濾膜過(guò)濾法在大熊貓尿液采集及代謝組學(xué)中的應(yīng)用

閆拯，夏雪宜，楊嫡，徐海泓，崔勝楠，耿珠峰，何清，劉學(xué)鋒，劉彥暉，楊伊，劉皓秋，張成林，劉定震

（1.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100875；2.圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044；3.北京動(dòng)物園管理處，北京，100044；4.北京師范大學(xué)分析測(cè)試中心，北京，100875；5.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津，300072）

代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物的疾病與健康狀況評(píng)估［1?3］。尿液代謝物水平分析可用于監(jiān)測(cè)動(dòng)物的健康狀況、妊娠診斷、發(fā)情狀態(tài)和應(yīng)激水平。動(dòng)物的尿液相比于其他生物樣品，具有代謝物種類含量多、組成物質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單且蛋白含量低等優(yōu)勢(shì)，是監(jiān)測(cè)其生理、發(fā)情狀態(tài)和福利狀況優(yōu)劣的常用樣本［4?5］。然而，因安全考慮以及在動(dòng)物排泄的同時(shí)采集尿液的困難，目前研究人員多選擇動(dòng)物離開(kāi)或被轉(zhuǎn)移后采集遺留在圈舍地面的樣品，或者通過(guò)在動(dòng)物圈舍鋪墊塑料布的方式收集尿液樣品［6?7］。采用這些方式獲得的尿液樣品都會(huì)因?yàn)檎慈玖送寥篮蛣?dòng)物的糞便等污染源，導(dǎo)致樣品的污染從而影響代謝組學(xué)的檢測(cè)結(jié)果［8］。疊氮鈉（疊氮化鈉，NaN3）作為防腐劑能夠有效抑制細(xì)菌代謝繁殖，曾被作為代謝組學(xué)用尿液樣品預(yù)處理的首選化合物［9］，疊氮鈉處理后的尿液中代謝物更加穩(wěn)定［10?11］。但疊氮鈉屬爆炸性、劇毒性的化學(xué)物質(zhì)，不便攜帶和保存［12］，因此亟需找到一種替代方案收集并處理動(dòng)物的尿液樣品用于代謝組學(xué)分析。

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）作為生物多樣性保育的一個(gè)旗艦物種兼明星物種，深受全世界人民的喜愛(ài)，有關(guān)其遷地保護(hù)狀況以及福利情況也備受矚目，因此是開(kāi)展本研究工作的一個(gè)理想研究對(duì)象。大熊貓尿液樣本中含有睪酮、雌二醇、孕酮和皮質(zhì)醇等豐富的化學(xué)物質(zhì)和代謝物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于大熊貓的各項(xiàng)生理研究［13?14］，Zhu等［2］通過(guò)核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)對(duì)健康大熊貓的糞便、尿液、血清和唾液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，共鑒定出107種代謝物。此外，大熊貓血清和尿液代謝物成分及其相對(duì)含量還受年齡和性別的影響［15?16］。然而，通過(guò)對(duì)尿液樣品的不同處理并借助微生物培養(yǎng)法和代謝組學(xué)分析比較法探討代謝組學(xué)用尿液樣品預(yù)處理方法研究，迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。

為彌補(bǔ)該缺陷，本研究在北京動(dòng)物園使用一次性過(guò)濾器預(yù)處理收集的大熊貓尿液樣品，并進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和代謝組學(xué)檢測(cè)，以驗(yàn)證一次性過(guò)濾器在大熊貓尿液預(yù)處理上應(yīng)用的可能性，為此后的尿液代謝組學(xué)分析研究提供高效除菌的尿液樣品。通過(guò)檢測(cè)健康大熊貓尿液中的代謝物種類和含量，完善圈養(yǎng)大熊貓代謝信息庫(kù)，為疾病診斷、健康狀況和發(fā)情監(jiān)測(cè)等研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2021 年11 月16 日—12 月8 日在北京動(dòng)物園采集8 只大熊貓（3♀，5）的27 份尿液樣，分為亞成年（1.5～5.5 歲）、成年（5.5～20.0 歲）和老年（20.0～27.0歲）組［17］（表1）。

表1 大熊貓基本信息Tab.1 Basic information of giant pandas

在大熊貓排尿30 min內(nèi)使用一次性注射器從地面抽取6～15 mL尿液于無(wú)菌離心管中，然后分為3份分別裝于離心管中，進(jìn)行以下處理：第1 份不做任何處理（對(duì)照組）；第2 份使用0.22 μm Millex 過(guò)濾器（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）過(guò)濾尿液（濾膜組）；第3份加入100 μL 0.5%疊氮鈉溶液混勻（疊氮鈉組）。將上述3種處理的樣品放入冰盒冷藏，2 h內(nèi)運(yùn)回北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。將上述處理過(guò)的尿液樣品進(jìn)行離心處理（4 ℃，15 000 r/min，10 min）除去樣本中的固體雜質(zhì)、顆粒懸浮物以及細(xì)胞碎片等物質(zhì)［9］。對(duì)照組和疊氮鈉處理組均有沉淀物產(chǎn)生，濾膜組離心后無(wú)沉淀物。分別取上清后在冰箱中?80 ℃保存待分析。

1.2 尿液微生物培養(yǎng)

為保證用于后續(xù)代謝組學(xué)檢測(cè)有足夠的樣本量，從3種處理的尿液樣品中，選擇容積大于6 mL 的9 組尿液樣品進(jìn)行微生物培養(yǎng)。每組3 份共27 個(gè)尿液樣品分別抽取100 μL至胰酪大豆胨瓊脂（TSA）平板培養(yǎng)基，使用涂布器均勻涂至培養(yǎng)基表面，干燥，然后用封口膜密封，倒置于培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng) 24 h后取出，統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)。

1.3 核磁共振（NMR）檢測(cè)與分析

針對(duì)3種方法處理的27 組共81 個(gè)尿液樣本，首先進(jìn)行NMR 檢測(cè)前的樣品制備，然后使用核磁共振波譜儀（型號(hào)AVANCE Ⅲ HD，布魯克公司，德國(guó)）進(jìn)行NMR 分析，波譜儀配備5 mm 雙核z-梯度探頭（BBFO 探頭），設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度為298.0 K。NMR 分析用尿液樣品制備以及檢測(cè)方法參考何清［18］。將大熊貓的尿液樣本解凍后低溫離心處理（4 ℃，8 000 r/min，5 min），取上清液450 μL 加入磷酸鹽緩沖液（PBS）250 μL、含3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸鈉（TSP）的重水（D2O，氘代率99.9%）50 μL，混勻后轉(zhuǎn)移到核磁管內(nèi)，靜置10 min 后進(jìn)樣分析。采用1D NOESY預(yù)飽和實(shí)驗(yàn)測(cè)定氫譜，譜寬SW 設(shè)置為7 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，弛豫延遲時(shí)間2 s，掃描次數(shù)128 次，在傅里葉變換之前設(shè)定FID的窗函數(shù)線寬因子為0.3 Hz，并充零到64 k。使用預(yù)飽和水峰壓制技術(shù)減少水峰對(duì)其他有效溶質(zhì)信號(hào)產(chǎn)生的影響。

利用MestReNova v12.0 軟件校正對(duì)譜圖相位和基線，將3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸鈉（TSP）峰值處定為δH特征信號(hào)化學(xué)位移的零參考值。除去δH4.3～6.2 區(qū)域以避免殘存的水峰（δH4.8）以及尿素質(zhì)子信號(hào)（δH5.8）的影響，選擇δH0.5～10.0 區(qū)域的數(shù)據(jù)，按照每個(gè)積分間隔δH0.005 分段積分，得到123 201 個(gè)變量。將指紋譜分為3 段：A 段（δH0.5～2.8）、B 段（δH2.8～ 4.2）和C 段（δH5.3～9.5），對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行更加精確清晰的信號(hào)辨認(rèn)。在多變量統(tǒng)計(jì)分析之前，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，消除尿液總體積帶來(lái)的差異［19?20］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SIMCA-P v14.1（Umetrics AB，Umea，Swe?den）對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analy?sis，OPLS-DA），采用自適換算（unit variance scaling）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。隨機(jī)多次（n=100）改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值，進(jìn)行置換檢驗(yàn)，對(duì)OPLS-DA 模型有效性做進(jìn)一步的驗(yàn)證。根據(jù)本課題組指紋譜δH特征信號(hào)的化學(xué)位移值分析結(jié)果［18］對(duì)代謝物進(jìn)行推定。

根據(jù)質(zhì)譜圖推定出的代謝物成分及相對(duì)含量，使用R v4.1.2 軟件對(duì)不同處理方法、不同性別以及不同年齡組間大熊貓尿液中代謝物含量歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)以箱形圖表示，統(tǒng)計(jì)分析皆為雙尾檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)情況

在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，濾膜過(guò)濾器處理過(guò)的尿液均未生長(zhǎng)出可培養(yǎng)菌落；對(duì)照組有5 個(gè)樣品長(zhǎng)出菌落，占55.6%；疊氮鈉處理組有4 個(gè)樣品長(zhǎng)出菌落，占44.4%，每份尿液樣本在使用疊氮鈉處理后的菌落數(shù)均少于或等于對(duì)照處理（圖1）。

圖1 大熊貓尿液樣品微生物培養(yǎng)菌落生長(zhǎng)情況（37 ℃，24 h）Fig.1 Growth of microbial colonies in urine samples of giant pandas（37 ℃，24 h）

2.2 代謝物檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 大熊貓尿液1H NMR譜圖分析

根據(jù)大熊貓尿液1H NMR譜圖化學(xué)位移分析，共推定21種代謝物，其中肌酐、丙氨酸、乳酸、甜菜堿和肌酸在整體樣品中相對(duì)峰面積較大（表2）。

表2 大熊貓尿液樣本代謝物核磁數(shù)據(jù)Tab.2 NMR data of metabolites from urine samples of giant pandas

2.2.2 3種預(yù)處理方法差異分析

通過(guò)監(jiān)督性多維統(tǒng)計(jì)OPLS-DA 進(jìn)行模型分析，濾膜處理、疊氮鈉處理和對(duì)照處理間均未明顯區(qū)分（圖2A-C）。對(duì)照組和疊氮鈉組累計(jì)解析率R2X=0.248，R2Y=0.413，Q2=?0.295；過(guò)濾組和疊氮鈉組R2X=0.248，R2Y=0.34，Q2=?0.547；對(duì)照組和過(guò)濾組R2X=0.247，R2Y=0.434，Q2=?0.61。推定的21種代謝物組間均未出現(xiàn)顯著性差異（t-test：p>0.05，圖3）。這表明，采用濾膜處理和添加疊氮鈉處理的大熊貓尿液樣品，未對(duì)其中代謝物的組分產(chǎn)生影響。

圖2 不同處理、不同性別間大熊貓尿液樣本NMR的OPLS-DA得分Fig.2 OPLS-DA score plots based on NMR spectra of urine metabolites among three treatments and between the different sexes

圖3 21種代謝物相對(duì)含量在對(duì)照組、過(guò)濾組和疊氮鈉組間的差異（組間數(shù)值表示顯著性，t-test）Fig.3 Comparison of 21 metabolites in three urine treatment groups（values between groups indicate significance，t-test）

2.2.3 不同性別的大熊貓尿液代謝組學(xué)的判別分析

對(duì)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析的OPLS-DA 結(jié)果顯示，雌雄組間分離不明顯（圖2D），累計(jì)解析率R2X=0.258，R2Y=0.348，Q2=?0.144。

1H NMR 譜鑒定結(jié)合t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同性別的大熊貓間共發(fā)現(xiàn)7種顯著性差異代謝物（圖4），其中肌酸、乳酸、α-酮戊二酸和乙酸含量在雌雄組間差異顯著（p<0.05），二甲基甘氨酸、琥珀酸和反式烏頭酸差異極顯著（p<0.01）。

圖4 7種代謝物相對(duì)含量在雌雄大熊貓間的差異（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）Fig.4 Comparison of seven metabolites in relative content by peak area between two sexes（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）

2.2.4 不同年齡的大熊貓尿液代謝組學(xué)判別分析

通過(guò)亞成年、成年和老年組數(shù)據(jù)構(gòu)建的OPLSDA（圖5）顯示，成年和老年組區(qū)分較明顯，累計(jì)解析率R2X=0.349，R2Y=0.817，Q2=0.387；亞成年和成年組間區(qū)分不明顯，累計(jì)解析率R2X=0.279，R2Y=0.495，Q2=0.294；亞成年和老年組區(qū)分較明顯，累計(jì)解析率R2X=0.358，R2Y=0.83，Q2=0.295。

圖5 不同年齡間大熊貓尿液樣本NMR的OPLS-DA得分Fig.5 OPLS-DA score plots based on the NMR spectra of urine metabolites among age groups

在亞成年和成年組間，二甲基甘氨酸、酪氨酸、檸檬酸和甜菜堿含量有顯著差異（p<0.05），琥珀酸和反式烏頭酸含量差異極顯著（p<0.01）；成年和老年組間，N-乙?；堑鞍?、丙氨酸和甜菜堿含量有顯著差異（p<0.05）；亞成年和老年組間，N-乙?；堑鞍住⒍谆拾彼岷顽晁岷坑酗@著差異（p<0.05），丙氨酸含量差異極其顯著（p<0.01）（圖6）。

圖6 8種代謝物相對(duì)含量在亞成年、成年和老年大熊貓間的差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）Fig.6 Comparison of eight metabolites among three age groups（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）

3 討論

通過(guò)濾膜過(guò)濾后尿液樣本在離心后無(wú)沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明過(guò)濾膜能夠阻隔雜質(zhì)顆粒和細(xì)胞，并且濾膜過(guò)濾后的大熊貓尿液經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)菌群產(chǎn)生（圖1）。因此，濾膜過(guò)濾處理具有除菌、除雜質(zhì)的功能，操作簡(jiǎn)便快捷，可減少樣品在常溫中暴露的時(shí)間，利于尿液樣品收集和保存。

采樣污染對(duì)代謝組學(xué)結(jié)果的影響主要來(lái)源于細(xì)菌的增值和代謝［21］，濾膜可以有效降低采樣過(guò)程中細(xì)菌的污染，而多變量分析OPLS-DA 結(jié)果以及代謝物組間比較結(jié)果顯示濾膜處理、疊氮鈉處理和對(duì)照處理組之間代謝物組成無(wú)明顯區(qū)別（圖2，圖3）。Eisinger等［8］研究表明，尿液樣本暴露于15 ℃以上 2 h 后污染性微生物大量繁殖，對(duì)代謝物產(chǎn)生較大影響。本次大熊貓尿液樣本采集于北京11—12 月的清晨，記錄的平均采樣環(huán)境溫度為（8.4±3.6）℃，最高環(huán)境溫度為15.0 ℃。組間未產(chǎn)生差異的因素可能是環(huán)境溫度低，微生物代謝物速率減慢［10］，并在采樣后2 h 內(nèi)置入?80 ℃冷藏。但微生物對(duì)尿液樣品的影響仍不容小覷，細(xì)菌的繁殖會(huì)消耗檸檬酸鹽、肌酐等物質(zhì)，產(chǎn)生三甲胺、甲酸、乳酸和肌酸等，使尿素分解，造成尿液pH 升高，尿液成分改變，影響代謝組學(xué)的檢測(cè)結(jié)果［10，21］。在適宜微生物生長(zhǎng)代謝的環(huán)境

收集尿樣時(shí)，對(duì)尿液的處理很有必要，尤其是在溫度更高的夏天。此外，在低溫條件下采樣，3種方法處理后的代謝物分析結(jié)果也表明，濾膜處理、疊氮鈉處理沒(méi)有影響代謝物組成及豐度（圖2，圖3）。因此，濾膜過(guò)濾可以應(yīng)用于大熊貓尿液代謝組學(xué)檢測(cè)的尿液預(yù)處理工作。

不同性別間，大熊貓尿液代謝物在總體上沒(méi)有明顯的區(qū)分（圖2D）。在采集尿液樣品時(shí)，8 只大熊貓均處于非發(fā)情期，食譜相似，圈養(yǎng)條件一致，受到游客噪聲等環(huán)境因子的影響也相似，雌性和雄性大熊貓都處于健康和正常的狀態(tài)。不過(guò)，根據(jù)代謝物的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)7種代謝物存在顯著差異（圖4），可能與竹子各部位膽堿的含量不同，二甲基甘氨酸含量的差異可能與雌雄喜食的竹子部位不同有關(guān)［2］。雄性大熊貓肌肉質(zhì)量大，肌酸含量多［20］。生物體的性別會(huì)極大地影響雌性和雄性的激素水平，而激素水平會(huì)引起生物體內(nèi)代謝通路的變化［3］。雌激素可以增加脂肪酸的利用率，同時(shí)降低糖異生作用［22］。

不同年齡間大熊貓代謝物組成存在差異（圖5，圖6），從亞成年發(fā)育到成年階段，食量增加引起代謝變化，因此與三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）等生理代謝途徑相關(guān)的檸檬酸、琥珀酸等含量都有增加。酪氨酸由苯基丙氨酸合成，在酪氨酸酶催化和一系列氧化反應(yīng)下生成黑色素［23］，而檸檬酸、酪氨酸也被證明是雄性大熊貓自然交配成功與否的差異代謝物［24］。

本研究通過(guò)微生物培養(yǎng)和代謝組學(xué)手段相結(jié)合，檢驗(yàn)了一次性過(guò)濾器在代謝組學(xué)尿液處理中的可行性，為大熊貓和其他動(dòng)物尿液代謝組學(xué)預(yù)處理提供了簡(jiǎn)便快捷的處理方法。通過(guò)指紋圖譜的指認(rèn)分析，共得到21種代謝物，多變量分析結(jié)果顯示，雌雄大熊貓?jiān)诜欠敝称诖x物組成類似，無(wú)明顯區(qū)別；亞成年-成年組間代謝物組成沒(méi)有明顯的區(qū)別，亞成年-老年組間有一定的區(qū)別，成年-老年組間有明顯區(qū)別。本研究豐富了大熊貓的基本代謝組學(xué)庫(kù)，為大熊貓疾病監(jiān)測(cè)、繁殖期的判斷和應(yīng)激狀態(tài)內(nèi)在機(jī)制的研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他圈養(yǎng)哺乳動(dòng)物應(yīng)用該技術(shù)開(kāi)展尿液代謝組學(xué)及相關(guān)研究工作創(chuàng)造了條件。