基于實(shí)驗(yàn)猴國家標(biāo)準(zhǔn)對野外救護(hù)猴病毒血清學(xué)檢測分析

李世宗 ，李艷艷 ，金志堃，李中員，楊鳳梅，靳瑋華，唐潔，陳麗雄，劉權(quán)，孫文亭，鄧自君，趙遠(yuǎn)，和占龍

（1.云南森林自然中心，昆明，650224；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，國家非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物資源庫，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650118；3.西雙版納州野生動植物保護(hù)管理站，景洪，666100）

野生動物收容救護(hù)是加強(qiáng)野生動物保護(hù)管理中重要的一項(xiàng)工作內(nèi)容，通過收容、治療、康復(fù)護(hù)理和野化訓(xùn)練等方法，讓被救護(hù)動物健康回歸原野生環(huán)境，或?qū)λ鼈冞M(jìn)行遷地保護(hù)，使受威脅的野生動物生命得到最大限度地延續(xù)，控制疫病傳播，促進(jìn)野生動物的科學(xué)研究及與其相關(guān)的科普教育［1］。

我國的非人靈長類有懶猴科（Lorisidae）、猴科（Cercopithecidae）和長臂猿科（Hylobatidae）3 個(gè)科，猴科獼猴屬（Macaca）是現(xiàn)在靈長類組成的主體，目前共有8 個(gè)種，即短尾猴（M.arctoides）、熊猴（M.as?samensis）、臺灣獼猴（M.cyclopis）、北豚尾猴（M.leo?nina）、白頰獼猴（M.leucogenys）、獼猴（M.mulatta）、達(dá)旺猴（M.munzala）和藏酋猴（M.thibetana）［2］。我國所有3個(gè)科的靈長類在云南都有分布［3?4］。

以獼猴和食蟹猴（M.fascicularis）為代表的靈長類動物在親緣關(guān)系上最接近人類，遺傳物質(zhì)同源性達(dá)75.0%～98.5%［5］，在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類高度相似，因此成為探索生命及健康的重大基礎(chǔ)科學(xué)問題和生物醫(yī)藥臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用等領(lǐng)域中的關(guān)鍵戰(zhàn)略資源，同時(shí)作為嚴(yán)格意義的實(shí)驗(yàn)動物已經(jīng)建立了相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)對其飼養(yǎng)繁育、質(zhì)量監(jiān)測和疾病防控進(jìn)行管理。

實(shí)驗(yàn)猴微生物學(xué)等級國家標(biāo)準(zhǔn)中要求SPF 級實(shí)驗(yàn)猴獼猴皰疹病毒Ⅰ型（Cercopithecine herpesvirus type Ⅰ，BV）、猴T 細(xì)胞趨向性病毒Ⅰ型（Simian T lymphotropic virus type 1，STLV-1）、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）、猴逆轉(zhuǎn)D 型病毒（Simian retrovirus D，SRV）和猴痘病毒（Simian pox virus，SPV）為陰性。若感染以上病毒，將會影響動物的健康和質(zhì)量。本研究基于實(shí)驗(yàn)猴國家標(biāo)準(zhǔn)對野外救護(hù)猴開展5 項(xiàng)病毒血清學(xué)檢測，為野生非人靈長類動物實(shí)驗(yàn)動物化提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及樣本來源

試驗(yàn)動物為獼猴、北豚尾猴、熊猴和短尾猴，均來源于云南省野生動植物救護(hù)繁育中心和云南省西雙版納州野生動物收容救護(hù)中心，將采集處理的 94份血清樣本（獼猴34份、北豚尾猴13份、熊猴43份和短尾猴4份）作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

猴B病毒酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒（BV，IgG，批號E21110501）、猴T 淋巴細(xì)胞趨向性病毒酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒（STLV-1，IgG，批號E22031402）、猴免疫缺陷病毒酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒（SIV，IgG，批號E22031403）、猴逆轉(zhuǎn)D 型病毒酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒（SRV，IgG，批號E22031401）和猴痘病毒酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒（SPV，IgG，批號E22080901）均購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)儀器主要有全波長多功能酶標(biāo)儀（BioTek），Microfuge 20R臺式高速冷凍離心機(jī)（Thermo）等。

1.3 樣本處理

采集血液樣本的工作人員在采集過程中穿戴防護(hù)用品，做好個(gè)人防護(hù)。動物麻醉保定后采用一次性采血針采集后肢靜脈血，血液置于含有分離膠的采血管中，密閉包裝后低溫冷藏運(yùn)輸（切忌震蕩與搖晃）。樣本3 000 r/min，離心10 min，分離血清。

1.4 抗體檢測

依據(jù)GB 14922.2—2011《實(shí)驗(yàn)動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》中SPF 級猴病毒學(xué)檢測指標(biāo)，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清BV、STLV-1、SIV、SRV 和SPV 抗體水平。具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

檢測結(jié)果按照野生猴年齡、物種及性別進(jìn)行比較，計(jì)算抗體陽性率及混合感染率［6］，其中檢測陽性率=檢測出抗體陽性的猴數(shù)（只）/猴總數(shù)（只）×100%，混合感染率=檢測出2種及以上抗體陽性的猴數(shù)（只）/檢出猴總數(shù)（只）×100%。

利用GraphPad Prism 8 軟件的Fisher 確切概率檢驗(yàn)法對抗體陽性率的差異性進(jìn)行比較和分析［7］，顯著水平α=0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BV抗體檢測結(jié)果

對熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴血清BV 抗體陽性率進(jìn)行計(jì)算及分析，結(jié)果如表1。BV 抗體陽性率為15.96%；雌性熊猴陽性率為14.29%，雌雄間無顯著性差異（pTwo-sided=0.107 8，pOne-sided=0.107 8）；雄性和雌性獼猴陽性率分別為22.22%和31.25%，但二者間無顯著性差異（pTwo-sided=0.702 7，pOne-sided=0.417 4）；雄性短尾猴陽性率為75.00%；雌性和雄性北豚尾猴均未檢出BV 抗體。熊猴與獼猴（pTwo-sided=0.026 9，pOne-sided=0.021 2）、熊猴與短尾猴（pTwo-sided=0.004 7，pOne-sided=0.004 7）陽性率具有顯著差異。

表1 BV抗體陽性情況Tab.1 The situation of BV antibody positive

2.2 STLV-1抗體檢測結(jié)果

STLV-1 抗體陽性率為1.06%，其中僅有雌性獼猴檢測到STLV-1 抗體，陽性率為6.25%，雄性和雌性獼猴之間無顯著差異（pTwo-sided=0.470 6，pOne-sided=0.470 6）；熊猴、北豚尾猴和短尾猴STLV-1抗體陽性率均為0。4 個(gè)物種間相互比較均無顯著性差異（表2）。

表2 STLV-1抗體陽性情況Tab.2 The situation of STLV-1 antibody positive

2.3 SIV抗體檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，野生熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴SIV抗體均為陰性。

2.4 SRV抗體檢測結(jié)果

SRV 抗體陽性率為3.19%，4種野生猴的雄性SRV 抗體均為陰性，雌性熊猴陽性率為4.76%，雌性北豚尾猴陽性率為25.00%，雌雄間無顯著差異（表3）。熊猴和北豚尾猴間無顯著差異（pTwo-sided=0.131 3、pOne-sided=0.131 3）。

表3 SRV抗體陽性情況Tab.3 The situation of SRV antibody positive

2.5 SPV抗體檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，野生熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴SPV抗體均為陰性。

2.6 混合感染結(jié)果

對檢測出2種及以上抗體的動物計(jì)算混合感染率，結(jié)果顯示，本次檢測的4種野生猴均未見混合感染情況。

2.7 年齡與感染情況

根據(jù)野生猴齒式推斷其年齡。按照年齡將野生猴大致分成<5 歲、5～10 歲、>10 歲3 個(gè)年齡段。結(jié)果顯示，小于5 歲的熊猴未檢出BV 抗體，5～10歲陽性率為7.14%，大于10 歲的陽性率為11.11%；北豚尾猴各年齡段均為陰性；小于5 歲的獼猴BV 抗體陽性率為33.33%，5～10 歲陽性率略有下降，為20.00%，大于10 歲的陽性率為50.00%；5～10 歲短尾猴陽性率為100.00%，大于10 歲的陽性率為66.67%。STLV-1 抗體僅在5～10歲的獼猴中檢出。SRV 抗體僅在熊猴和北豚尾猴中檢出，大于10 歲的熊猴陽性率為11.11%；大于10 歲的北豚尾猴陽性率為25.00%，較5～10 歲的陽性率高（圖1）。

圖1 野生猴年齡與抗體陽性情況Fig.1 The rate of antibody positivity with age in wild monkeys

3 討論

關(guān)于靈長類實(shí)驗(yàn)動物研究及應(yīng)用、不同來源的獼猴（恒河猴）開展多種病毒血清學(xué)抗體檢測的報(bào)道較多［8?9］，但針對不同物種的野生猴病毒學(xué)相關(guān)檢測和研究報(bào)道相對較少。本研究基于國標(biāo)中SPF 級實(shí)驗(yàn)猴病毒學(xué)指標(biāo)，對云南省野外救護(hù)猴的病毒血清學(xué)抗體陽性率及其與性別、物種和年齡的差異性進(jìn)行比較分析，獲得部分野生猴病毒學(xué)方面的相關(guān)數(shù)據(jù)，為野生動物救護(hù)治療及野生猴疫源疫病監(jiān)測提供參考和指導(dǎo)。

BV 是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患病毒，致死率可達(dá)70%以上［10］。BV的自然宿主是獼猴，研究報(bào)道有較高的感染率，可達(dá)10%～60%［11］。符明泰等［12］對廣西地區(qū)獼猴（恒河猴）BV 抗體的調(diào)查結(jié)果顯示，小群關(guān)養(yǎng)猴和野生猴抗體陽性率分別為20.3%和16.6%。安徽省實(shí)驗(yàn)猴中心報(bào)道不同性別實(shí)驗(yàn)獼猴BV（B 病毒）抗體陽性率差異不顯著，而不同年齡實(shí)驗(yàn)猴抗體陽性率存在顯著差異，呈隨年齡增長而遞增的趨勢［13］。本研究中，熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴4種野生猴BV 抗體陽性率為15.96%，與云南地區(qū)野生獼猴陽性率［14］基本一致。短尾猴陽性率最高，為75.00%，可能與動物數(shù)量較少，且性別及年齡段單一有關(guān)，其次為獼猴、熊猴，而北豚尾猴未攜帶BV抗體。性別間比較，同一物種的野生猴雌雄間不存在顯著性差異。年齡間比較，熊猴陽性率呈現(xiàn)隨年齡增長而增加的趨勢，與蔡標(biāo)等［13］的研究結(jié)果相符；獼猴陽性率在5～10 歲年齡段下降，大于10 歲陽性率回升，這與成年動物生活史較長，接觸生活環(huán)境復(fù)雜程度有關(guān)。物種間比較，熊猴與獼猴具有顯著性差異、熊猴與短尾猴具有顯著性差異，提示病毒感染情況存在種屬間差異。

STLV-1 主要侵害實(shí)驗(yàn)猴免疫系統(tǒng)，引發(fā)相關(guān)疾病，但多數(shù)情況下猴感染后表現(xiàn)為潛伏感染，增加該病毒的隱匿性。國內(nèi)不同猴場實(shí)驗(yàn)猴STLV-1 感染率差異較大，云南、廣東、海南、河南和廣西各省猴場實(shí)驗(yàn)猴抗體水平比較，云南猴場的感染率最高，達(dá)到25%，其次為廣東、海南和河南［8］。另有研究顯示，云南省某人工飼養(yǎng)群中國獼猴（SCXK 滇2008-0001）的SRV、STLV和BV陽性感染率分別為19.71%、13.38%和23.11%［15］。李紹東等［16］對我國西南三省的野捕獼猴（恒河猴）STLV-1 抗體進(jìn)行檢測，陽性率為8.8%。本研究中僅在1 只獼猴中檢測到STLV-1 抗體，陽性率為2.94%。不同報(bào)道中陽性率存在差異可能和動物來源或檢測方法有關(guān)。

不同猴種SRV 感染率有明顯差異，Krugner-Higby等［17］用IFA 結(jié)合Western blot 的方法調(diào)查了食蟹猴、獼猴和短尾猴SRV 陽性率分別為36.1%、3.5%和11.9%。劉洋銓等［9］研究結(jié)果也證實(shí)了這種差異，獼猴（恒河猴）樣本和繁殖單元陽性率分別為11.64%和35.29%，顯著高于食蟹猴。本研究在熊猴、北豚尾猴、獼猴和短尾猴4種野生猴SRV 抗體的檢測中，發(fā)現(xiàn)熊猴、北豚尾猴的陽性率分別為2.33%和15.38%，而獼猴和短尾猴未檢出。各物種野生猴性別間無顯著性差異，4種野生猴種屬間無顯著性差異。熊猴僅在年長動物中檢出，北豚尾猴陽性率隨年齡增長而增加。本結(jié)果與以往研究結(jié)果相比存在一定差異，可能與檢測方法、動物來源及飼育方式差異有關(guān)。

獼猴和食蟹猴均可被某種SIV 亞型感染，表現(xiàn)出與人類感染HIV-1 相似的過程，大多數(shù)動物在感染1～4年后會出現(xiàn)致命的類似AIDS的癥狀［18］。SHIV 感染的北豚尾猴（平頂猴）曾被普遍認(rèn)為是研究HIV/AIDS 的理想模型［19］，平頂猴在感染HIV-1 或其亞型后，體內(nèi)出現(xiàn)HIV 病毒的復(fù)制［20］。也有研究認(rèn)為中國獼猴感染SIVamc239 后，表現(xiàn)出的病毒復(fù)制、發(fā)病速率及免疫損傷情況與人感染HIV-1 更為接近［21］。2022 年多國出現(xiàn)了人感染猴痘的病例，5月世界衛(wèi)生組織發(fā)布猴痘病毒疫情暴發(fā)預(yù)警［22］。常用的非人靈長類的猴痘動物模型為食蟹猴和狨猴（Callithrix jacchus）［23］。在20 世紀(jì)90 年代，就有報(bào)道稱云南獼猴SPV 感染率為57.14%，四川為35.48%，混合群為57.14%；新捕捉猴為33.30%，籠養(yǎng)為37.50%，群飼為90.12%［14］；周亞敏等［24］的研究顯示云南省野生獼猴（恒河猴）猴痘病毒的抗體陽性率為19.40%，野生猴血清學(xué)抗體全陰的結(jié)果也有報(bào)道［12］。本研究中野生猴群均未檢測到SPV和SIV抗體。

通過對野生猴5 項(xiàng)病毒抗體水平的研究，發(fā)現(xiàn)BV 陽性率最高，由于野生猴活動范圍廣，人與野生動物近距離接觸增多，生存活動空間重疊面增大，野生猴與人、與其他野生動物接觸的生活環(huán)境更加復(fù)雜且存在差異。為了解和掌握野生猴疫源疫病情況，應(yīng)采取有效、長期的跟蹤監(jiān)測，加強(qiáng)野生動物疫源疫病和人獸共患疾病的動態(tài)跟蹤調(diào)查和處置工作，最終保護(hù)和促進(jìn)野生動物和人類健康。