高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)中氨基酸的含量

全迎新, 鄧代武, 金彪, 金東日

( 1.延邊大學(xué) 理學(xué)院, 吉林 延吉 133002; 2.延邊大學(xué) 分析測試中心, 吉林 延吉 133002 )

0 引言

氨基酸是人體蛋白質(zhì)的主要組成部分,具有促進(jìn)大腦發(fā)育、防止細(xì)胞退化等生理功能[1].研究顯示,人體缺乏氨基酸會引發(fā)多種疾病[2].復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)含有8種人體必需氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)和11種維生素,對促進(jìn)營養(yǎng)組織細(xì)胞生長和由氨基酸缺乏導(dǎo)致的蛋白質(zhì)合成障礙等具有良好的改善效果[3].目前,測定氨基酸的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、薄層色譜法(TLC)[5]、毛細(xì)管電泳法(CE)[6]等,其中HPLC因具有靈敏度高和適用范圍廣等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[7].但由于氨基酸具有極性高、揮發(fā)性低以及大部分氨基酸不具有生色基團(tuán)的特性,因此對其分離和檢測存在一定困難[8].目前,一般采用衍生化試劑對氨基酸進(jìn)行衍生化來提高其檢測靈敏度,通常使用的衍生化試劑主要有異硫氰酸苯酯[9-10]、鄰苯二甲醛[11-12]、2,4-二硝基氟苯[13-14]等.其中2,4-二硝基氟苯也稱為桑格(Sanger)試劑,目前已被用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸[15-16].2020年,鄧紅英等[8]采用桑格試劑測定了復(fù)方氨基酸注射液中的氨基酸含量,但由于該衍生化試劑存在副產(chǎn)物干擾較強(qiáng)等問題而限制了其在氨基酸分析中的應(yīng)用.為此,本文采用類桑格試劑1-(5-氟-2,4-二硝基-苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)作為衍生化試劑,并以此建立了一種測定氨基酸含量的柱前衍生化的高效液相色譜法.

1 實驗部分

1.1 儀器

SPD-16高效液相色譜儀,島津公司;AV-300超導(dǎo)核磁共振儀,布魯克公司;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司;N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器制造有限公司;XW-80旋渦混合器,上海馳唐電子有限公司;HB-100恒溫金屬浴,杭州大和熱磁電子有限公司;TGL-15B離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;0.46 μm有機(jī)相微孔濾膜,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;pH值測試儀、電子天平,上海奧豪斯儀器有限公司.

1.2 材料

乙腈(分析純),上海安譜科技實驗科技股份有限公司;碳酸氫銨(分析純),上海斯信生物科技有限公司;甲醇(色譜級)、甲酸(色譜級),北京伊諾凱試劑有限公司;纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸:均為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;亮氨酸(分析純),上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司;色氨酸(分析純),上海吉爾生化有限公司;二氯甲烷(分析純),大茂化學(xué)試劑科技有限公司;N-甲基哌嗪(分析純),上海TCI化學(xué)試劑有限公司;1,5-二氟-2,4-二硝基苯(分析純),東京化成工業(yè)株式會社;硅膠(37～48 μm),青島海洋化工廠分廠;聚丙烯離心管,上?？七M(jìn)生物技術(shù)有限公司;復(fù)方氨基酸膠囊(8-11),深圳萬和制藥有限公司;移液槍,德國普蘭德有限公司.

1.3 衍生化試劑PPZ的合成及表征

本文按照文獻(xiàn)[17]的方法合成衍生化試劑PPZ.在含有1 mL乙腈的圓底燒瓶中加入1,5-二氟-2,4-二硝基苯(100 mg,0.5 mmol),然后在攪拌下逐滴加入28 μL(0.3 mmol)的N-甲基哌嗪;室溫下攪拌30 min,柱層析洗脫濃縮物(洗脫液為二氯甲烷和甲醇混合液(體積比為20∶1))后去溶劑得黃色固體60.5 mg,產(chǎn)率為71%.ESI-MS:m/z285[M+H]+.1H NMR(300 MHz,CDCl3),2.37(s,3H),2.59(t,J=6.0 Hz,4H),3.29(t,J=6.0 Hz,4H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H),8.71(d,J=9.0 Hz,1H).13C NMR(75 MHz,CD3OD),158.3(d,J=159.8 Hz),150.2(d,J=7.5 Hz),134.4,127.4(d,J=5.3 Hz),126.5,107.7(d,J=15.8 Hz),53.8,49.7,44.5.

1.4 溶液的配制

衍生化試劑:稱取28.4 mg的PPZ置于10 mL的容量瓶中,加入乙腈和水的混合溶液(體積比為22∶78)將其溶解并定容至10 mL,由此得到10 mmol/L的PPZ標(biāo)準(zhǔn)溶液.

標(biāo)準(zhǔn)對照溶液:首先分別稱取13.1 mg亮氨酸(Leu)、13.1 mg異亮氨酸(Ile)、20.4 mg色氨酸(Trp)、11.7 mg纈氨酸(Val)、14.9 mg甲硫氨酸(Met)、16.5 mg苯丙氨酸(Phe)、11.9 mg蘇氨酸(Thr)、14.6 mg賴氨酸(Lys)置于10 mL的容量瓶中,然后分別用乙腈和水的混合溶液(體積比為22∶78)將其稀釋至10 mL,由此得到8種10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液.

分別取上述Lys、Thr、Trp、Phe、Val、Met、Leu、Ile標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL置于聚丙烯管,然后再加入20 μL乙腈和水的混合溶液(體積比為22∶78),由此得到1 mmol/L的8種混合標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液.

供試品溶液:取復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)1粒(0.35 g/粒),將內(nèi)容物傾出后研磨成細(xì)粉;稱取0.175 g細(xì)粉置于100 mL容量瓶內(nèi),加入適量乙腈和水的混合溶液(體積比為22∶78)后超聲20 min使其溶解,并定容至刻度;離心15 min(8000 r/min),上清液用0.46 μm的微孔濾膜過濾,所得溶液即為供試品溶液.

緩沖溶液:稱取碳酸氫銨1 mmol置于100 mL容量瓶內(nèi),用超純水將其定容至100 mL后即得pH為8.49的碳酸氫銨緩沖溶液.

上述所有溶液均在4 ℃下密封保存.

1.5 通用衍生化反應(yīng)

分別取1 mmol/L的氨基酸(10 μL)、碳酸氫銨緩沖溶液(25 μL)和10 mmol/L的衍生化試劑PPZ(10 μL)置于1.5 mL的聚丙烯管中,用旋渦混合器振蕩1 min后將試管放入恒溫(40 ℃)金屬浴裝置內(nèi)反應(yīng)3 h.

1.6 色譜條件

色譜柱為Mightysil RP-18 GP(3 μm,150 mm×4.6 mm);流動相為甲醇和水的混合液(甲醇和水的體積比為1∶1,且混合液中含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸);流速為0.3 mL/min;柱溫為25 ℃;UV檢測波長為354 nm;進(jìn)樣體積為2 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)的條件

圖1為PPZ與氨基酸的反應(yīng)式.在堿性條件下,氨基酸α-氨基的N端攻擊PPZ的含氟碳,由此生成穩(wěn)定的氨基酸衍生物.本文以Trp、Thr和Met來探究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和反應(yīng)摩爾比對該衍生化反應(yīng)的影響.

圖1 PPZ與氨基酸的反應(yīng)式

2.1.1反應(yīng)時間的確定

在反應(yīng)溫度為40 ℃、氨基酸與衍生化試劑的摩爾比為1∶10的條件下,選取不同的反應(yīng)時間(分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 h)對Trp、Thr和Met的衍生化反應(yīng)進(jìn)行考察.由圖2可以看出,當(dāng)反應(yīng)時間為3 h時衍生化產(chǎn)物的收率最大,因此本文確定最佳反應(yīng)時間為3 h.

圖2 反應(yīng)時間對衍生化反應(yīng)的影響

2.1.2反應(yīng)溫度的確定

在反應(yīng)時間為3 h,氨基酸與衍生化試劑的摩爾比為1∶10的條件下,選取不同的反應(yīng)溫度(分別為25、30、35、40、45 ℃)對Trp、Thr和Met的衍生化反應(yīng)進(jìn)行考察.由圖3可以看出,在40 ℃下衍生化產(chǎn)物的收率最大,因此本文確定最佳反應(yīng)溫度為40 ℃.

圖3 反應(yīng)溫度對衍生化反應(yīng)的影響

2.1.3反應(yīng)摩爾比的確定

在反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)時間為3 h的條件下,選取不同濃度的衍生化試劑(2、5、10、20、30 mmol/L)與Trp、Thr和Met(1 mmol/L)分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)(氨基酸與衍生化試劑的摩爾比分別為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30).由圖4可以看出,當(dāng)氨基酸與衍生化試劑的摩爾比為1∶10時衍生化產(chǎn)物的收率最大,因此本文確定最佳反應(yīng)摩爾比為1∶10.

圖4 反應(yīng)摩爾比對衍生化反應(yīng)的影響

2.1.4色譜分離條件的確定

根據(jù)優(yōu)化的衍生化反應(yīng)條件對8種標(biāo)準(zhǔn)混合氨基酸衍生物進(jìn)行了HPLC分析,結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出,當(dāng)流動相中的甲醇和水的體積比為1∶1時,8種氨基酸的分離效果最好.

2.1.5線性關(guān)系與檢出限

根據(jù)優(yōu)化的衍生化反應(yīng)和色譜分離條件,在0.5～1000μmol/L的濃度范圍內(nèi)對8種氨基酸進(jìn)行了衍生化反應(yīng).以氨基酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),以對應(yīng)的衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),得到了8種氨基酸的工作曲線、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(LOD),見表1.本文以各組分信噪比滿足3∶1為檢出限.

1為Lys-PPZ, 2為PPZ, 3為Thr-PPZ, 4為Trp-PPZ, 5為Met-PPZ, 6為Val-PPZ, 7為Phe-PPZ,8為Ile-PPZ, 9為Leu-PPZ圖5 8種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物的HPLC圖

表1 8種氨基酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和最低檢測限

2.2 復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)的HPLC分析

根據(jù)優(yōu)化的衍生化反應(yīng)和色譜分離條件對復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)中的8種氨基酸衍生物進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果見圖6.由圖6可以看出,當(dāng)流動相中的甲醇和水的體積比為1∶1時,8種氨基酸的分離效果最好.

1為Lys-PPZ, 2為PPZ, 3為Thr-PPZ, 4為Trp-PPZ, 5為Met-PPZ, 6為Val-PPZ, 7為Phe-PPZ,8為Ile-PPZ, 9為Leu-PPZ圖6 復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)衍生物的HPLC圖

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1樣品含量的測定及重復(fù)性試驗

根據(jù)優(yōu)化的衍生化反應(yīng)和色譜分離條件對復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)中的8種氨基酸衍生物進(jìn)行HPLC分析,平行3次,并計算復(fù)方氨基酸膠囊樣品中各氨基酸的質(zhì)量,結(jié)果見表2.由表2可以看出,測定結(jié)果的RSD為0.18%～0.65%,這表明本文方法的重復(fù)性良好.

表2 膠囊中8種氨基酸的含量及重復(fù)性測定結(jié)果

2.3.2加標(biāo)回收試驗

取1.4中配制的供試品溶液6份(每份10 μL)置于聚丙烯管中,并分成2組(每組3份);在各組中分別加入1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液10、50 μL,然后將其定容至100 μL(加標(biāo)量分別為0.1、0.5 mmol/L).根據(jù)優(yōu)化的衍生化反應(yīng)和色譜分離條件測定各氨基酸的色譜峰面積,并根據(jù)峰面積的變化計算回收率(結(jié)果見表3).由表3可知,8種氨基酸的加標(biāo)平均回收率為90.0%～104.3%,其RSD為0.57%～2.29%.上述結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度.

表3 加標(biāo)回收率(n=6) %

3 結(jié)論

利用本文建立的PPZ柱前衍生化HPLC法對復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)中的8種氨基酸含量進(jìn)行測定顯示,該方法具有重現(xiàn)性好、檢出限低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點,因此該方法可為檢測藥物中的氨基酸提供參考.在本文研究中,衍生化試劑存在衍生化時間較長的缺點,因此在今后的研究中我們將探討如何優(yōu)化衍生化試劑以提高本文方法的適用性.