玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收動力學特征及途徑探討

居靜，王欣，陳永林，盛海君，汪曉麗，趙海濤*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部耕地質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室，揚州大學，江蘇 揚州 225127；2.句容市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212499）

土壤重金屬污染涉及食品安全和人類健康，已成為全人類近年來共同關心和亟待解決的世界性重大環(huán)境問題。鉻（Cr）位于元素周期表第四周期第六副族，是硬度最大的金屬。Cr 由于其廣泛的工業(yè)應用，已成為地下水、土壤及沉積物中第二常見的重金屬污染物[1]，也是我國實行重點防控的五種主要重金屬污染物之一[2]。據(jù)統(tǒng)計我國嚴重Cr 污染的土壤已超過1 250 萬t[3]。在自然界中Cr 擁有不同的價態(tài)（-2～+6），其中三價[Cr（Ⅲ）]和六價[Cr（Ⅵ）]是最穩(wěn)定和最常見的形態(tài)。因土壤對Cr（Ⅵ）吸附力較弱，其具有較高的生物活性，無論對動物還是植物都具有毒性；而Cr（Ⅲ）進入土壤后一般會以沉淀形式存在，或被土壤黏粒吸附，在土壤中溶解度小、移動性差，所以能穩(wěn)定存在，是一種對人類和動物健康至關重要的微量元素[4]，卻不是植物必需營養(yǎng)元素[5]。前人對Cr（Ⅵ）的研究較多[6-7]，而對Cr（Ⅲ）研究甚少。低濃度的Cr（Ⅲ）能促進植株的生長[8]，但高濃度時對植物有劇毒[9-10]，會抑制植物發(fā)芽、根系生長、幼苗生長和發(fā)育，誘導葉片失綠等。因此，為了采取針對性的措施減輕土壤中Cr（Ⅲ）污染對植物生長發(fā)育造成的危害，有必要充分研究Cr（Ⅲ）對植物的影響。吸收是重金屬元素在植物體內(nèi)富集的第一步驟，然而，目前關于植物吸收Cr（Ⅲ）的生理機制仍不清楚[1]。Skeffington等[11]認為，Cr（Ⅲ）只是在細胞壁的陽離子交換位點被簡單地被動吸收。Barros 等[12]發(fā)現(xiàn)植物對Cr（Ⅲ）的吸收是通過滲透進行的。Shahid 等[13]指出Cr（Ⅲ）的吸收是不消耗能量的，但張學洪等[14]認為Cr超富集植株李氏禾對Cr（Ⅲ）的吸收可能存在需要能量的主動吸收過程。因此，目前對Cr（Ⅲ）進入植物根細胞內(nèi)的方式還存在爭議。根的細胞質(zhì)膜是與重金屬接觸的第一個功能結構[15]，并在金屬吸收中發(fā)揮著至關重要的作用[16]。目前人們對金屬通過何種通道進入細胞質(zhì)膜內(nèi)部有了一定的認識。一般認為，植物對非必需有毒元素的吸收是通過必需元素的吸收途徑進行的。Lindberg 等[17]對Cd2+進入小麥細胞質(zhì)膜的機制進行研究后發(fā)現(xiàn)，Cd2+的吸收受到加入的氯化鈣和氯化鉀的抑制，也受到鈣離子通道抑制劑和鉀離子通道抑制劑的抑制，說明Cd2+通過Ca2+和K+的通道被吸收。Ivashikina 等[18]利用從擬南芥根分離出的原生質(zhì)體對重金屬陽離子是否影響向內(nèi)鉀通道的活性和電流及電壓等進行研究，發(fā)現(xiàn)重金屬陽離子可以阻止向內(nèi)鉀電流的20%～70%，其阻止能力排序為：Cu2+＞Zn2+＞Sr2+＞Cd2+，由此推測，以上這些重金屬離子至少是部分通過K+通道進行吸收的。唐曉勇等[19]驗證了Fe 元素對Cr 元素的熒光有增強效應，并發(fā)現(xiàn)該增強效應還與Fe、Cr 元素的相互作用有關。Bonet 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e 的營養(yǎng)狀況可影響Cr 在植物根和地上部分的積累。Ramana等[21]認為Cr（Ⅲ）和Fe（Ⅲ）競爭根細胞膜上的吸收位點，從而使兩種離子的吸收存在拮抗效應。Liu 等[22]在Cr 超富集植物李氏禾上觀察到，Cr（Ⅲ）對Fe（Ⅲ）的吸收存在抑制作用。因此，對Cr（Ⅲ）進入細胞質(zhì)膜的途徑需要進一步論證。

鑒于此，本研究通過水培實驗，探究不同Cr（Ⅲ）濃度對玉米幼苗Cr（Ⅲ）吸收的影響，以及ATP 酶抑制劑、Ca2+通道和K+通道抑制劑、Fe（Ⅲ）是否抑制玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收，旨在探討玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收動力學特征及途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

試驗在揚州大學環(huán)境科學與工程學院養(yǎng)苗室進行，供試材料為玉米蘇玉20。玉米種子經(jīng)浸泡、催芽、發(fā)芽、生長至一葉一心時，移栽至50% Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，保持間隙通氣20 min·h-1，每3 d更新一次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液組成：Ca（NO3）2·4H2O 2.0 mmol·L-1、KNO30.5 mmol·L-1、KH2PO40.5 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 mmol·L-1、H3BO34.6×10-2mmol·L-1、CuSO4·5H2O 3.0×10-4mmol·L-1、MnSO4·4H2O 9.1×10-3mmol · L-1、ZnSO4· 7H2O 7.7 × 10-4mmol · L-1、（NH4）6Mo7O24·4H2O 7.1×10-5mmol·L-1、EDTA-Fe 7.0×10-2mmol·L-1，用0.1 mol·L-1的NaOH 或0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH至5.5左右。

1.2 試驗設計與測定內(nèi)容

1.2.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收

將在50% Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d 后的玉米幼苗移栽到水培容器中，水培容器為直徑20 cm、高48 cm 的塑料圓桶，桶上有帶7 個孔的同質(zhì)塑料圓蓋，根據(jù)文獻[14，22]及前期試驗結果[23]，本研究對玉米幼苗進行5 個濃度水平的Cr（Ⅲ）處理：0、2、5、10、20 mg·L-1（以Cr 計），Cr（Ⅲ）以CrCl3形式添加，每處理7 株，重復3 次，每3 d 換一次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液pH 值調(diào)節(jié)為5.0～5.5。處理10 d 后取出玉米幼苗，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，再將植株分為根系和地上部分，并對各部分的鮮質(zhì)量進行稱量，采用原子吸收分光光度法測定玉米根系和地上部鮮樣中Cr的含量。

1.2.2 ATP酶抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d 后的玉米幼苗移栽到裝有20%Hoagland 營養(yǎng)液的容器中預培養(yǎng)12 h，根據(jù)文獻[14，22]及前期試驗對玉米幼苗進行如下處理：①15.6 mg·L-1CrCl3（對照）；②15.6 mg·L-1CrCl3+25 μmol·L-1ATP 酶抑制劑（Na3VO4）；③15.6 mg L-1CrCl3+50 μmol·L-1ATP 酶抑制劑（Na3VO4）。24 h 后收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系Cr的含量。

1.2.3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d 后的玉米幼苗移栽到裝有20%Hoagland 營養(yǎng)液的容器中預培養(yǎng)12 h。根據(jù)文獻[14，22]及前期試驗對玉米幼苗進行如下處理：①15.6 mg·L-1CrCl3（對照）；②15.6 mg·L-1CrCl3+Ca2+通道抑制劑（1 mmol·L-1LaCl3）；③15.6 mg·L-1CrCl3+K+通道抑制劑（1 mmol·L-1C8H20CIN）。分別與4 h 和8 h 收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系Cr、Ca 的含量，采用火焰光度法測定K的含量。

1.2.4 Fe（Ⅲ）對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d 的玉米幼苗分成3組放入不同營養(yǎng)液中進行處理：①完全缺Fe的20% Hoagland 營養(yǎng)液（-Fe）；②正常的20% Hoagland營養(yǎng)液（Normal）；③在正常的20%Hoagland營養(yǎng)液中加入15 mg·L-1的FeCl3（+Fe），預培養(yǎng)48 h 后，分別將0、10、20、40、80、160 mg·L-1的CrCl3加入這3 組處理中，4 h后收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米幼苗根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系中Cr的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計方法

本文數(shù)據(jù)為3 個獨立重復的平均值±標準差（STDEV）。采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理。用SPSS 23.0軟件進行方差分析，處理間的多重比較采用Duncan 法。玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線采用Origin Pro2021 軟件模擬Michaelis-Menten 方程f=Vmax×abs（x）/[Km+abs（x）]，abs（x）為底物濃度，Vmax為玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的最大吸收速率，Km為米氏常數(shù)。

2 結果與分析

2.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學特征

玉米幼苗各部位對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線見圖1。結果表明，玉米幼苗各部位對Cr的吸收動態(tài)均符合Michaelis-Menten 模擬曲線方程f=Vmax×abs（x）/[Km+abs（x）]特征。玉米幼苗各部位對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加（圖1），對Cr（Ⅲ）吸收速率表現(xiàn)為：根系＞全株＞地上部。

圖1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線Figure 1 Kinetic curves of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedlings

表1 為玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學方程參數(shù)。Km表征離子載體與離子的親和力，Km值越大，親和力越小。結果表明，根系吸收Cr（Ⅲ）的Vmax為121.4 mg·kg-1·d-1，明顯高于地上部的16.3 mg·kg-1·d-1（P＜0.05），前者是后者的7.4倍；而根系吸收Cr（Ⅲ）的Km為12.2 mg·L-1，顯著（P＜0.05）低于地上部的180.8 mg·L-1，表明Cr（Ⅲ）與根系的親和力大于地上部。此結果說明，玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）絕大部分累積在根系，只有很少的Cr（Ⅲ）被轉(zhuǎn)移到地上部。

表1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學方程參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedlings

2.2 ATP酶抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

由圖2 可知，與對照相比，添加不同濃度的ATP酶抑制劑處理均顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對Cr 的吸收。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1ATP 酶抑制劑處理后，玉米根系中Cr 的含量較對照分別降低了29.4%和50.6%。50 μmol·L-1ATP酶抑制劑的對玉米根系吸收Cr 的抑制作用大于25 μmol·L-1ATP 酶抑制。此結果說明，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收存在主動吸收的過程。

圖2 不同ATP酶抑制劑添加濃度對玉米幼苗根系Cr吸收的影響Figure 2 Effects of ATPase inhibitor on uptake of Cr（Ⅲ）by maize seedling root

2.3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

由圖3 可知，4 h 和8 h 抑制處理下，Ca2+通道抑制劑（LaCl3）和K+通道抑制劑（C8H20CIN）均沒有顯著（P＞0.05）抑制玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收。Ca2+通道抑制劑顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對Ca2+的吸收，同樣K+通道抑制劑顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對K+的吸收（表2）。此結果表明，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與Ca2+、K+通道無關。

圖3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響Figure 3 Effects of ion channel blockers on the uptake of Cr（Ⅲ）by maize seedling root

表2 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系吸收Ca2+和K+的影響Table 2 Effects of ion channel blockers on the uptake of Ca2+and K+by maize seedling root

2.4 Fe（Ⅲ）對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）的影響

圖4 結果表明，在-Fe、Normal、+Fe 各處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加，其吸收動態(tài)均符合Michaelis-Menten 方程。Cr（Ⅲ）處理濃度為40～160 mg·L-1時，與Normal 處理相比，-Fe 處理下Cr（Ⅲ）吸收速率增加了4.0%～26.3%，但+Fe 處理下Cr（Ⅲ）吸收速率降低了15.6%～33.7%。

圖4 不同F(xiàn)e處理對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）動力學曲線Figure 4 Kinetic curves of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedling root under different Fe treatments

表3 結果表明，與Normal 處理相比，-Fe 處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax增加了20.0%，Km數(shù)值僅減少了5%，-Fe 處理促進了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，略微增加了Cr（Ⅲ）與玉米幼苗根系吸收位點的親和力，而+Fe 處理下的玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax減少了46.0%，Km數(shù)值減少了56.0%，-Fe 和+Fe處理下Vmax/Km數(shù)值基本不變。以上結果表明，F(xiàn)e（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，F(xiàn)e（Ⅲ）與Cr（Ⅲ）之間存在反競爭性的抑制關系。

表3 不同F(xiàn)e處理下玉米幼苗根系對Cr吸收的動力學方程參數(shù)Table 3 Michaelis-Menten equation constants of Cr uptake by maize seedling roots under different Fe treatments

3 討論

3.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學特征

目前，植株對Cr（Ⅲ）的吸收和分布機制仍未被完全了解[16]。Wu 等[24]研究了不同CrCl3處理濃度（0、2.5、5、10 mg·L-1）對白菜不同部位Cr 含量的影響，發(fā)現(xiàn)與白菜莖稈相比，根系Cr 含量增加了兩倍。另有研究將一些大型植物（水花生、空心蓮子草、疏螺旋體、鐵蓼和鳳眼蓮）暴露于25 mg·L-1和50 mg·L-1的CrCl3中，同樣觀察到根系中Cr 含量遠高于莖稈和葉片的現(xiàn)象，且在葉片中發(fā)現(xiàn)的Cr 含量幾乎可以忽略不計[25]。但張學洪等[14]研究發(fā)現(xiàn)，李氏禾中大約有一半的Cr 被轉(zhuǎn)移到地上部分，表明Cr 在李氏禾根部的移動性比較好，這可能與李氏禾是Cr 超富集植株有關。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度Cr（Ⅲ）（0、2、5、10、20 mg·L-1）處理10 d 后，玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收速率隨溶液中Cr（Ⅲ）濃度的變化趨勢符合Michaelis-Menten 方程，各部位對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率顯著高于地上部（圖1），且Cr（Ⅲ）與根系的親和力顯著高于地上部（表1），表明玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）絕大部分都分布在根系，從根系轉(zhuǎn)移到地上部的非常有限，這可能是因為非Cr 富集植物缺乏對Cr的轉(zhuǎn)運機制。

3.2 玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑

本研究發(fā)現(xiàn)玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）主要富集在根部，很少往地上部運輸，因此重點研究玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑，但目前植物對Cr（Ⅲ）的吸收是主動吸收還是被動吸收，一直存在爭議。ATP酶包括P 型和V 型，其中P 型ATP 酶易被Na3VO3抑制，在植物體內(nèi)廣泛存在[14]，本試驗中，在15.6 mg·L-1CrCl3處理下，不同濃度ATP 酶抑制劑均對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）有明顯的抑制作用，表明玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與能量有關，存在著主動吸收的過程，這與Skeffington 等[11]以大麥為研究對象開展的試驗結果相反，但與Liu 等[22]以李氏禾為研究對象開展的試驗結果一致。玉米植株對Cr（Ⅲ）主動吸收的方式讓其從土壤中吸收更多的Cr（Ⅲ），并在玉米根系中累積，產(chǎn)生毒害作用，從而影響玉米植株的生長發(fā)育。

由于Cr（Ⅲ）不是植物的必需營養(yǎng)元素，因此，植物對Cr（Ⅲ）的吸收可能是通過必需營養(yǎng)元素的途徑（如某些陽離子通道）進入細胞質(zhì)膜[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+和K+通道是細胞質(zhì)膜上最重要的兩個離子通道[14，26]，可以分別被Ca2+通道抑制劑與K+通道抑制劑抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種抑制劑均沒有抑制玉米幼苗根系對Cr的吸收，但明顯抑制了玉米幼苗根系對Ca2+和K+的吸收，說明玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收不是通過Ca2+通道或者K+通道實現(xiàn)的。離子通道是細胞膜上的特殊蛋白質(zhì)大分子，在脂質(zhì)雙層膜上構成具有高度選擇性的親水孔道，從而允許適當大小和適當電荷的離子通過，其對通過的離子具有一定的選擇性。玉米對Cr（Ⅲ）的吸收沒有通過Ca2+和K+通道實現(xiàn)，表明其可能是通過其他的離子通道實現(xiàn)的。Cr（Ⅲ）和Fe（Ⅲ）有著相同的價態(tài)和相似的離子半徑（分別為64 ? 和69 ?）。Bonet 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e的營養(yǎng)狀況可影響Cr 在植物根和地上部分的積累；Pandey 等[27]研究發(fā)現(xiàn)Cr 脅迫下植株葉片的Fe 含量減少約50%。Liu 等[28]發(fā)現(xiàn)，在不同濃度Cr 處理中，F(xiàn)e、Cu、Mg 和Zn 含量均有所下降。Park[29]發(fā)現(xiàn)，Cr（Ⅲ）處理降低了生菜對Fe 的吸收。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，當Cr（Ⅲ）濃度＞5 mg·L-1時，玉米幼苗葉綠素含量隨著處理濃度的升高而降低，葉片表現(xiàn)出“失綠”癥狀[23]，且隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加，玉米幼苗根系、葉片和全株的Fe 含量和累積量呈現(xiàn)下降的趨勢，這個結果說明Cr（Ⅲ）抑制了玉米幼苗對Fe 的吸收，推測玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑可能與Fe（Ⅲ）有關。因此，本研究中采用-Fe 營養(yǎng)液、正常營養(yǎng)液、+Fe 營養(yǎng)液處理玉米植株，發(fā)現(xiàn)與正常營養(yǎng)液處理相比，-Fe處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax增加了20.0%，Km數(shù)值僅減少了5%，-Fe 處理促進了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，略微增加了Cr（Ⅲ）與玉米幼苗根系吸收位點的親和力，而Fe（Ⅲ）處理下的玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax減少了46.0%，Km數(shù)值減少了56.0%，這表明Fe（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，兩者之間存在反競爭性的抑制關系（圖4、表3）。Fe（Ⅲ）究竟通過哪些關鍵因素影響了Cr（Ⅲ）的吸收速率尚不明確。因此，下一步的研究中，需明確Fe（Ⅲ）和Cr（Ⅲ）之間相互影響的深層次的生理機制，以期能為減輕Cr（Ⅲ）對植物危害的營養(yǎng)吸收的調(diào)節(jié)、對逆境環(huán)境的適應性等方面的改造提供科學參考。

4 結論

（1）玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收動態(tài)符合Michaelis-Menten 方程。根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率顯著高于地上部，Cr（Ⅲ）與根系的親合力大于地上部。

（2）玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收存在主動吸收的過程。

（3）玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與Ca2+和K+通道無關。

（4）Fe（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收，F(xiàn)e（Ⅲ）與Cr（Ⅲ）之間存在反競爭性的抑制關系。