miR-155與CEBPB的靶向驗(yàn)證及繁殖性能相關(guān)基因的檢測(cè)

李軍義，劉娣，馬紅，汪亮，霍秀鵬，郝麗*

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱，150086）

排卵與黃體生成是所有哺乳動(dòng)物繁殖所必需的，對(duì)繁殖性能至關(guān)重要。排卵前卵泡顆粒細(xì)胞（GC）中的多個(gè)信號(hào)通路會(huì)被黃體生成素激活，這些通路中包含CEBPB所在的信號(hào)通路。CEBPB是亮氨酸拉鏈蛋白家族成員之一，已被證明在多種細(xì)胞類(lèi)型中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化及免疫調(diào)節(jié)的作用，如脂肪生成（前脂肪細(xì)胞）［1］、免疫反應(yīng)（單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）［2］、蛻膜（子宮基質(zhì)細(xì)胞）［3］和乳腺上皮細(xì)胞分化等［4?6］。在排卵過(guò)程中CEBPB基因的增加受到黃體生成素的調(diào)節(jié)，而CEBPB基因的缺失會(huì)最終導(dǎo)致生殖缺陷［7］。

MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，長(zhǎng)度為18～23 個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA 在許多生物過(guò)程中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育等［8］。自然界中廣泛存在的生物發(fā)光有機(jī)體（如細(xì)菌、真菌、魚(yú)和昆蟲(chóng)等）中，催化生物發(fā)光反應(yīng)的為熒光素酶（luciferase），底物為熒光素（luciferin）。熒光素酶可以催化熒光素氧化，同時(shí)發(fā)出生物熒光（bioluminescence），運(yùn)用熒光測(cè)定儀（即化學(xué)發(fā)光儀，luminometer）可以檢測(cè)出生物的熒光強(qiáng)度，當(dāng)?shù)孜镞^(guò)量時(shí)，發(fā)光量總值與樣品熒光酶活性成正比，從而可對(duì)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行間接估計(jì)［9］。

哺乳動(dòng)物黃體正常生成與排卵對(duì)于動(dòng)物的繁殖極為重要，miR-155 是否可以通過(guò)靶向CEBPB 調(diào)節(jié)黃體生成素的激增，進(jìn)而調(diào)節(jié)排卵功能的分子機(jī)制尚不清楚。王富霞等［10］研究表明，過(guò)表達(dá)miR-155可以顯著抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-155 后檢測(cè)與繁殖性能相關(guān)基因的變化規(guī)律，進(jìn)而推測(cè)miR-155 與卵泡顆粒細(xì)胞增殖的關(guān)系，通過(guò)雙熒光素基因報(bào)告載體方法 驗(yàn)證兩者之間關(guān)系，為后續(xù)動(dòng)物繁殖研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CEBPB基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建

從miRbase 官網(wǎng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取miR-155的成熟序列。通過(guò)在線生物信息學(xué)網(wǎng)站（www.targetscan.org）分析miR-155 的靶基因（圖1），推測(cè)CEBPB基因是miR-155 的一個(gè)靶基因。根據(jù)預(yù)測(cè)，定點(diǎn)缺失種子序列的堿基，構(gòu)建野生型與突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（圖2）。

圖1 miR-155靶基因預(yù)測(cè)Fig.1 miR-155 target gene prediction

圖2 miR-155結(jié)合位點(diǎn)突變示意圖Fig.2 Schematic diagram of binding site mutation

1.2 引物設(shè)計(jì)

使用Primer 5.0 設(shè)計(jì)定量引物，反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物。miR-155、CEBPB及U6 的定量和反轉(zhuǎn)錄引物如表1 所示，CEBPB3′UTR 野生型與突變型的引物如表2所示。

表1 miR-155和U6的定量與反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 Quantification of miR-155 and U6 with transactivation primers

表2 CEBPB 3′UTR野生型與突變型的引物Tab.2 Primers for wild type and mutant type of CEBPB 3′UTR

1.3 pMD18-T-野生型與突變型質(zhì)粒構(gòu)建

以民豬的組織基因組為模板，以表2 中設(shè)計(jì)的序列為引物，PCR 獲取CEBPB基因的野生型與突變型3′UTR 序列。PCR 擴(kuò)增體系：2×TaqMaster Mix 10.0 μL；上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；模板1.0 μL；ddH2O 補(bǔ)齊 至20.0 μL。PCR 反應(yīng) 參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸4 min，共計(jì)32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min；16 ℃保持1 min。參照EasyPure Quick Gel Ex?traction Kit 進(jìn)行純化回收?；厥盏玫降哪康钠闻cT 載體過(guò)夜相連，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR 鑒定后陽(yáng)性菌落送吉林省庫(kù)美生物科技股份有限公司測(cè)序。參考FastFilter Plasmid DNA Mini Kit D6944說(shuō)明書(shū)抽提陽(yáng)性菌液質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 CEBPB 基因野生型與突變型雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

XhoⅠ和NotⅠ雙酶切psi-Check-2 空載體及測(cè)序正確的含有野生型與突變型重組T 載體。將雙酶切獲得的野生型與突變型片段分別連接到線性化的psi-Check-2載體中，載體構(gòu)建步驟同1.3。

1.5 重組質(zhì)粒的功能驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒與miR-155 的mimics 和inhibitor 共轉(zhuǎn)染入PK15 細(xì)胞，設(shè)NC 為對(duì)照組，24 h 后檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR

將miR-155 的mimics 和inhibitor 分別轉(zhuǎn)染入PK15 細(xì)胞，24 h 后收取細(xì)胞提取總RNA，參照Ta?KaRa RR047A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與TaKaRa RR820A 熒光定量試劑盒分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR。

2 結(jié)果

2.1 目的DNA片段重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將構(gòu)建的pMD18-T-wt 質(zhì)粒和pMD18-T-mut 質(zhì)粒雙酶切，凝膠電泳后在423、378 bp 左右獲得條帶（圖3），符合預(yù)期大小，說(shuō)明克隆片段成功連入T載。

圖3 pMD18-T-wt質(zhì)粒和pMD18-T-mut質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD18-T-wt plasmid and pMD18-T-mut plasmid by double digestion

2.2 目的DNA片段測(cè)序

將野生型和突變型的基因測(cè)序結(jié)果用DANMAN 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖4所示，野生型基因片段相似性為100%，突變型成功突變掉種子區(qū)域片段。

圖4 野生型和突變型比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison results of wild type and mutant

2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

將構(gòu)建的psi-Check-2-wt 質(zhì)粒（圖5）和psi-Check-2-mut 質(zhì)粒（圖6）進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳后在423、378 bp 左右獲得條帶，符合預(yù)期大小，說(shuō)明克隆片段成功連入真核表達(dá)載體中。

圖5 psi-Check-2-wt雙酶切鑒定Fig.5 psi-Check-2-wt double enzyme digestion identification

圖6 psi-Check-2-mut雙酶切鑒定Fig.6 psi-Check-2-mut double enzyme digestion identification

2.4 雙熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)

將野生型（wt）和突變型（mut）雙熒光酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒分別與miR-155 mimics 和miR-155 in?hibitor共轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞，NC作為對(duì)照。結(jié)果如圖7A 所示，與NC 相比，miR-155 mimics 顯著抑制了野生型質(zhì)粒的熒光素酶相對(duì)活性（p<0.05）；與NC組相比（圖7B），miR-155 inhibitor對(duì)野生型質(zhì)粒熒光相對(duì)活性的抑制無(wú)顯著性差異，同時(shí)對(duì)突變型質(zhì)粒熒光素酶活性抑制也不明顯，結(jié)果表明，miR-155與CEBPB的靶向結(jié)合與預(yù)期相符，miR-155對(duì)CEBPB具有靶向調(diào)節(jié)作用。

圖7 wt和mut相對(duì)熒光素酶活性Fig.7 Relative luciferase activities of wt and mut

2.5 miR-155 mimics 與inhibitor 轉(zhuǎn)染后CEBPB基因的表達(dá)

miR-155 mimics與miR-155 inhibitor分別轉(zhuǎn)染到PK15 細(xì)胞中，24 h 后收取細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)miR-155 以及CEBPB基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 促使miR-155 過(guò)表達(dá)（p<0.001）（圖8A），基因CEBPB表達(dá)受到抑制（p<0.001）；轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 結(jié)果正好與mimics 組相反，miR-155 的表達(dá)受到抑制，而基因CEBPB的表達(dá)得到促進(jìn)（p<0.05）（圖8B）。在miR-155 mimics組繁殖性能相關(guān)基因BMP1、PPARG的表達(dá)量受到顯著抑制（圖8C）；BMP1、PPARG在miR-155 inhibtor 組的表達(dá)量顯著升高（p<0.05）（圖8D）。

圖8 miR-155的mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.8 Results of the mimics and inhibitor transfection of miR-155

3 討論

CEBPB是轉(zhuǎn)錄因子CEBP 家族中極其重要的一員。CEBPB主要通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)發(fā)揮其功能，它能對(duì)多種胞外信號(hào)分子產(chǎn)生應(yīng)答，進(jìn)而對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)［11］。排卵過(guò)程受到轉(zhuǎn)錄因子的影響，CEBPB是其中的轉(zhuǎn)錄因子之一［12］。在排卵前的卵泡中，CEBPB增加受黃體生成素的調(diào)節(jié)，并且以依賴(lài)ERK1/2 的方式激活［13］。有針對(duì)性地破壞CEBPB基因會(huì)導(dǎo)致卵巢和子宮的生殖缺陷［14］，如排卵與黃體化失敗、膜退化和增殖等。miR-155是一個(gè)多功能小RNA 分子，在細(xì)胞增殖、分化和免疫等方面均發(fā)揮重要的作用，它可以靶向目標(biāo)基因影響其發(fā)揮功能。有研究證明，miR-155 在多卵巢綜合征（PCOS）組大鼠卵巢組織中的表達(dá)量顯著增高［15］。此外，miR-155 在RIF 患者子宮內(nèi)膜中也表現(xiàn)出表達(dá)量上調(diào)，并且有可能通過(guò)調(diào)控MMP16基因來(lái)影響子宮內(nèi)膜的容受性［16］。miR-155 基因敲減的小鼠被證明無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡，有較多小卵泡，無(wú)黃體，顆粒細(xì)胞減少，卵泡膜明顯增厚，間質(zhì)細(xì)胞增生顯著［15］。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠體內(nèi)miR-155 表達(dá)下調(diào)；正常懷孕的小鼠，其早孕著床過(guò)程的子宮內(nèi)膜組織中，miR-155的表達(dá)量隨著妊娠時(shí)間增加也出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)［17］。因此，miR-155對(duì)繁殖性能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明，CEBPB是miR-55 的靶基因，兩者具有負(fù)向調(diào)控的作用。miR-155 mimics wt 組熒光素酶的活性受到顯著抑制，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表現(xiàn)為miR-155 mimics組CEBPB的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于NC 組明顯受到抑制（p<0.05），而miR-155 inhibitor組CEBPB的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（p<0.05）。Oliveira等［18］研究表明，miR-155與CEBPB、HOMAIR 和血漿纖維蛋白原呈負(fù)相關(guān)，與血清脂聯(lián)素呈正相關(guān)，本研究結(jié)果與其相似。繁殖性能相關(guān)基因BMP1、PPARG與miR-155 的表達(dá)水平在體外水平呈負(fù)相關(guān)。BMP1可以靶向靶基因促進(jìn)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡［19］；PCOS病人體內(nèi)PPARG的表達(dá)量明顯降低，PPARG缺失型剪接變體過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞增殖、遷移及凋亡均下調(diào)，表明PPARG可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的增殖凋亡等［20］，而miR-155 可能通過(guò)抑制BMP1與PPARG基因的表達(dá)水平進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡等。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如無(wú)細(xì)胞毒性、反應(yīng)靈敏且穩(wěn)定等，該系統(tǒng)中的螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶能催化熒光素氧化并發(fā)出可量化的熒光，目前在轉(zhuǎn)錄水平和信號(hào)通路等方面得到廣泛應(yīng)用，可用于microRNA 與基因是否具有靶向關(guān)系的驗(yàn)證。李池慧等［21］應(yīng)用該技術(shù)構(gòu)建了KSR2基因3′UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因載體并且驗(yàn)證了hcmvmiR-UL70-3p 和hcmv-miR-US4-3p 靶向關(guān)系。本研究表明miR-155 可以靶向結(jié)合CEBPB基因的3′UTR，表明miR-155與CEBPB存在靶向關(guān)系，之后可以通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-155 的mimics 和inhibitor 觀察兩者之間的具體關(guān)系，為后續(xù)研究miR-155與CEBPB在卵細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系做準(zhǔn)備。