蝴蝶蘭PhPIF4基因的克隆與響應(yīng)GA3表達(dá)分析

張英杰　劉民曉　孫紀(jì)霞　張京偉　郭文姣　呂曉惠　呂英民

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；PhPIF4；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；GA3

中圖分類(lèi)號(hào)：S688 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）是蘭科蝴蝶蘭屬植物的統(tǒng)稱(chēng)，是我國(guó)銷(xiāo)售量最大的年宵盆花花卉，也是國(guó)際暢銷(xiāo)的盆花種類(lèi)[1-2]。我國(guó)蝴蝶蘭盆花上市時(shí)間主要在春節(jié)前，因此蝴蝶蘭花期精準(zhǔn)調(diào)控尤為重要。目前在擬南芥中，已確定了6 個(gè)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的途徑：光周期、春化、赤霉素、溫度、自主和年齡途徑[3-10]。本課題組在前期蝴蝶蘭成花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘了大量的成花途徑關(guān)鍵基因，其中PhPIF4 基因在成花途徑中表達(dá)量顯著增加（未發(fā)表數(shù)據(jù)），成花轉(zhuǎn)變（抽梗）和小花原基分化期（花梗長(zhǎng)10 cm）基因FPKM 值，較低溫處理前增長(zhǎng)了22 倍和38 倍。PIF（phytochromeinteracting factor）蛋白是一類(lèi)能夠與激活狀態(tài)的光敏色素phyB 互作進(jìn)而響應(yīng)光信號(hào)的bHLH（basic helix–loop–helix）類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到“樞紐”作用，參與植物體內(nèi)多信號(hào)通路調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。在植物體內(nèi)，PIF 可能通過(guò)整合光和溫度[12] 2 種關(guān)鍵的環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與生物鐘對(duì)內(nèi)源激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，使植物能夠迅速地適應(yīng)周?chē)沫h(huán)境并精確調(diào)控其發(fā)育進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，PIF4、生長(zhǎng)素和植物伸長(zhǎng)生長(zhǎng)之間存在直接的分子聯(lián)系[13]。正常的生長(zhǎng)素反應(yīng)需要赤霉素（GA）的促進(jìn)作用[14]。PIF4 通過(guò)與DELLA 互作影響赤霉素的合成與功能發(fā)揮[15]。由PIF4 介導(dǎo)的生長(zhǎng)素和GA 的串?dāng)_作用也可能作用于植物成花。因此，PIF4 可能在光、溫度和激素等多途徑成花復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色。

本研究通過(guò)對(duì)蝴蝶蘭成花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析挖掘出來(lái)的PhPIF4 基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，以及對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3 的響應(yīng)表達(dá)分析，以期闡明PhPIF4 基因的調(diào)控機(jī)制，對(duì)蝴蝶蘭遺傳改良、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蝴蝶蘭品種大辣椒（Big Chilli）引自廈門(mén)和鳴花卉科技有限公司，在山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院內(nèi)栽培2 年。選用健康、無(wú)病蟲(chóng)害、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的4 葉1 心的成熟苗進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 PhPIF4 基因序列的獲取與分析 PhPIF4基因序列源自本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI ShortRead Achieve 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)：PRJNA783677，>TRINITY_DN38810_c0_g1_i3_3_2）。利用BLAST網(wǎng)站預(yù)測(cè)PIF4 氨基酸序列中的保守結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN（version 7）軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，通過(guò)clustal X 軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比較，通過(guò)GeneDoc 繪制多重序列比對(duì)圖，利用MEGA 5.0 系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)ExPASy（http：//expasy.org/cgibin/pi_tool）在線(xiàn)軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)，利用SignalP4.0Server 軟件分析蛋白信號(hào)肽，利用SOPMA 分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Phyre2分析蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1.2.2 亞細(xì)胞定位 將整個(gè)PhPIF4 編碼區(qū)擴(kuò)增并克隆到pBWA（V）HS-GLosgfp 中，酶切連接后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。用酶解液制備擬南芥幼苗葉片細(xì)胞原生質(zhì)體，然后在PEG-4000的作用下將pBWA（V）HS-PhPIF4-GLosgfp 和pBWA（V）HS-GLosgfp 導(dǎo)入原生質(zhì)體。采用激光共聚焦顯微鏡（Nikon C2-ER）觀察PhPIF4 定位。

1.2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)成花的影響 試驗(yàn)組在轉(zhuǎn)入低溫處理2 h 和10、20、30 d 后分別噴施GA3 （ T1：100 mg/L，T2：200 mg/L，T3：300 mg/L）、6-BA（T4：100 mg/L，T5：200 mg/L，T6：300 mg/L），100 mg/L GA3+100 mg/L 6-BA（T7）及300 mg/LGA3+300 mg/L 6-BA（T8）共8 組處理，清水為對(duì)照（CK）。每組處理15 株，每株噴施5 mL，主要噴施第3 和第4 葉基部，設(shè)3 次重復(fù)。統(tǒng)計(jì)第1 朵花的開(kāi)放和凋謝日期、花梗長(zhǎng)度和花量。用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)及制圖，用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 PhPIF4 基因時(shí)空表達(dá)及響應(yīng)GA3 表達(dá) 在蝴蝶蘭DBB（潛伏芽期，低溫處理前20 d）、IFB（花序原基分化期，花芽0.5～1 cm）、FBD（小花原基分化期，花梗10 cm）、FB（現(xiàn)蕾期，花梗30 cm）4 個(gè)時(shí)期分別取噴施GA3 300 mg/L 處理組及對(duì)照組的芽點(diǎn)（潛伏芽、花芽和花梗頂端0.5 cm）、葉片和根尖進(jìn)行qRT-PCR。使用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，并以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR。引物PIF4（+） ： GTTCCAATACCACCCTTAC ，PIF4（–）：GTCAG CGGAAATAATAGTCTGT。每個(gè)RT 反應(yīng)分2 步。第1 步將0.5 μg RNA、2 μL4×gDNA wiper Mi，加入無(wú)核酸酶的H2O 至8 μL。在GeneAmp? PCR System 9700 （Applied Biosystems，USA）中，42 ℃下反應(yīng)2 min。第2 步加入2 μL 的5×HiScript II Q RT SuperMix IIa，反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems，USA）中進(jìn)行，50 ℃下反應(yīng)15 min，85 ℃下反應(yīng)5 s。然后將10 μL 的RTRT reaction mix用nuclease-free water 稀釋10 倍，–20 ℃保存。采用LightCycler? 480 Ⅱ Real-time PCR Instrument（Roche， Swiss）進(jìn)行Real-time PCR，PCR 反應(yīng)混合物為10 μL，其中cDNA1 μL，2×ChamQ SYBRqPCR Master Mix 5 μL，正引物0.2 μL，反引物0.2 μL，nuclease-free water 3.6 μL。在384 孔光學(xué)板（Roche， Swiss）中95 ℃培養(yǎng)30 s，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，95 ℃培養(yǎng)10 s，60 ℃培養(yǎng)30 s。每個(gè)樣本重復(fù)3 次。據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)確定基因的Ct 值，表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhPIF4 基因序列分析

蝴蝶蘭大辣椒PhPIF4 基因ORF 全長(zhǎng)為539 bp，編碼176 個(gè)氨基酸。ProtParam 軟件分析表明PhPIF4 分子式為C854H1333N241O250S17，分子量為19 521.46；理論等電點(diǎn)（pI）為7.05，其中包含正電殘基（Asp+Glu）8 個(gè)、負(fù)電殘基（Arg+ Lys）8 個(gè)，理論半衰期為體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞30 h、在酵母體內(nèi)>20 h、在大腸桿菌體內(nèi)>10 h，不穩(wěn)定指數(shù)是67.48，脂溶指數(shù)是68.24，屬于不穩(wěn)定蛋白，平均親水性值為-0.38，為兩性蛋白，編碼蛋白不含信號(hào)肽。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，PhPIF4 蛋白中不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例為78%，α-螺旋比例為35%，β-轉(zhuǎn)角為0%（圖1）。利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)PhPIF4 基因編碼的氨基酸具有bHLH_SF super family（cl00081）同源異型盒家族的典型保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。將PhPIF4氨基酸序列與小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，PhaPIF4， XP_020586384.1） 、建蘭（Cymbidiumensifolium， CyPIF4， QDL88406.1 ） 、墨蘭（Cymbidium sinense， CymPIF4， QDH08906.1）、石斛蘭（ Dendrobium catenatum， DePIF13，XP_020694614.2 ） 、鼓槌石斛（ Dendrobiumchrysotoxum， DeIEQ34， KAH0453999.1）進(jìn)行比對(duì)，并與15 個(gè)物種PIF4 建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，大辣椒PhPIF4 與小蘭嶼蝴蝶蘭親緣關(guān)系較近，其次為建蘭、墨蘭和石斛蘭（圖3）。

2.2 PhPIF4 亞細(xì)胞定位分析

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化35S-GFP 空載體的擬南芥原生質(zhì)體中，GFP 基因大量表達(dá)，綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和細(xì)胞核中均有分布。而在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化35S-PIF4-GFP 的擬南芥原生質(zhì)體中，綠色熒光信號(hào)主要分布于細(xì)胞器上，細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中均未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，表明PhPIF4 蛋白定位于非葉綠體的細(xì)胞器中（圖4）。

2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3對(duì)成花的影響

不同濃度GA3 處理均增加了蝴蝶蘭花梗長(zhǎng)度，使花期提前9～11 d，但對(duì)花徑和花量均無(wú)顯著影響?；üＷ铋L(zhǎng)的處理組是200 mg/L GA3，然而不同濃度GA3 處理的花梗長(zhǎng)度增加的差異不顯著。6-BA 可顯著增加蝴蝶蘭花量，花量最多的處理組為300 mg/L 6-BA，但6-BA 對(duì)花期和花梗長(zhǎng)度無(wú)顯著作用。GA3 和6-BA 混合使用時(shí)，對(duì)蝴蝶蘭開(kāi)花時(shí)間和花期的影響介于二者之間（圖5）。

2.4 PhPIF4 基因表達(dá)量分析

在蝴蝶蘭花發(fā)育過(guò)程中，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達(dá)量變化不同（圖6）。在花芽中表達(dá)量變化相對(duì)較小，在葉片中表達(dá)量逐漸增加，在根中增加最顯著，F(xiàn)B 期較DBB 期增加了10 倍以上。但不論在哪種器官中，該基因均在FB 期表達(dá)量最大。噴施生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達(dá)量均有所增加，且在FB 期增加量最大，表明PhPIF4 基因的表達(dá)可能受GA3 影響與調(diào)控。

3 討論

在蝴蝶蘭生產(chǎn)栽培中，低溫、長(zhǎng)日照和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是重要的催花技術(shù)手段。夜間18～20 ℃、白天23～26 ℃的相對(duì)低溫處理40～50 d[16]以及增強(qiáng)光照可提前蝴蝶蘭的自然花期以供應(yīng)我國(guó)年宵用花。光照可促進(jìn)蝴蝶蘭成花，光周期對(duì)蝴蝶蘭開(kāi)花的影響不明顯，但增加光強(qiáng)可增加花序數(shù)量，加速抽梗[17]。降低光輻照可以延緩蝴蝶蘭的花梗發(fā)育，從而推遲蝴蝶蘭的開(kāi)花時(shí)間[18]。這可能與蝴蝶蘭屬于景天酸代謝（CAM）植物有關(guān)，CAM受晝夜節(jié)律和光質(zhì)[19]影響。擬南芥中許多bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性，如bHLH69 和bHLH92[20]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的PIFs 可以通過(guò)與遠(yuǎn)紅光吸收型光敏色素互作來(lái)調(diào)控植物開(kāi)花，其中，PIF4 和PIF5 的表達(dá)具有節(jié)律性，可能通過(guò)與節(jié)律鐘基因的相互作用來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)和開(kāi)花[21]。受光照激活的光敏色素既可以通過(guò)光誘導(dǎo)的磷酸化作用與PIFs 蛋白互作，也可與其直接互作，誘導(dǎo)PIFs 蛋白迅速降解[22-24]。同時(shí)光敏色素還可以通過(guò)調(diào)控COP1 （ constitutivelyphotomorphogenic 1）-SPA（suppressor of phytochromeA）復(fù)合體的活性，間接影響PIFs 蛋白的穩(wěn)定性[25-26]，降低PIFs 的表達(dá)水平。PIFs 能夠結(jié)合生物鐘的核心組件CCA1/LHY 啟動(dòng)子的G-box 區(qū)域，參與生物鐘的調(diào)節(jié)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)PhPIF4 基因編碼的氨基酸具有bHLH_SF superfamily（cl00081）同源異型盒家族的典型保守結(jié)構(gòu)域，bHLH 家族是植物中第二大類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，參與植物不同組織眾多代謝過(guò)程的調(diào)控，在植物光信號(hào)傳導(dǎo)、抗逆脅迫和次生代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PhPIF4 與蝴蝶蘭花發(fā)育過(guò)程緊密相關(guān)，隨著花發(fā)育其表達(dá)量逐漸加倍，但其與光敏色素和節(jié)律鐘基因的互作關(guān)系有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可影響蝴蝶蘭成花轉(zhuǎn)變。赤霉素被認(rèn)為是促進(jìn)蝴蝶蘭花芽分化與花期提前最重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[28-29]。鄭錦凱等[30]研究發(fā)現(xiàn)250、500、1000 mg/mL 赤霉素處理后蝴蝶蘭花期分別提前了5、9、17 d。此外，GA 可有效提高蝴蝶蘭雙梗率、花芽分化率和分枝率[31]，可代替環(huán)境信號(hào)來(lái)縮短植物的開(kāi)花時(shí)間。BLANCHARD 等[32]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)噴施200 mg/L 或400 mg/L BA（0.2 L/m²）的植株比未處理的植株早3～9 d 出現(xiàn)明顯的花序，平均每株多0.7～3.5 個(gè)花序、多3～8朵花，但BA 不能完全替代低溫誘導(dǎo)。BA+GA 處理對(duì)不同速率下的花序數(shù)和總花數(shù)均無(wú)顯著影響。劉曉榮[31]研究發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭大花品種2048 對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑較小花品種如滿(mǎn)天紅更敏感，10 mg/L 6-BA 顯著增加了花芽分化速度， 而25 mg/L 與對(duì)照差異不顯著。涂抹花芽處理試驗(yàn)中，25 mg/L 和50 mg/L 6-BA、50 mg/L GA 均提高了雙梗率。因此不同激素聯(lián)合處理蝴蝶蘭的成花作用效果在品種間存在差異。本研究?jī)H針對(duì)大辣椒品種展開(kāi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GA3 處理增加了花梗長(zhǎng)度，并使花期提前。6-BA 可顯著增加蝴蝶蘭花量，但對(duì)花期和花梗長(zhǎng)度無(wú)顯著作用。2 種激素聯(lián)合使用效果介于二者之間。

植物成花過(guò)程赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括GID1、DELLA蛋白以及介導(dǎo)DELLA蛋白降解的其他調(diào)控因子。當(dāng)GA 在細(xì)胞外的濃度較高時(shí)，GA 上的C 端結(jié)構(gòu)域會(huì)與GID1 結(jié)合，從而引發(fā)一系列相關(guān)應(yīng)答反應(yīng)；當(dāng)細(xì)胞外GA 濃度低時(shí)，GA則不與GID1 結(jié)合，這時(shí)GA 應(yīng)答基因與DELLA蛋白結(jié)合，并被其抑制活性[33]。擬南芥PIF1 能夠與2 個(gè)DELLA 蛋白基因RGA1 和GAI 的啟動(dòng)子結(jié)合抑制黑暗中種子萌發(fā)[34]。擬南芥DELLA蛋白通過(guò)抑制PIF4 的活性，調(diào)節(jié)植物開(kāi)花時(shí)間，在缺乏DELLA 蛋白時(shí)植物會(huì)表現(xiàn)出提前開(kāi)花的表型[35]。GA 降解DELLA 蛋白，在GA 缺乏的植株中，DELLA 蛋白積累，PIF4 的活性被抑制，抑制FT 相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致開(kāi)花延遲[36]。本研究中，噴施生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達(dá)量均有所增加，且在FB 期表達(dá)量最大，表明PhPIF4 基因的表達(dá)可能受GA3影響與調(diào)控。但赤霉素是直接調(diào)控PhPIF4，還是通過(guò)赤霉素調(diào)節(jié)DELLA 蛋白含量，使DELLA 蛋白與PIF4 蛋白互作，進(jìn)而間接調(diào)節(jié)PhPIF4 的表達(dá)量，仍有待進(jìn)一步研究。

PIF 基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到“樞紐”作用[37]，本文研究了GA3 等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)蝴蝶蘭生殖生長(zhǎng)的影響，探究了PhPIF4 基因響應(yīng)赤霉素的表達(dá)情況，為揭示其在蝴蝶蘭生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步完善PhPIF4 在赤霉素調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為其遺傳育種應(yīng)用做準(zhǔn)備。