均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；2.5 L 圓底立式厭氧袋、2.5 L 厭氧產(chǎn)氣包、牛津杯、牛膽鹽、鹽酸和PBS 均購自廣州翔博生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Mas?ter Mix 均采購自廣州維寧生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片由溫州市康泰生物科技有限公司生產(chǎn)。細(xì)菌16S rRNA 基因引物合成和測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

大腸埃希氏桿菌（GDMCC 1.180）、金黃色葡萄球菌（GDMCC 1.1220）和沙門氏菌（GDMCC 1.237）由廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）提供，遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）從廣州動物園鴻雁（Anser cygnoides）組織中分離。

1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺SW-CJ-1F 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌器，日本Hirayama公司；精密型pH 計(jì)，上海精密儀器有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；3-18KS臺式冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 乳酸菌分離純化

將裝有樣品的厭氧瓶培養(yǎng)36 h后得到的懸濁液按10 倍梯度稀釋，選取稀釋梯度為1×10-5、1×10-6和1×10-73種稀釋液涂布在改良MRS 固體培養(yǎng)基（含1%的CaCO3）上，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。初步觀察涂布平板的菌落形態(tài)特征，選擇生長有50～150 個(gè)單菌落的平板。再挑取涂布平板有溶鈣圈且外表比較光滑，顏色、大小、邊緣、表面隆起度和透明度等不同的單個(gè)菌落，在MRS 固體培養(yǎng)基上多次劃線分離，直至獲得菌落形態(tài)特征一致的純培養(yǎng)單菌。將分離純化出來的菌株用含體積分?jǐn)?shù)25%的甘油于?80 ℃冷凍保存。

1.4.2 乳酸菌鑒定

用DNA 試劑盒提取基因組，PCR 擴(kuò)增引物選用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）［11］進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（25.0 μL）：菌液模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，TaqPCR Master Mix 12.5 μL，去離子水10.5 μL。分別取PCR 產(chǎn)物5 μL 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，初步檢測PCR 擴(kuò)增是否合乎測序要求，符合要求的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4.3 具有抑菌活性乳酸菌菌株的篩選

采用牛津杯法進(jìn)行菌株代謝產(chǎn)物的抑菌性試驗(yàn)［10］，選擇大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和遲鈍愛德華氏菌4種致病菌作為指示菌。將活化后的菌液離心（12 000 r/min，5 min）得到菌 株的發(fā)酵上清。將4種指示菌培養(yǎng)物活化并稀釋至1×108cfu/mL后，按1%的添加量分別混合于NA瓊脂培養(yǎng)基中、傾注在預(yù)先豎立的3 個(gè)牛津杯的平板中。冷卻后拔掉牛津杯，向3 個(gè)牛津杯孔中加入200 μL待測菌株的發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次，挑選平均值大于15 mm的菌株。

1.4.4 菌株耐酸和耐膽鹽性能測定

參考程王琨等［5］的試驗(yàn)方法進(jìn)行耐酸和耐膽鹽性能測定。將乳酸菌活化2 代后，取1 mL 菌液離心棄上清，分別加入pH=2.5 和pH=3.0 的鹽酸溶液 1 mL，用PBS 作為對照，重懸后于37 ℃中培養(yǎng)2 h。取處理后的菌液200 μL 分別加入5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，用酶標(biāo)儀測定各組菌株的OD600值。

將乳酸菌活化2代后，取1 mL菌液離心棄上清，分別加入濃度為0.1%、0.2%和0.3%的膽鹽溶液 1 mL，用PBS 作為對照，重懸后于37 ℃中培養(yǎng)2 h。取處理后的菌液200 μL 分別加入5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，用酶標(biāo)儀測定各組菌株的OD600值。

1.4.5 溶血性試驗(yàn)

取活化后的菌懸液，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h 后觀察平板上生長菌落的溶血情況。以具有溶血性的大腸埃希氏桿菌為陽性對照。若菌落周圍由于紅細(xì)胞的不完全破裂 形成草綠色環(huán)，則為α溶血；若菌落周圍由于紅細(xì) 胞的完全破裂形成界限分明、完全透明的溶血環(huán)，則為β溶血；若菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，即為不溶血［12］。

1.4.6 乳酸菌藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片說明書采用紙片擴(kuò)散法（K-B法），將純培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液用MRS液體培養(yǎng)基稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋ň簼舛葹?.5×108cfu/mL）均勻涂布于MRS 培養(yǎng)基表面，待表面菌液干燥后使用無菌鑷子夾取24種標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片緊貼于MRS 培養(yǎng)基上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h 后，測量各抑菌環(huán)直徑。依據(jù)說明書判別分離菌株對所用藥物的敏感程度。藥敏紙片包括青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢克肟、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、氯霉素、利福平、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星等。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的鑒定結(jié)果

經(jīng)改良MRS固體培養(yǎng)基37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h的多次分離純化，從華南虎糞便樣品中共獲得142個(gè)菌株，菌落周圍有白色透明的溶鈣圈，菌落形態(tài)呈 白色或淡黃色。通過NCBI BLAST 比對，初步確定78 株菌株為乳酸菌，其中包括23 株羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、13 株約氏乳桿菌（Lactobacil?lus johnsonii）、11 株卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispa?tus）、9 株動物乳桿菌（Ligilactobacillus animalis）、8 株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、3株Ligilacto?bacillus saerimneri、3株陰道乳桿菌（Lactobacillus vaginalis）、2 株食淀粉乳桿菌（L.amylovorus）、2 株口乳桿菌（Limosilactobacillus oris）、1 株格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、1 株黏膜乳桿菌（Lactobacillus mucosae）、1 株敏捷乳桿菌（Ligilactobacillus agilis）和1 株乳腸球菌（Enterococcus lactis），表1 列出部分乳酸菌的鑒定結(jié)果，說明在圈養(yǎng)華南虎腸道中乳酸菌的微生物群落存在多樣性。

表1 菌株16S rRNA基因序列同源性Tab.1 Homology of 16S rRNA gene sequence

2.2 菌株抑菌性

按照同一樣品分離得到相同菌株且互相之間的16S rRNA 基因相似性大于99.9%時(shí)，只保留其中 1 株菌株的方法去除重復(fù)菌株，從78 株華南虎腸道乳酸菌中篩選出42 株進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)。4種指示菌株抑菌圈大于15 mm 視為具有良好抑菌性的菌株，初步篩選得到15 株優(yōu)良菌株，含6 株羅伊氏乳桿菌（22YY08、22DC20、22XX19、22Hui09、22LL14 和22XX03）、3株卷曲乳桿菌（22HH02、22YY13 和22YY09）、2 株動物乳桿菌（22Hui15、22LL07）、1 株戊糖片球菌（22DC18）、1 株黏膜乳桿菌（22DC10）、1株約氏乳桿菌（22DC09）和1株格氏乳球菌（GaL110）（表2）。以上菌株對遲鈍愛德華氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于沙門氏菌和大腸埃希氏桿菌，其中戊糖片球菌（22DC18）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈可達(dá)20 mm。說明不同種或同種不同株的乳酸菌在對致病菌的抑菌性上存在差異。

表2 菌株對致病菌的抑制能力Tab.2 Inhibition ability of strains to pathogenic bacteria mm

2.3 菌株耐酸和耐膽鹽性能

對抑菌性優(yōu)良的15 株菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽性能測定，結(jié)果如表3 所示，所有菌株均能在培養(yǎng)基中正常生長。在pH=2.5、pH=3.0 的條件下，除動物乳桿菌（22Hui15、22LL07）受到一定程度的抑制外，從華南虎糞便中分離出的另外13 株乳酸菌均表現(xiàn)出較好的耐酸能力。黏膜乳桿菌（22DC10）和約氏乳桿菌（22DC09）在0.1%膽鹽濃度下生長受到明顯抑制，對膽鹽耐受性差，其他菌株均能較好地耐受0.1% 的膽鹽環(huán)境。3 株卷曲乳桿菌22HH02、22YY13 和22YY09 在0.2%、0.3% 膽鹽 濃度 下的OD600值下降明顯，說明對高濃度膽鹽環(huán)境不耐受；其他菌株能在一定程度上耐受0.2%、0.3%的膽鹽環(huán)境。綜上所述，6 株羅伊氏乳桿菌（22YY08、22DC20、22XX19、22Hui09、22LL14 和22XX03）、戊糖片球菌22DC18和格氏乳球菌GaL110對酸和膽鹽耐受性相對較好，表明不同種屬的乳酸菌耐酸、耐膽鹽性能存在差異。

表3 不同pH及膽鹽條件下存活乳酸菌OD600Tab.3 OD600 of LAB under different pH and bile salt conditions

2.4 溶血性結(jié)果

對乳酸菌株進(jìn)行溶血性測定是乳酸菌安全性評價(jià)的重要指標(biāo)之一。利用哥倫比亞血平板對經(jīng)過抑菌性和耐酸耐膽鹽性檢測得到的8 株優(yōu)良乳酸菌株22DC18、22DC20、22Hui09、22LL14、22XX03、22XX19、22YY08 和GaL110 進(jìn)行溶血性鑒定，由圖1 可知，8株菌落周圍既無透明圈也無草綠色環(huán)，均不產(chǎn)生溶血性，說明菌株溶血作用方面是安全的。

圖1 乳酸菌株的溶血性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Hemolytic test results of LAB strains

2.5 菌株對抗生素的耐藥性

根據(jù)動物園常用藥物情況選擇24種藥物，對以上8株菌進(jìn)行耐藥性測試，結(jié)果表明（表4）所有菌株對喹諾酮類的諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星都具有耐藥性。羅伊氏乳桿菌（22DC20、22Hui09、22LL14、22XX03、22XX19、22YY08）中菌株22Hui09 對頭孢曲松、頭孢哌酮和氯霉素敏感，對其余21種藥物都具有耐藥性；菌株22YY08 對頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、紅霉素、阿奇霉素、氯霉素和利福平敏感，對15種藥物耐藥；菌株22LL14 對4種藥物敏感，對14種藥物耐藥；菌株22DC20對7種藥物敏感，對15種藥物耐藥；菌株22XX03對12種藥物敏感，對12種藥物耐藥；菌株22XX19對15種藥物敏感，對7種藥物耐藥。戊糖片球菌22DC18 對7種藥物敏感，對12種藥物耐藥；格氏乳球菌GaL110 對9種藥物敏感，對12種藥物耐藥。綜上所述，3 株羅伊氏乳桿菌22Hui09、22YY08 和22LL14 對多種藥物產(chǎn)生耐藥性，另外3 株羅伊氏乳桿菌（22DC20、22XX03、22XX19）、1 株戊糖片球菌（22DC18）和1 株格氏乳球菌（GaL110）在耐藥性方面相對安全。

表4 菌株對抗生素的耐藥性Tab.4 Resistance to antibiotics

3 討論

乳酸菌可黏附在動物機(jī)體腸道內(nèi)，通過代謝活動產(chǎn)生有機(jī)酸、抑菌蛋白類、過氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)有效抑制常見致病菌的增值［13］。相關(guān)研究表明羅伊氏乳桿菌能產(chǎn)生羅伊氏菌素、Reutericin 6、Re?utericinclin 和胞外多糖等抑菌物質(zhì)，可抑制多種致病菌的生長［14］，此外對機(jī)體的免疫屏障具有調(diào)節(jié)作用，包括增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用［15］、參與調(diào)控炎癥反應(yīng)［16］和調(diào)控T 細(xì)胞［17］。程王琨等［5］從圈養(yǎng)非人靈長類糞便中分離的乳酸桿菌中，發(fā)現(xiàn)3 株羅伊氏乳桿菌在腸上皮細(xì)胞表面對大腸埃希氏桿菌有較好黏附抑制效果。Scillato等［18］從人陰道分離的卷曲乳桿菌對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和糞腸球菌（Enterococ?cus faecalis）等多種病原菌均有較強(qiáng)的抑菌活性。張家寶等［19］從雞腸道分離的1 株卷曲乳桿菌對雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。何江波等［10］從羊瘤胃內(nèi)容物中分離的3 株戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。以上研究結(jié)果為本研究結(jié)果提供參考，因此本研究分離得到的15 株抑菌性能優(yōu)良的菌株具備開發(fā)為新型微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)條件，可繼續(xù)開展下一步試驗(yàn)。

乳酸菌從口腔進(jìn)入消化道后，胃液中的胃酸及各種酶類對乳酸菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，只有少數(shù)耐酸能力強(qiáng)的菌株才能存活下來并在體內(nèi)發(fā)揮益生作用［20］。胃液pH 值會隨著胃酸的分泌和 消耗在1.5～5.0 波動，食物通過胃的時(shí)間一般為 1～3 h［21］。通過胃液后存活的菌株將在小腸的前部遇到膽鹽［22］，因此研究乳酸菌的耐酸耐膽鹽性能是評價(jià)乳酸菌能否在胃腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用的重要指標(biāo)。研究表明羅伊氏乳桿菌耐胃酸和膽汁能力強(qiáng)，是少有的以消化道作為天然寄居地的益生菌［14］。程王琨等［5］從圈養(yǎng)非人靈長類糞便中分離的3 株羅伊氏乳桿菌均具有較好的耐酸耐膽鹽性能，與本研究結(jié)果相似。谷懿寰等［23］從奶豆腐中分離的戊糖片球菌可在pH 值為4.5 的條件下生長，且對膽鹽具有耐受性，體外模擬連續(xù)胃腸道消化后存活率仍為35%。馮秀娟等［24］從新疆新鮮牛奶中分離到1 株格氏乳球菌，該菌含有膽鹽水解酶基因（bsh），可產(chǎn)生膽鹽水解酶，表明該菌在益生制劑方面有開發(fā)潛力。

隨著抗生素的廣泛使用，乳酸菌在抗生素的選擇壓力下逐漸產(chǎn)生耐藥性，還有可能將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其他腸道菌群和致病菌中，從而對動物的健康造成威脅。細(xì)菌的耐藥方式分為天然性和獲得性耐藥2種，其中天然性耐藥基因一般存在染色體上，極少發(fā)生轉(zhuǎn)移［25］；獲得性耐藥基因一般存在質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上，存在水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［26］。分析經(jīng)抑菌性和耐酸耐膽鹽性檢測得到的8 株優(yōu)良乳酸菌株產(chǎn)生耐藥性的原因，可能是不同菌株攜帶不同的天然耐藥基因，也可能是在飼養(yǎng)華南虎的過程中抗生素的使用導(dǎo)致相關(guān)抗性基因轉(zhuǎn)移，形成獲得性耐藥。由于目前乳酸菌藥敏性評價(jià)還缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［10］，大部分乳酸菌對四環(huán)素藥物表現(xiàn)出耐藥［27］，后期可以通過全基因組測序技術(shù)深入研究以上菌株的耐藥機(jī)制，以確定是否存在耐藥基因的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

乳酸菌作為動物腸道的正常菌群，與宿主的營養(yǎng)吸收、腸道健康和免疫力等有著密切關(guān)系，但腸道乳酸菌的菌群數(shù)量常受外界因素，如應(yīng)激、抵抗力下降和病原微生物入侵等影響而減少，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)［5］。對于圈養(yǎng)的華南虎，易受到周圍環(huán)境及人為因素的影響而產(chǎn)生應(yīng)激，且食物主要為冷凍牛肉、雞骨架和動物內(nèi)臟等，在解凍和運(yùn)輸過程中易受到有害菌的污染，可以通過外源補(bǔ)充乳酸菌，維持腸道內(nèi)占優(yōu)勢的乳酸菌菌群，抑制有害菌的生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，達(dá)到預(yù)防和治療腸道炎癥的目的。

本試驗(yàn)通過從健康華南虎糞便中分離、鑒定和篩選乳酸菌，成功篩選出5 株具有良好生長性能、耐酸、耐膽鹽性及相對安全的菌株，包含3 株羅伊氏乳桿菌（22DC20、22XX03 和22XX19）、1 株戊糖片球菌（22DC18）和1 株格氏乳球菌（GaL110），對大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和遲鈍愛德華氏菌的抑菌圈均大于15 mm，在pH=2.5 和膽鹽濃度為0.1%時(shí)表現(xiàn)出較好的耐酸、耐膽鹽性能，均不產(chǎn)生溶血性，對多種抗菌藥物敏感。但本研究僅探究了乳酸菌的體外益生性，后期將進(jìn)行全基因組測序及動物試驗(yàn)，對乳酸菌的安全性及益生效果開展進(jìn)一步研究，為開發(fā)有效預(yù)防圈養(yǎng)華南虎腸道疾病和促進(jìn)腸道健康的益生菌制劑提供依據(jù)。