經(jīng)濟林病害的生防菌拮抗與植物精油抑菌機理研究進展

李宗陽 原甜甜 張黨權(quán) 李明婉 賴 勇 丁 申 陳圓圓

（河南農(nóng)業(yè)大學林學院，河南 鄭州 450046）

我國是經(jīng)濟林大國，經(jīng)濟林種類、面積、產(chǎn)量和總產(chǎn)值均居世界首位[1-2]。據(jù)國家林草局發(fā)布數(shù)據(jù)，截至2021 年，全國經(jīng)濟林種植面積超過4 000 萬hm2，年產(chǎn)量超過2 億t，產(chǎn)值超過2.2 萬億元，經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)發(fā)展已涉及食品、糧油、化工、醫(yī)藥等多個領域[3-5]。近年來經(jīng)濟林病害逐年加劇，嚴重影響和制約著我國經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)健康與快速發(fā)展，生物防治因其對環(huán)境和人類健康友好而備受關注，目前采用的主要手段是生防菌劑，而植物精油是未來極具潛力的新型天然殺菌劑。本文對經(jīng)濟林病害中生防菌控制病原菌的拮抗機理及精油抑菌機理進行綜述，為經(jīng)濟林病害生物防治提供科學依據(jù)。

1 經(jīng)濟林主要病害

我國核桃、油茶、板栗、棗、蘋果、柑橘等主要經(jīng)濟林的種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。但高密度種植單一樹種和集約化經(jīng)營導致經(jīng)濟林病害日益嚴重，影響和制約了經(jīng)濟林產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。主要病害有病原真菌膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Penz.& Sacc.]引起的核桃炭疽病、油茶炭疽病、棗炭疽病、蘋果炭疽病等[6-9]；病原細菌黃單胞桿菌[Xanthomonas campestris pv.juglandis(Pierce) Dye]引起的核桃黑斑病[10]；病原真菌寄生隱叢赤殼[Cryphonectria parasitica(Murr.) Barr.]引起的板栗疫病[11]；病原真菌鏈格孢菌[Alternaria alternate(Fr.) Keissl.]引起的冬棗縮果病[12]；病原細菌亞洲柑橘黃龍病菌[Candidatus liberobacter asiaticumJagoueix et al ]引起的柑橘黃龍病[13]；病原細菌土壤桿菌 [Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Conn]引起的果樹根癌?。ㄒ卜Q冠癭?。┑萚14-15]。

傳統(tǒng)的病害防治方法包括培育抗病品種、保持田間衛(wèi)生，以及使用化學殺菌劑。然而，殺菌劑對環(huán)境和人類健康具有不良影響，因此生物防治方法日益受到人們的關注。目前，植物病害的生物防治方法主要是使用生防菌劑，已經(jīng)有許多有效的生防菌劑被發(fā)現(xiàn)并應用[16]。近年來，對低毒殺菌劑的探索開始轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)品，植物精油被推薦為最有希望抑制病原菌的天然產(chǎn)品之一，且大多數(shù)植物精油顯示出較高的生物安全性[17]。隨著品種改良、種植面積擴大、提取工藝優(yōu)化和多級化加工利用，一些植物精油的成本也有所下降，因此植物精油以其強抑菌性和生物安全性，在植物病害及采后病害的防治中展示出巨大潛力。

2 經(jīng)濟林病害的生防菌拮抗機理

2.1 生防菌概述

生防菌是用來防治植物病害的有益微生物，主要從健康植物根、莖、葉或病害等級較低的植株根際土壤中分離，可對靶標病原體產(chǎn)生抑制作用[18]。

目前，細菌、放線菌、真菌等被廣泛應用于植物病害的生物防治。細菌主要包括芽孢桿菌（Baccillus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）以及土壤桿菌（Agrobacterium）等。王捷[19]從土壤和蘋果樹葉中分離篩選出2株生物安全性高、定殖能力強、對蘋果腐爛病有一定的抑制效果的芽孢桿菌生防菌株。婁海博[20]在土壤中分離到一株熒光假單胞菌株SN15-2，對青枯勞爾氏菌有很強抑制作用，可有效防治植物青枯病的發(fā)生。魏艷麗[21]分離到的土壤桿菌K1026可通過產(chǎn)生土壤桿菌素和競爭附著位點防治櫻桃冠癭病，田間試驗表明，土壤桿菌K1026的防治效果高達81.61%。

鏈霉菌（Streptomycessp.）是最具生防價值的放線菌之一[22]。張恒等[23]從棗樹枝條中分離得到的鏈霉菌ZH-356，在盆栽和離體枝條上，不僅能預防蘋果樹離體枝條感染腐爛病，同時對患病幼苗也具有良好的防治效果。

目前，已發(fā)現(xiàn)的生防真菌有木霉（Trichodermasp.）、毛殼菌（Chaetoniumsp.）、小盾殼霉（Conithyrium minitans）、粘帚霉（Gliodadiumsp.）、無致病力尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等。趙興麗等[24]通過對峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)，鉤狀木霉菌對辣椒疫霉菌的生長抑制率高達49.8%，盆栽試驗表明，其對辣椒疫病的防治效果高達53.33%。馮镥童等[25]發(fā)現(xiàn)球毛殼菌（Chaetomium globosum）發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制率高達100%，對馬鈴薯干腐病的病斑抑制率可達53.6%。盛桂林等[26]通過室內(nèi)生物活性試驗和田間試驗探究得到小盾殼霉對稻麥紋枯病在室內(nèi)和田間的防治效果均大于90%。楊蕊等[27]通過平板對峙法、含毒介質(zhì)法以及室內(nèi)盆栽試驗法探究表明，粉紅粘帚霉對玉米莖基腐病具有良好的防治效果。肖姬玲等[28]的離體試驗和田間防效測定試驗均表明，非致病性尖孢鐮刀菌菌株F-1對草莓灰霉病具有良好的防治效果。

2.2 生防菌防治機理

2.2.1 競爭作用

競爭作用主要表現(xiàn)在生防菌與病原菌對營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的競爭。生防菌主要依靠其強大的繁殖能力、腐生能力和適應能力，迅速占領有限的生存空間，如植物表面、根系或體內(nèi)空間及土壤中主要生態(tài)位，并快速吸收大量營養(yǎng)物質(zhì)，病原菌由于生存空間匱乏或營養(yǎng)物質(zhì)缺少，生長受到抑制，甚至死亡[29-31]。范先敏[32]發(fā)現(xiàn)，菌株bd-5-1費比恩賽伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）可通過和軟腐菌競爭葡萄糖、甘氨酸等營養(yǎng)成分來抑制獼猴桃軟腐病菌的生長。

2.2.2 重寄生作用

重寄生作用的過程包括對病原菌位點的識別、接觸、纏繞、穿透和寄生等連續(xù)步驟。在此過程中，生防菌主要依靠對病原菌的攻擊和寄生來控制病害的發(fā)生和傳播，生防菌可進入病原菌菌絲內(nèi)部將其殺死[33]。柳婷婷[34]發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌株SMF2和哈茨木霉菌株T39對引起國槐根莖腐爛病的5種主要鐮刀菌的抑菌作用均表現(xiàn)為重寄生作用，二者對鐮刀菌的重寄生方式主要表現(xiàn)為侵入鐮刀菌的菌絲內(nèi)爭奪營養(yǎng)，進而抑制鐮刀菌的生長。

2.2.3 拮抗作用

兩種或多種微生物共同生長時，生防微生物通過同化作用產(chǎn)生一種或多種抗菌物質(zhì)，如抗生素和抗菌蛋白等，通過這些物質(zhì)作用于有害微生物的細胞壁、細胞膜，導致有害微生物的細胞分解，也可通過改變有害微生物的生活環(huán)境，達到抑制或殺死有害微生物的目的[35]。章樂樂等[36]通過稀釋法和平板對峙法研究發(fā)現(xiàn)，菌株RL-LL04對多種病原菌具有抑制效果，其中對膠孢炭疽菌的拮抗作用是通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機物、胞外酶等多種方式實現(xiàn)。路兆軍等[37]從蘋果植株根際土壤中分離到的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）HY-19的無菌濾液對蘋果斑點落葉病原菌有拮抗活性，其發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素是菌株具有拮抗活性的主要原因。

2.2.4 促生作用

生防微生物通過促進植株的根系和整體生長發(fā)育，提高植株的抗病能力，間接減輕或防止病害的發(fā)生。Gaiero等[38]的研究表明，植物新陳代謝受植株內(nèi)部微生物的影響，微生物可通過溶解磷、固定氮和分泌生長素（IAA）等方式促進植物生長，進而影響植株生長發(fā)育。狄佳麟等[39]篩選出4株對杉苗立枯病原真菌具有強拮抗作用的沙地云杉內(nèi)生真菌，通過發(fā)酵液浸種和灌根處理發(fā)現(xiàn)，這些內(nèi)生拮抗菌對沙地云杉的種子和幼苗均表現(xiàn)出不同程度的促生作用。

2.2.5 誘導抗性作用

植物誘導系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance,ISR）是植物在誘導因子刺激下，產(chǎn)生使植物免受或減輕病原物再侵染的一種后天免疫功能。這是由于生防菌釋放誘導因子（蛋白質(zhì)、抗生素和揮發(fā)物），誘導水楊酸途徑或茉莉酸/乙烯途徑基因的表達[40-41]。誘導系統(tǒng)抗性是對各種類型的病原菌及非生物脅迫的廣譜抗性[42]。呂前前等[43]從蘋果韌皮組織分離獲得的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株Ba A-007，對蘋果腐爛病菌有抑制作用，該菌株可以通過激活蘋果茉莉酸、水楊酸、乙烯相關的抗病基因和細胞壁相關抗病反應增強蘋果抗病性。

3 經(jīng)濟林病害的精油抑菌機理

3.1 主要植物精油

精油是由植物合成的低分子量化合物的復雜混合物，主要由萜類、苯丙類、醛類、酯類、醇類和酮類組成，具有生物活性[44]。通過對精油成分分析發(fā)現(xiàn)，萜類化合物最為豐富，這些成分及其衍生物對多種微生物具有抑制活性[45]。

目前植物精油廣泛應用于制藥、化妝品、農(nóng)林業(yè)、清潔、芳香療法和食品等領域[46-47]。精油作為抗菌劑、抗病毒藥物和抗氧化劑在保護食品安全方面發(fā)揮著重要作用。精油由于其較強的抑菌活性，在食品工業(yè)中被用作天然防腐劑，以減少或替代化學食品防腐劑[17]，極低濃度的精油即使長期使用也不會激活病原菌的耐藥機制[17]。

粗壯女貞苦丁茶精油含有的大量萜烯類化合物，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、黃曲霉、黑曲霉、青霉、啤酒酵母表現(xiàn)出很好的抑菌效果[48]。山蒼子精油、姜黃精油、柏木精油和八角茴香精油等均含有不同的抑菌成分[49]。精油對一些植物病原菌也具有較強的抑制作用。迷迭香精油對甜瓜蔓枯病菌、西瓜炭疽病菌、甜瓜灰霉病菌、甜瓜枯萎病菌、梨樹腐爛病菌、柑橘黑腐病菌、油菜菌核病菌、蠶豆輪紋病菌和桃細菌性穿孔病菌具有抑制作用[50]。陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油對蘋果腐爛病病原菌黑腐皮殼菌和蘋果斑點落葉病病原菌鏈格孢蘋果專化型菌具有抑制作用[51]。椒蒿、黃花蒿、啤酒花、茵陳蒿、香青蘭、蔞蒿和一枝蒿7種植物精油對尖孢鐮刀菌、黃色鐮孢菌、立枯絲核菌和串珠鐮刀菌4種病原菌均有一定的抑菌活性[52]。

3.2 植物精油抑菌機理

3.2.1 影響細胞壁的合成及功能

植物精油可以通過影響細胞壁成分的合成和與細胞壁緊密相關的酶類，攻破微生物細胞壁的保護屏障[53]。精油可以穿透革蘭氏陽性細菌特有的厚層肽聚糖，此類抗菌物質(zhì)可利用蛋白質(zhì)作為細菌細胞膜中的通道，抑制交聯(lián)的形成，切斷細胞壁的合成并產(chǎn)生孔隙，從而打開交流通道，使細菌出現(xiàn)裂解或死亡[54]。牛至精油主要成分香芹酚處理番木瓜采后病害病原菌沖繩炭疽菌后，病原菌細胞壁薄厚不均、壁膜間界線不清晰，菌絲體幾丁質(zhì)酶活性增強，細胞壁消解[55]。肉桂精油中的抗菌物質(zhì)肉桂醛可穿透霉菌的細胞壁，從而有效破壞細胞壁中葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成，使細胞壁功能受損，最終細胞因缺少保護性組織而衰亡[56]。

3.2.2 影響細胞膜的合成及功能

精油可以使微生物細胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，進而影響細胞膜的通透性，造成細胞質(zhì)里的一些離子和化合物從細胞中溢出[57]。精油通過以下方式攻破微生物細胞膜：1）攻擊細胞膜結(jié)構(gòu)，影響其通透性，使細胞膜受損。研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛具有親水性，易溶解在細胞膜的脂酰鏈中，破壞細胞膜外膜，增強細胞膜的通透性，使三磷酸腺苷流出，導致細胞死亡[53]。2）與磷脂分子相互作用，改變膜中脂肪酸的比例和結(jié)構(gòu)。Di等[58]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌細胞膜中脂肪酸的比例和結(jié)構(gòu)在精油處理后發(fā)生變化，降低了細胞膜的流動性。3）影響細胞膜成分的合成，例如麥角固醇。在香茅精油處理的青霉菌細胞中，膜完整性和麥角固醇含量顯著降低，而羊毛甾醇作為麥角固醇生物合成的前體大量積累，添加外源麥角固醇降低了香茅醛的抑制率，使麥角固醇含量和膜結(jié)構(gòu)恢復到正常水平[59]。4）通過下調(diào)膜孔蛋白相關基因的表達破壞細胞膜上的膜孔蛋白和氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白[53]。馬提尼精油處理可嚴重破壞黃曲霉細胞膜的完整性，通過蛋白質(zhì)組學分析，鑒定出黃曲霉1 604個膜蛋白，馬提尼精油處理破壞了58種細胞膜蛋白，釋放了157種膜蛋白[60]。5）精油還可以通過破壞β微管蛋白分布引發(fā)細胞周期停滯，導致有絲分裂紡錘體受損，最終損傷細胞膜并導致細胞成分泄漏[61]。

3.2.3 影響呼吸與能量代謝

抗菌劑可以抑制甚至阻止致病菌呼吸代謝產(chǎn)生能量。通過干擾營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運和代謝，導致致病菌的生長和繁殖受到影響[62]。當三羧酸循環(huán)中的關鍵調(diào)節(jié)酶活性受到抑制時，可破壞細胞正常的代謝周期，從而抑制微生物的正常生長。Hu等[63]研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇精油處理后黃曲霉能量代謝紊亂，防御功能受損。蛋白質(zhì)組學分析表明，紫蘇精油通過阻斷抗氧化防御過程和糖酵解途徑抑制黃曲霉生長，紫蘇精油處理后黃曲霉額外的能量產(chǎn)生途徑被激活，以補償不平衡的糖酵解。Zhao等[64]發(fā)現(xiàn)，八角茴香精油能夠降低黑曲霉的ATP含量和細胞活力，通過阻斷NAD的合成途徑抑制黑曲霉的生長，黑曲霉還激活了額外的能量產(chǎn)生途徑，如聚糖代謝，以彌補八角茴香精油處理后能量的不足。

3.2.4 影響遺傳物質(zhì)的合成與相關功能

微生物遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）的破壞會影響微生物的正常繁殖和自我復制[53]。Chung等[65]發(fā)現(xiàn)，艾蒿精油可與微生物DNA相互作用，導致DNA斷裂。芥末精油包合物對紅毛丹病原菌棘孢曲霉的抑菌機制涉及細胞結(jié)構(gòu)損傷、影響DNA和RNA合成和代謝、抑制酶活性、影響跨膜運輸能力、抑制有絲分裂、下調(diào)能量代謝水平等[66]。

3.2.5 影響生物膜功能

生物膜具有多種細胞功能[67]，生物膜基質(zhì)可以作為物理屏障，阻止藥物滲透到細菌群落中，并幫助微生物抵抗傳統(tǒng)抗生素并將其效果降至最低[68]。精油具有抗生物膜活性，其中的疏水成分滲透到細胞膜的脂質(zhì)中，減少生物膜的形成，親水成分則通過生物膜的胞外多糖基質(zhì)擴散[68]。迷迭香精油能夠顯著抑制紫色桿菌的群集運動，濃度為10‰的精油對紫色桿菌生物膜含量的抑制率為44%，并且能夠降解已形成的生物膜，10‰濃度的精油對已形成生物膜降解率達到64%[69-70]。

3.2.6 影響群體感應系統(tǒng)

群體感應（Quorum sensing, QS）系統(tǒng)是細菌之間的一種通信系統(tǒng)，該系統(tǒng)在信號分子幫助下工作，參與各種生理過程，如生物膜的形成、毒力因子的表達、次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、應激管理等[71]。目前已經(jīng)報道了幾種抑制QS的機制，包括：1）抑制信號分子合成；2）信號分子失活或降解；3）防止信號分子與其受體類似物結(jié)合；4）阻斷信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)[72]。黑胡椒精油及其主要化合物檸檬烯和石竹烯對嗜冷假單胞菌KM02的群體感應和外排泵（EP）系統(tǒng)的影響，主要為使QS自誘導物合成降低，并使蛋白水解活性和胞外多糖合成分別降低[73]。精油對微生物的作用機制主要是其疏水成分與細胞膜的磷脂雙分子層相互作用[17]，使膜的完整性喪失，導致電子傳遞鏈功能發(fā)生變化，營養(yǎng)物質(zhì)吸收、蛋白質(zhì)和核酸合成、細胞內(nèi)容物凝固、能量代謝所必需的酶受到抑制[44]，從而減少ATP的合成，改變細胞質(zhì)膜的pH梯度，抑制群體感應作用，以及破壞或失活遺傳物質(zhì)，降低細胞的代謝活性[17]。

4 結(jié)語

我國經(jīng)濟林多為純林，生態(tài)穩(wěn)定性不強，抗逆性較弱，病害容易多發(fā)頻發(fā)，不僅直接影響經(jīng)濟林的產(chǎn)量與品質(zhì)，病原菌檢疫及農(nóng)藥殘留還會極大影響我國經(jīng)濟林產(chǎn)品及衍生品的出口貿(mào)易。生物防治以其對生態(tài)環(huán)境及人類健康的安全性，在經(jīng)濟林病害防治中發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

生防菌與植物、病原菌通常有著復雜的關系，與植物相互作用的同時，也對病原菌產(chǎn)生多種抑制作用，且生防菌的防治效果受環(huán)境影響較大，這也增加了研究和生產(chǎn)應用的難度。今后，更多內(nèi)生菌資源的挖掘與篩選仍有待加強；生防菌的抑菌代謝產(chǎn)物有待進一步研究和利用；可將分子生物學及組學技術(shù)應用于生防菌抗病機制的研究，多組學分析生防菌誘導植物抗病性的機制；生防菌對病原菌的抑制效果與環(huán)境的關系仍有待挖掘。

大多數(shù)植物精油對微生物都表現(xiàn)出一定的抑制作用，生物安全性使其成為理想的生物殺菌劑，但由于以往精油價格昂貴，在病害防治方面的研究并不多。近年來，隨著迷迭香品種改良、種植面積擴大和提取工藝優(yōu)化，迷迭香精油的成本迅速大幅下降。另外，通過迷迭香的多級化加工利用，實現(xiàn)了精油、純露、鼠尾草酸提取物、迷迭香酸提取物的多產(chǎn)品開發(fā)利用，進一步降低了迷迭香精油的成本。

經(jīng)筆者團隊調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前實現(xiàn)迷迭香多級加工的部分企業(yè)，其迷迭香精油出廠價大幅降低，是其他植物精油成本的約1%，使迷迭香精油成為一種物美價廉的大宗精油商品。因此，迷迭香精油因其強抑菌性、強抗氧化、低成本在植物病害的生物防治及采后防病防腐方面具有巨大的發(fā)展前景。然而目前對精油中天然抑菌組分的化學成分分析還不夠深入，抑菌機理多集中在食品與醫(yī)藥方面，對于病害防治方面的應用有待進一步探索研究。