墨脫花椒種子休眠特性與解除方法

關(guān)文靈　張海立　榮輝　孟靜

關(guān)鍵詞：墨脫花椒；休眠解除；種子萌發(fā)；物理休眠；生理休眠

中圖分類號(hào)：S573 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

墨脫花椒（Zanthoxylum motuoense）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）落葉小喬木，產(chǎn)于西藏墨脫縣境內(nèi)，分布于海拔1000～1900 m的亞熱帶濕潤(rùn)氣候地帶[1]。其果實(shí)和葉片具有濃郁的香氣，果實(shí)是西藏地區(qū)常用的香辛調(diào)料，用于烹制牦牛肉等食物。由于其風(fēng)味獨(dú)特，深受西藏人民的喜愛，主要用作烹飪調(diào)料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力，目前已成為墨脫縣重點(diǎn)發(fā)展的特色經(jīng)濟(jì)林木[2]。由于墨脫花椒自然繁殖系數(shù)低，人工繁育困難，想要產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，僅靠對(duì)野生資源的挖掘移栽不能滿足市場(chǎng)需要，種苗缺乏問題亟待解決。因此，解決墨脫花椒的人工繁育問題，對(duì)墨脫花椒的種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用具有深遠(yuǎn)的意義。播種育苗具有繁殖系數(shù)高、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，但墨脫花椒種子存在休眠現(xiàn)象，自然條件下萌發(fā)困難，發(fā)芽率極低。有關(guān)墨脫花椒種子萌發(fā)特性的研究未見報(bào)道，只有對(duì)其分類學(xué)、形態(tài)學(xué)及扦插育苗技術(shù)[2]的相關(guān)研究報(bào)道。為了探究墨脫花椒種子的休眠原因和萌發(fā)特性，本研究以墨脫花椒種子為研究對(duì)象，通過對(duì)種子吸水性和萌發(fā)抑制物質(zhì)的研究，探討墨脫花椒種子休眠的原因；采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究不同溫度和光照對(duì)種子萌發(fā)的影響，設(shè)置濃硫酸和GA3組合處理試驗(yàn)，篩選破除種子休眠及促進(jìn)萌發(fā)的最佳處理方案，為墨脫花椒的播種育苗及綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的墨脫花椒種子于2017 年10 月采收于西藏自治區(qū)林芝市墨脫縣，將新鮮果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室晾干后去除果皮和雜質(zhì)，收集純凈的種子干燥條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài) 隨機(jī)取10 粒種子，在體式顯微鏡下觀測(cè)種子形狀、顏色以及橫縱軸直徑，將種子沿中心線切成兩半，觀察種子內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，重復(fù)3 次。

1.2.2 種子空殼率 采用水選法。隨機(jī)取100 粒種子，放入盛有水的燒杯中，用玻璃棒適當(dāng)攪拌，讓全部種子充分浸沒在水中，5 min 后統(tǒng)計(jì)上浮種子占試驗(yàn)種子的百分比，重復(fù)3 次。將下沉種子自然晾干備用。

1.2.3 種子千粒重 采用百粒法測(cè)千粒重[3]。從篩選后種子中隨機(jī)取100 粒為1 組，共取8 組，分別稱重，計(jì)算平均質(zhì)量，轉(zhuǎn)換成千粒重。

1.2.4 種子含水量 采用103 ℃低恒溫干燥法[4]。從篩選后的種子中隨機(jī)取30 粒為一組，在103 ℃烘干箱中將樣品盒及盒蓋質(zhì)量烘干至不再變化，再稱取樣品盒和盒蓋的重量M1，稱取樣品盒和盒蓋及樣品的烘前總重量M2，放入103 ℃烘干箱烘12 h，再取出稱取樣品盒和盒蓋及樣品的烘后總重量M3。

1.2.5 種子生活力 采用TTC 法[5]。隨機(jī)取10粒飽滿種子，沿種子胚中心線切成兩半，置于培養(yǎng)皿中，加入0.5%TTC 浸沒種子，將培養(yǎng)皿放入30 ℃全黑暗恒溫箱中24 h，胚被染成紅色為有生活力的種子，重復(fù)3 次。

1.2.6 種子吸水性 分別隨機(jī)取去皮種子、酸蝕種子（濃硫酸浸種10 min 后洗凈晾干備用的種子）和完整種子各30 粒，分別稱其干重，放在盛水的燒杯中浸泡，每4 h（白天）和10 h（晚上）取出一次，用濾紙吸干表面水分，用電子天平迅速稱其濕重，直到種子質(zhì)量不再增加為止停止試驗(yàn)，觀測(cè)種皮對(duì)其吸水性的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。將酸蝕種子與完整種子在體式顯微鏡下進(jìn)行外部形態(tài)對(duì)比觀察。

1.2.7 種子發(fā)芽抑制物質(zhì)測(cè)定 分別取10 g 完整種子和空殼種子磨碎，置于100 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容至100 mL，在4 ℃恒溫箱中浸提24 h，期間震蕩3 次，然后充分過濾，濾液即為抑制物的提取液，分別稀釋為原濃度的75%、50%、25%、0%，在室溫下分別用稀釋后的溶液浸泡白菜種子2 h， 再用0.1%高錳酸鉀消毒10 min，用無菌水沖洗干凈，置于直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中的濾紙上，在25 ℃恒溫、光照條件為12 h光照/12 h 黑暗的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每個(gè)處理50 粒白菜種子，重復(fù)3 次，以胚根露出種胚為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，24 h 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.8 種子休眠解除的方法 用0.1%高錳酸鉀浸泡種子消毒10 min，后用無菌水沖干凈，進(jìn)行不同試驗(yàn)處理。將處理后的種子放入直徑9 cm 裝滿濕潤(rùn)珍珠巖的培養(yǎng)皿中，分別置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理30 粒種子，重復(fù)3 次。試驗(yàn)期間每天觀察，并保持珍珠巖濕潤(rùn)。參照《1996國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》的鑒定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況，種子的萌發(fā)以胚根長(zhǎng)度超過種子半徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)5 d 無萌發(fā)種子視為萌發(fā)結(jié)束。具體試驗(yàn)處理如下：

處理1（CK）：消毒后的種子未經(jīng)其他處理，放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。溫度為25 ℃和15 ℃各12 h 循環(huán)。處理2（機(jī)械去皮處理）：用手術(shù)刀對(duì)種子進(jìn)行去皮處理，將種仁取出進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。發(fā)芽條件同上。處理3（低溫沙藏處理）：隨機(jī)取30 粒完整種子，用濕沙包裹，后置于4 ℃冰箱中，每個(gè)月檢查其萌發(fā)情況，1 年后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。處理4（常規(guī)播種處理）：隨機(jī)取30粒完整種子，在深8 cm、內(nèi)口徑8 cm 的育苗盆中直接播種，再放置于大棚，用75%遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，每個(gè)月檢查其萌發(fā)情況，1 年后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。處理5（濃硫酸+GA₃組合處理方案的優(yōu)化篩選）：濃硫酸處理時(shí)間（T）設(shè)置4 個(gè)水平，分別為T₁（0 min）、T₂（5 min）、T₃（10 min）、T₄（15 min），GA₃濃度（G）設(shè)置5 個(gè)水平，分別為G₁（0 mg/L）、G₂（500 mg/L）、G₃（1000 mg/L）、G₄（1500 mg/L）、G₅（2000 mg/L），GA₃ 處理時(shí)間為48 h，共計(jì)20個(gè)處理，在30 ℃全時(shí)段黑暗條件的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。處理6（溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響）：室溫條件下，用濃硫酸處理種子10 min，在流水下反復(fù)搓洗干凈，再結(jié)合1500 mg/L GA₃浸泡48 h，分別在30 ℃、25 ℃和15 ℃/25 ℃條件下，全時(shí)段黑暗的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)結(jié)構(gòu)及千粒重

如圖1 所示，墨脫花椒種子主要為卵圓形，少數(shù)半卵圓形，卵圓形種子種皮堅(jiān)硬表面光滑，種臍位于其腹面中部，其橫軸直徑為（3.18±0.036）mm，縱軸直徑為（3.86±0.04）mm。半卵圓形種子橫切面光滑，橫軸直徑為（1.63±0.06）mm，縱軸直徑為（3.83±0.02）mm。

如圖2 所示，種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)由三部分組成：種皮、胚、胚乳，胚為白色抹刀型。

種子空殼率為25.67%±2.40%，對(duì)上浮種子進(jìn)行破殼處理，發(fā)現(xiàn)均為無胚的空殼，而下沉種子為飽滿種子。飽滿種子千粒重為（13.73±0.08）g，含水量為12.31%±0.62%，生活力為97.78%±1.11%，種子具備萌發(fā)的可能性。

2.2 種子吸水性

由圖3 可知，在同一時(shí)間段內(nèi)，去皮種子與完整種子相比，吸水率差異較大。去皮種子在0～4 h 階段，為快速吸水階段，吸水率為60.40%，在4～26 h 階段為緩慢吸水階段，在26 h 后吸水逐漸趨于平穩(wěn)，最終吸水率為76.41%。而酸蝕種子與完整種子吸水曲線差異不大，各階段吸水率接近持平，在0～4 h 階段為快速吸水階段，吸水率分別為9.95%和10.61%，4～30 h 吸水逐漸緩慢，后期逐漸接近吸水飽和， 最終吸水率分別為23.40%和21.19%。結(jié)果表明，墨脫花椒完整種子種皮透水性差，吸水速率慢，對(duì)種子萌發(fā)存在一定程度物理障礙，酸蝕處理后對(duì)種子吸水速率影響不大。

如圖4 所示，經(jīng)酸蝕處理后的種子與對(duì)照種子外部形態(tài)差異較大，酸蝕后的種子表面凹凸不平色澤暗淡，部分表面由于灼燒而產(chǎn)生裂痕，與對(duì)照種子表面光滑油亮形成鮮明對(duì)比。可見，濃硫酸浸種能去除種皮表面油脂物質(zhì)，還能使種皮開裂，從而增強(qiáng)透水透氣性。

2.3 種子發(fā)芽抑制物質(zhì)的生物測(cè)定

由圖5 可知，不同濃度的種皮和完整種子浸提液對(duì)白菜種子發(fā)芽率均有抑制作用，且隨著浸提液濃度的增加，白菜種子發(fā)芽率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且完整種子浸提液的抑制程度高于種皮浸提液。經(jīng)方差分析和多重比較結(jié)果顯示，當(dāng)種皮浸提液濃度為25%和50%時(shí)，發(fā)芽率與對(duì)照相比均無顯著差異（P>0.05），當(dāng)其濃度為75%和100%時(shí)，與對(duì)照相比均存在顯著差異（P<0.05），發(fā)芽率分別降低了87.34%、92.67%，表明當(dāng)種皮浸提液達(dá)一定濃度（≥75%）時(shí)，才具有抑制作用；而完整種子浸提液濃度在25%、50%、75%、100%時(shí)，與對(duì)照相比均存在顯著差異，發(fā)芽率分別降低了19.33%、44%、88.66%、92.66%；完整種子浸提液與種皮浸提液相比，在浸提液濃度為25%、50%、75%和100%時(shí)，白菜種子發(fā)芽率均低于種皮浸提液，且在25%和50%時(shí)均存在顯著差異，而完整種子由種皮和種仁構(gòu)成，說明種胚內(nèi)部也存在抑制物質(zhì)。由此可知，種皮和完整種子的甲醇浸提液對(duì)白菜種子均存在抑制作用，抑制物質(zhì)主要分布在種仁和種皮，抑制強(qiáng)度為完整種子>種皮，且隨浸提液濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。

2.4 促進(jìn)種子萌發(fā)方法

2.4.1 物理處理 通過試驗(yàn)得出，對(duì)照、機(jī)械去皮、低溫沙藏、常規(guī)播種4 種處理后的種子均未萌發(fā)?？梢姡摶ń贩N子不易萌發(fā)，存在休眠性。

2.4.2 化學(xué)處理 由表1 可知，當(dāng)濃硫酸處理時(shí)間（T）為0 時(shí)，無論GA3 濃度（G）有多大，種子都不會(huì)萌發(fā)，與對(duì)照（T1G1）結(jié)果一致，說明單獨(dú)的GA3 處理對(duì)種子萌發(fā)沒有促進(jìn)作用。當(dāng)GA3 濃度為0 mg/L（G1）時(shí)，濃硫酸處理時(shí)間為5 min（T2）和10 min（T3）時(shí)，種子發(fā)芽率分別為4.44%和3.33%，與對(duì)照相比不存在顯著差異，說明單獨(dú)的濃硫酸處理對(duì)種子萌發(fā)沒有實(shí)質(zhì)性促進(jìn)作用。在經(jīng)濃硫酸處理5～15 min 后，隨著GA3處理濃度的增大，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在GA3 濃度為1500 mg/L（G4）時(shí)，種子發(fā)芽率達(dá)到最高。其中濃硫酸浸泡10 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h（T3G4）的組合處理發(fā)芽率最高，達(dá)83.33%；其次是濃硫酸浸泡15 min+1500 mg/LGA3 浸泡48 h 的組合處理（T4G4），發(fā)芽率為77.78%，上述2 個(gè)處理的效果無顯著差異，但與其他處理間均達(dá)到差異顯著水平。由此可知，濃硫酸和GA3 共同作用可解除墨脫花椒種子休眠，促其萌發(fā)，2 種藥劑單獨(dú)處理時(shí)均不能有效解除種子休眠。

2.4.3 溫度 由表2 可知，30 ℃條件下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均為最高。其中，30 ℃發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽指數(shù)均顯著高于25 ℃ 和25 ℃/15 ℃，發(fā)芽率只顯著高于25 ℃/15 ℃，與25 ℃差異不顯著。綜合來看，溫度也是影響墨脫花椒種子萌發(fā)的一個(gè)重要因素，30 ℃條件更適合其萌發(fā)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，墨脫花椒種子具有較高的空殼率，達(dá)25.67%。在實(shí)踐生產(chǎn)中，種子的結(jié)實(shí)率主要受到播種、施肥、灌溉、病蟲害防治、輔助授粉等多種因素的影響[7]。而在自然條件下，種子產(chǎn)量和質(zhì)量主要受環(huán)境影響，其中氣候條件是影響種子生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，包括光照、溫度、降雨量等[8-9]。資料顯示，墨脫花椒在全世界僅分布于中國(guó)西藏的墨脫縣[1]。西藏墨脫地區(qū)具有青藏高原獨(dú)特的地理環(huán)境和特殊的氣候條件，雨量十分充沛，年降雨量達(dá)2000～3000 mm，屬于喜馬拉雅山東側(cè)亞熱帶潮濕氣候區(qū)[10-11]。推測(cè)原產(chǎn)地濕熱的氣候影響了傳粉受精，這可能是造成墨脫花椒種子空殼的主要原因。劉元生等[12]研究頂壇花椒成苗技術(shù)時(shí)，選用的種子采收自環(huán)境惡劣的喀斯特溫?zé)岷庸葏^(qū)，花椒種子的空殼率高達(dá)70%～90%；崔星星[13]在研究竹葉花椒種子休眠特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)采自四川不同地區(qū)的花椒種子空殼率均高達(dá)50%以上?？梢?，不同的環(huán)境條件對(duì)花椒種子結(jié)實(shí)都會(huì)造成一定影響，而環(huán)境條件如何影響花椒種子空殼則還需進(jìn)一步探究。

種子萌發(fā)過程不僅受到自身遺傳因素和形態(tài)特征的影響，還受到光照、溫度、水分、化學(xué)物質(zhì)等外界環(huán)境條件的調(diào)控[14]。已有研究證明，種子萌發(fā)的最適溫度通常和原生境氣候條件具有很大的關(guān)系[15]，也有可能與植物本身有關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，墨脫花椒在30 ℃條件催芽時(shí)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)都最高，說明30 ℃為發(fā)芽最適宜溫度。墨脫地區(qū)晝夜溫差大，最熱月平均氣溫30.1 ℃，較為接近發(fā)芽最適溫度。甘肅[18]、山東[19]兩地的大紅袍花椒催芽時(shí)也是選擇30 ℃恒溫黑暗條件，在此條件下發(fā)芽率較高。這一原因是否是花椒屬植物本身的遺傳特性還需深入探討。

種子吸水性試驗(yàn)結(jié)果顯示，去皮種子的吸水率在72 h 內(nèi)高達(dá)76.41%，而完整種子的飽和吸水率僅為21.19%，說明種皮嚴(yán)重阻礙了墨脫花椒種子的吸水性。經(jīng)濃硫酸處理后的種子飽和吸水率為23.40%，與完整種子的接近，這可能與酸蝕種子流水清洗時(shí)種子已充分吸水及流水洗凈后未完全晾干有關(guān)。對(duì)比完整種子，酸蝕種子表面已經(jīng)出現(xiàn)裂痕，種皮已難以阻礙吸水透氣。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[20]、巨紫荊（Cercis giganteaCheng et Keng f.）[21]、東北紅豆杉（Taxuscuspidata Sieb. et Zucc.）[22]等種子也都存在類似的吸水障礙。由此可見，種皮的透水性障礙是墨脫花椒種子休眠的原因之一。

抑制物質(zhì)存在于種子的各個(gè)部位，包括果皮、種皮、胚、胚乳部位，其中脫落酸是這些部位最常見的抑制物質(zhì)[23]。本研究通過甲醇對(duì)抑制物質(zhì)進(jìn)行提取。結(jié)果表明，墨脫花椒種子種皮和種仁中都存在抑制物質(zhì)，且隨著浸提液濃度的增大抑制作用逐漸增強(qiáng)。這與青花椒種子抑制物測(cè)定結(jié)果一致[13]，但青花椒種子不同部位的抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為種仁>種皮，對(duì)于墨脫花椒種子種皮和種仁的抑制強(qiáng)度及抑制物類型都需要進(jìn)一步探究。

根據(jù)休眠因素所在種子部位的角度可將種子休眠分為內(nèi)源休眠、外源休眠和綜合休眠[24-25]。墨脫花椒種子的種皮存在吸水障礙，屬于外源因素；種子存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，屬于內(nèi)源因素。由此認(rèn)為墨脫花椒種子屬于綜合休眠類型。在破除休眠的方法中，酸蝕處理有利于增加種皮透水性而解除其外源限制因素，GA3 處理可能有助于消減發(fā)芽抑制物質(zhì)而解除其生理休眠（內(nèi)源休眠）。

綜上，本研究認(rèn)為由種皮造成的吸水障礙和種子含有內(nèi)源抑制物是引起墨脫花椒種子休眠的主要原因，其休眠類型屬于復(fù)合休眠（PY+PD）。濃硫酸處理10 min+1500 mg/L GA₃浸種48 h+30 ℃恒溫培養(yǎng)可有效解除墨脫花椒種子休眠，提高其發(fā)芽率。研究結(jié)果為墨脫花椒人工繁育提供了科學(xué)依據(jù)。