不同方法處理核酸片段的對比研究*

黃小曄,彭 麗,梁劍琦,陳 偉

湖南省婁底市中心醫(yī)院檢驗科,湖南婁底 417000

新型冠狀病毒(以下簡稱新冠病毒)感染的癥狀不同于典型肺炎,且對常規(guī)抗病毒治療無效。在我國最新版本診療方案中,新冠病毒核酸檢測仍為診斷提供直接證據(jù)[1],現(xiàn)在最常用的是實時熒光定量反轉錄PCR法,它是一種靈敏度和特異度高且已在臨床廣泛使用的感染性病原體核酸檢測技術[2-3]。盡管核酸檢測技術有諸多優(yōu)點,但由于其超高的靈敏度,一旦實驗室出現(xiàn)極微量的核酸污染,很容易導致假陽性,從而影響檢測的準確性。有數(shù)據(jù)顯示,實驗室假陽性的發(fā)生率達9%～57%[4]。假陽性的結果跟實驗室污染有非常緊密的聯(lián)系,而實驗室污染主要出現(xiàn)在標本處理環(huán)節(jié)的抽提核酸、檢測環(huán)節(jié)的擴增產物和陽性質控的泄露等,這些情況均會導致嚴重的實驗室污染。目前主要通過嚴格的帶負壓分區(qū)的物理隔絕方法及實驗室標準操作規(guī)程防止核酸污染[5-6],但是這種方法只能延緩污染不能清除已經(jīng)發(fā)生的污染。如何能夠避免實驗室污染的產生及污染產生后如何快速地消除,對于基層實驗室來說是十分重要而且緊急的任務。本研究選取3種常見處理方式(75%乙醇、紫外線、含氯消毒劑)分別對2種不同長度(120 bp和1 600 bp)的高水平(>1013copy/mL)核酸片段進行清除,以2種核酸片段的混合液作為陽性對照,利用實時熒光定量PCR和瓊脂糖電泳及凝膠成像技術,比較不同處理方法對核酸的清除效果。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀和E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)購自賽默飛世爾公司,電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司,西班牙瓊脂糖、熒光定量PCR試劑盒、標志物、引物探針購于大連寶生物有限公司。

1.2方法

1.2.175%乙醇清除核酸 將100 μL混有2種核酸片段的混合液與等體積75%乙醇混勻,處理時間分別為0.5、2.0、6.0 h,每隔半小時振蕩混勻一次,取5 μL為模板進行實時熒光定量PCR驗證降解效果,同時取5 μL模板采用凝膠電泳(1%瓊脂糖)驗證核酸片段的完整性。

1.2.2紫外線清除核酸 將100 μL混合液暴露在紫外線下(紫外強度≥90 μW/cm2),暴露時間分別為0.5、2.0、6.0 h,加入適量純水使暴露后最終體積仍為100 μL,取5 μL為模板進行實時熒光定量PCR驗證降解效果,同時取5 μL模板采用凝膠電泳(1%瓊脂糖)驗證核酸片段的完整性。

1.2.3含氯消毒劑清除核酸 將100 μL混合液分別與等體積有效氯水平(分別為500、1 000、2 500、5 000 mg/L)的84消毒液混勻,處理2 h,期間每隔半小時振蕩混勻一次,采用凝膠電泳(1%瓊脂糖)鑒定不同水平下84消毒液對核酸片段的影響。

選取有效氯水平2 500 mg/L的84消毒液,將100 μL混合液與其等體積混勻,分別處理15、30、60 min,采用凝膠電泳(1%瓊脂糖)鑒定此水平下84消毒液處理不同時間對核酸片段的影響。

2 結 果

2.1不同方法處理核酸片段的效果 75%乙醇和紫外線處理6 h以后,對高水平核酸片段清除無效,有效氯終水平≥2 500 mg/L可以有效降解核酸片段。見表1。

表1 不同方法處理2種核酸片段的效果

2.275%乙醇對核酸片段的清除效果 75%乙醇處理0.5、2、6 h后,瓊脂糖凝膠電泳顯示核酸片段完整性相對于陽性對照無明顯改變,實時熒光定量PCR的CT值(15.32±0.10)亦無明顯差別。見圖1。

注：M為100 bp～1 500 bp DNA 標志物;1為陽性對照;2為處理0.5 h的混合液;3為處理2.0 h的混合液;4為處理6.0 h的混合液。

2.3紫外線對核酸片段的清除效果 紫外線分別照射0.5、2.0、6.0 h后,瓊脂糖凝膠電泳顯示核酸片段完整性無明顯變化,熒光定量PCR的CT值(14.75±0.06)無明顯差別。見圖2。

注：M為100 bp～1 500 bp DNA 標志物;1為陽性對照;2為照射0.5 h的混合液;3為照射2.0 h的混合液;4為照射6.0 h的混合液。

2.4含氯消毒劑對核酸片段的清除效果

2.4.1水平因素 有效氯終水平≥2 500 mg/L的含氯消毒劑能有效去除2種不同長度的核酸片段,而終水平≤1 000 mg/L時,對高水平核酸沒有清除能力。見圖3。

注：M為100 bp～1 500 bp DNA 標志物;1為陽性對照;2為5 000 mg/L含氯消毒劑的混合液;3為2 500 mg/L含氯消毒劑的混合液;4為1 000 mg/L含氯消毒劑的混合液;5為500 mg/L含氯消毒劑的混合液。

2.4.2時間因素 有效氯終水平為2 500 mg/L的含氯消毒劑在處理30 min及以上時,可有效降解高水平核酸片段。見圖4。

注：M為100 bp～1 500 bp DNA 標志物;1為處理15 min的混合液;2為處理30 min的混合液;3為處理60 min的混合液。

3 討 論

由于核酸檢測的廣泛、快速普及,大量基層實驗室開展了核酸檢測,伴隨出現(xiàn)的最突出問題便是核酸污染導致的假陽性結果,因為PCR產物拷貝量一般為1013copy/mL,遠高于試劑所提供的500 copy/mL的檢測限,所以極微量的PCR產物污染,就可造成假陽性。嚴格的物理分區(qū)及逐級負壓,能最大限度地減少污染的產生,但是無法徹底避免。而且大量基層實驗室沒有條件做到嚴格物理分區(qū),負壓實驗室更加困難,因此,防止和清除核酸污染是基層實驗室迫切需要考慮的問題。實驗室檢測完成后采用房間固定和(或)可移動紫外燈紫外照射2 h以上,用0.2%含氯消毒劑或75%乙醇對實驗臺面、地面、生物安全柜等消毒處理,若有滲漏污染則用0.55%含氯消毒劑處理[7]。

乙醇通過使蛋白質脫水、變性凝固達到滅活病毒的效果,它不會直接破壞DNA[8]。實驗室常通過噴灑乙醇對氣溶膠進行物理沉降再聯(lián)合含氯消毒劑或核酸去除劑等清除核酸污染[9]。本研究結果證明75%乙醇獨立使用時對清除核酸片段無明顯效果。清除核酸污染主要是通過雙鏈間的氫鍵斷開變成單鏈結構和形成光化產物如嘧啶二聚體等,從而改變DNA的生物活性,使微生物自身不能復制而致死。郭靈安等[10]研究表明,低強度的紫外線60 μW/cm2對小片段核酸污染的消除效果并不理想,本研究結果顯示普遍存在于各實驗室的紫外燈(紫外強度≥90 μW/cm2)對清除核酸片段并無明顯效果,該研究結果與上述文獻結果相似。含氯消毒劑產生的次氯酸和新生態(tài)氧能氧化蛋白質并直接裂解核酸,它在分子診斷實驗室的使用價值已經(jīng)得到證實[11],但含氯消毒劑的具體適宜水平和作用時間并不明確。陳茂義等[12]發(fā)現(xiàn)500 mg/L的有效氯水平作用30 min不能破壞存在于完整新冠病毒內的核酸成分,但是1 000 mg/L及以上的有效氯水平作用30 min后可以破壞。安超等[13]研究發(fā)現(xiàn)2 000 mg/L的含氯消毒劑能有效去除單獨存在的核酸片段,但并未說明具體作用時間。由于本研究采用的是高水平的核酸片段(>1013copy/mL),明顯高于標本內病毒含量或單獨的陽性質控品(105copy/mL),且因過高的有效氯水平會破壞PCR反應試劑成分如酶類,故采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定其效果,得出的最低可清除高水平核酸的含氯消毒劑水平是2 500 mg/L,且至少需要30 min才能完全清除。

綜上所述,有效氯終水平≥2 500 mg/L的含氯消毒劑處理至少30 min后能有效清除不同長度的高水平核酸片段,但是75%乙醇和紫外線處理6 h后對高水平核酸片段的清除效果不明顯。84消毒液是一種廉價并廣泛使用的含氯消毒劑,它在滅活病毒和清除核酸污染方面都具備非常明顯的效果,在基層實驗室大力推廣的同時必須要關注它的使用水平和時間,以達到預期效果。