秀珍菇多肽的制備及其抗氧化活性

武少蘭, 張芳藝, 羅小芳, 李昕霖, 吳敏文, 鄭舒桓, 楊成龍, 江玉姬

(1.福建農林大學食品科學學院,福建 福州 350002;2.福建省食用菌技術推廣總站,福建 福州 350003;3.福州市農業(yè)局,福建 福州350025;4.福建省農業(yè)科學院農業(yè)工程技術研究所,福建 福州 350001)

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)又稱小平菇和姬菇,在我國福建、廣東、山西、黑龍江和吉林等省份大量栽培[1-2].秀珍菇外形美觀、營養(yǎng)豐富、口感柔和、香味濃郁[3],富含蛋白質和多糖, 還含有黃酮、多酚和多種微量元素[4],具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用[2].呂建敏等[5]研究表明,秀珍菇對H22荷瘤小鼠模型腫瘤抑制率達到48.80%;Song et al[6-7]研究表明,秀珍菇菌絲體多糖對大鼠急性酒精性肝損傷具有降低脂質堆積和炎癥因子的作用.目前,秀珍菇主要是新鮮銷售,品種單一,產業(yè)鏈短,需要開發(fā)深加工產品.秀珍菇含有大量的蛋白質,約占干菇的30%,然而一直以來的研究對象主要是秀珍菇多糖,對秀珍菇蛋白質的研究很少.

多肽作為一種生物活性物質,具有抗氧化、消炎、降血糖、抑菌和抗腫瘤的作用[8-9],目前,香菇、杏鮑菇、蛹蟲草和竹蓀等食用菌中的多肽及其抗氧化性已有報道[10-11],但秀珍菇多肽還沒有相關的報道.據此,本研究先提取秀珍菇的蛋白質,再通過酶解蛋白質制備多肽,并測定多肽的抗氧化能力,旨在為研究秀珍菇多肽的生理功能,開發(fā)秀珍菇的深加工產品,拓展秀珍菇的產業(yè)鏈提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 新鮮秀珍菇購于福建省漳州市新發(fā)生物科技有限公司.

1.1.2 試劑 超低分子質量(3.3～20.1 ku)預染蛋白質Marker購于北京Solarbio公司;LabPAGE預制膠(20%)購于北京蘭博利德商貿公司;堿性蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶購于上海源葉生物有限公司;甲醇、冰乙酸、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過硫酸鉀、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)等購于國藥集團.

1.1.3 儀器設備 主要儀器設備有L-8900氨基酸自動分析儀[天美(中國)科學儀器有限公司]、R205旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)、DL-5-B離心機(廈門精藝興業(yè)科技有限公司)、LGJ-12真空冷凍干燥機(北京松源有限公司)、DYY-12C電泳儀(北京六一儀器廠)、SpectraMaxi 3X功能酶標儀(美國Molecular Devices公司).

1.2 秀珍菇蛋白質的提取

秀珍菇于50 ℃恒溫烘干粉碎后過60目篩.稱取一定量的秀珍菇粉末放入燒杯中,按照1∶40(g∶mL)的料液比加入蒸餾水并用1 mol·L-1NaOH調節(jié)pH至11,于55 ℃水浴提取4 h后,再于4 500 r·min-1離心10 min.取上清液,用1 mol·L-1HCl調節(jié)pH至5.8,于冰箱放置12 h,再于4 500 r·min-1離心10 min.收集蛋白質沉淀,冷凍干燥后即為秀珍菇蛋白質,經過考馬斯亮藍測得提取的蛋白質質量分數為674 mg·g-1.

1.3 秀珍菇多肽制備流程

1.4 秀珍菇多肽最佳酶解工藝參數的確定

1.4.1 單因素試驗 蛋白質在酶解的過程中受料液比、酶的種類、酶濃度、時間、溫度和pH等因素的影響[12].因此,考察酶的種類(復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶)、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)]、酶濃度(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U·g-1)、時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、溫度(45、50、55、60、65、70 ℃)和pH(8、9、10、11、12、13)對秀珍菇多肽得率的影響,分別進行單因素試驗,以確定最佳的因素水平.

1.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上,以pH、酶濃度、溫度、時間4個因素為自變量,以多肽得率為指標,篩選最佳的提取條件.設計的5因素4水平正交試驗如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表

1.5 秀珍菇多肽得率的測定

采用雙縮脲法測定,參考周燕芳等[13]的方法配制雙縮脲試劑.準確稱取10 g酪蛋白,用蒸餾水配制質量濃度為10 mg·mL-1的母液.取7個試管,分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酪蛋白母液,加水至1 mL,搖勻,每管再加入4 mL雙縮脲試劑充分混合,于室溫下放置30 min,再于540 nm波長處檢測各樣品的光密度(D).以多肽含量為x軸,D540 nm為y軸,繪制的標準曲線方程為:y=0.047 9x+0.070 1(R2=0.999).

制備好的秀珍菇多肽液以1∶1的體積比加入質量分數為15%的TCA,充分混勻靜置30 min后,于5 000 r·min-1離心10 min.取1 mL上清液,加入4 mL雙縮脲試劑混勻靜置30 min后,在 540 nm波長處測定D值.根據標準曲線方程(y=0.047 9x+0.070 1)計算多肽含量(秀珍菇蛋白質酶解前多肽的質量分數為11.2%).

多肽得率/%=(酶解后的多肽含量×稀釋倍數-酶解前的多肽含量×稀釋倍數)/總蛋白質含量×100

1.6 秀珍菇多肽指標的測定

1.6.1 抗氧化能力的測定 秀珍菇多肽對DPPH自由基的清除能力按Latorres et al[14]的方法測定,對羥基自由基的清除能力按齊希光等[15]的方法測定,對ABTS+自由基的清除能力按王榮等[16]的方法測定.

自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為樣品溶液的D540 nm,Aj為樣品參比溶液的D540 nm,A0為空白溶液的D540 nm.

1.6.2 分子質量的測定 采用SDS-PAGE檢測秀珍菇多肽的分子質量.電泳時選擇20%預制膠,1 mg·mL-1待測樣品用上樣緩沖溶液(含100 mg SDS、0.1 mg羥基乙醇、1 mL甘油、2 mg溴酚藍、0.5 mL磷酸緩沖液,加雙蒸水至10 mL)溶解,電泳前沸水浴5 min,離心取上清液.上樣量為15 μL,電泳于恒壓100 V下進行.用0.25%考馬斯亮藍R-250進行凝膠染色,脫色液中甲醇、冰醋酸、水的體積比為4∶1∶5[17].凝膠染色和脫色后進行拍照.

1.6.3 基本組分和氨基酸組成的測定 秀珍菇多肽中的蛋白質、灰分、水分等基本組分含量及氨基酸組成由福建省農業(yè)科學院測試中心測定.

1.7 數據處理

試驗數據采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析.

2 結果與分析

2.1 秀珍菇蛋白質酶解制備多肽的單因素試驗結果

2.1.1 蛋白酶種類和酶解時間對秀珍菇多肽得率的影響 在料液比為1∶30(g∶mL)和酶濃度為6 000 U·g-1的條件下,分別加入復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶,在各自最適的酶解條件下酶解1、2、3、4、5 h,制備秀珍菇多肽,測定多肽得率.由圖1可知,采用堿性蛋白酶制備的多肽得率明顯高于其他5種酶,且酶解時間為1～2 h時,多肽得率隨著酶解時間的增加而增大,但酶解時間繼續(xù)延長時多肽得率有所減少.采用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶制備的多肽得率最低,采用胰蛋白酶、復合蛋白酶和中性蛋白酶制備的多肽得率較低.因堿性蛋白酶酶解1～5 h時制備的多肽得率為53.25%～56.49%,變化幅度較小,故選取0～3 h進行進一步試驗.

圖1 蛋白酶種類和酶解時間對秀珍菇多肽得率的影響

2.1.2 料液比對秀珍菇多肽得率的影響 以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)的料液比添加6 000 U·g-1堿性蛋白酶,在pH為10、溫度為55 ℃的水浴條件下反應2 h,制備秀珍菇多肽,測定多肽得率.由圖2A可知,隨著料液比的不斷增大,多肽得率顯著上升,表明底物與酶充分接觸,多肽得率增大.料液比為1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)時的多肽得率分別為52.34%、54.47%、55.72%,即料液比高于1∶30(g∶mL)時,隨著料液比的增大,多肽得率增加速度變緩,且料液比增大,后續(xù)蒸發(fā)濃縮難度加大,因此選擇1∶30(g∶mL)為最佳料液比.

2.1.3 堿性蛋白酶濃度對秀珍菇多肽得率的影響 由圖2B可知,堿性蛋白酶濃度對秀珍菇多肽得率的影響明顯.堿性蛋白酶濃度為2 000～6 000 U·g-1時,多肽得率隨著蛋白酶濃度的增加而增大;堿性蛋白酶濃度為6 000～8 000 U·g-1時,多肽得率變化不明顯;當堿性蛋白酶濃度大于8 000 U·g-1時,多肽得率顯著下降.堿性蛋白酶濃度為2 000～6 000 U·g-1時,由于底物充足,蛋白酶含量較少,多肽得率會隨著蛋白酶濃度的增加而逐漸增大;當堿性蛋白酶濃度為6 000 U·g-1時,多肽得率最大,達到52.74%;但繼續(xù)增加蛋白酶濃度時,由于底物不足,多肽得率不再增大[18].因此選擇6 000 U·g-1作為最佳堿性蛋白酶濃度.

2.1.4 pH對秀珍菇多肽得率的影響 由圖2C可知,隨著pH的升高,秀珍菇多肽得率呈先增加后減少的趨勢.pH為11時,多肽得率為55.55%,這時蛋白酶的活性較高,多肽得率達到最高點;隨著pH進一步加大,蛋白酶會逐漸失去活性.因此選擇11為最佳pH.

2.1.5 酶解時間對秀珍菇多肽得率的影響 由圖2D可知,隨著酶解時間的延長,秀珍菇多肽得率呈先增大后減小的趨勢.酶解1.5 h時,多肽得率最大,為58.39%;但隨著反應的繼續(xù),多肽得率逐漸下降.這可能是隨著酶解時間的增加,底物蛋白質被完全酶解,多肽含量不再增大,長時間的浸提甚至會導致一些肽鍵斷裂,從而影響多肽得率[19].因此選擇1.5 h為最佳酶解時間.

2.1.6 酶解溫度對秀珍菇多肽得率的影響 由圖2E可知,在一定的溫度范圍內,隨著酶解溫度的升高,秀珍菇多肽得率呈先增大后減小的趨勢.當酶解溫度為60 ℃時,多肽得率達到最大值,為63.62%;當酶解溫度超過60 ℃時,多肽得率呈下降趨勢.可見,在酶解過程中,適當升高溫度可以提高酶活性,促進蛋白質水解,但溫度過高,酶蛋白開始變性,酶解的效率就會下降[20].因此選擇60 ℃為最佳酶解溫度.

A:料液比;B:堿性蛋白酶濃度;C:pH;D:時間;E:溫度[不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)].

2.2 秀珍菇蛋白質酶解制備多肽的正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上,料液比恒定為1∶30(g∶mL)的條件下,以多肽得率為指標對秀珍菇蛋白質酶解制備多肽的條件進行優(yōu)化.正交試驗結果(表2)顯示,4個因素對秀珍菇多肽得率影響程度為:A>D>C>B,最佳條件組合為A3B3C2D3,即pH 11,堿性蛋白酶濃度6 000 U·g-1,溫度55 ℃,時間1.5 h.

表2 正交試驗結果

正交試驗方差分析結果(表3)顯示,pH(A)對秀珍菇多肽得率的影響極顯著,酶解時間(D)、酶解溫度(C)和堿性蛋白酶濃度(B)對多肽得率的影響顯著.采用最佳工藝制備秀珍菇多肽,多肽得率3次測定的平均值為70.96%.

表3 正交試驗方差分析結果1)

2.3 秀珍菇多肽的抗氧化能力

2.3.1 對羥基自由基的清除率 羥基是一種非?；钴S的自由基,具有很強的侵略性,被認為是最有毒的活性氧自由基,可以對生物造成過氧化破壞[21].從圖3A可知,秀珍菇多肽對羥基自由基有很強的清除能力,且與多肽含量呈正相關.當秀珍菇多肽的質量濃度為2.5 mg·mL-1時,對羥基自由基的清除率達到98.84%,略低于同含量VC的清除率,高于采用杏鮑菇柄[22]、蛹蟲草[23]和猴頭菇[24]制備的多肽對羥基自由基的清除率.

2.3.2 對DPPH自由基的清除率 DPPH自由基是一種脂質自由基的模型化合物,是評估自由基清除活性的關鍵指標之一[25].從圖3B可知,隨著秀珍菇多肽含量的增加,對DPPH自由基的清除能力也逐漸增大.當秀珍菇多肽的質量濃度為2.5 mg·mL-1時,對DPPH自由基的清除率達到81.57%,低于同含量VC的清除率,與采用杏鮑菇柄[22]、蛹蟲草[23]和猴頭菇[24]制備的多肽對DPPH自由基的清除率相當.

2.3.3 對ABTS+自由基的清除率 ABTS+是一種人工合成的自由基,結構更穩(wěn)定,操作更方便.從圖3C可知,秀珍菇多肽的質量濃度為2.5 mg·mL-1時,對ABTS+自由基的清除率達到99.81%,接近同含量VC的清除率,高于采用鯽魚[26]和鹿角[27]制備的多肽對ABTS+自由基的清除率.

圖3 秀珍菇多肽對羥(A)、DPPH(B)和ABTS+(C)自由基的清除率

2.4 秀珍菇多肽的分子質量

SDS-PAGE檢測結果(圖4)顯示,秀珍菇多肽2份樣品A1、A2的最大分子質量約為5.8 ku.劉思杉等[28]研究表明,秀珍菇蛋白質的分子質量為32.4～40.3 ku.表明秀珍菇蛋白質經過酶解后,其分子質量降低80%左右.

M:3.3～20.1 ku超低分子質量預染蛋白質Marker;A1、A2:秀珍菇多肽.

2.5 秀珍菇多肽的基本組分及氨基酸組成

采用最佳工藝制備的秀珍菇多肽含74.6%蛋白質、11.8%灰分、8.5%水分、5.1%其他成分.

秀珍菇多肽富含17種氨基酸,其中,天門冬氨酸占比10.46%,蘇氨酸占比5.20%,絲氨酸占比4.85%,谷氨酸占比14.51%,甘氨酸占比5.08%,丙氨酸占比6.95%,胱氨酸占比0.70%,纈氨酸占比6.35%,蛋氨酸占比3.02%,異亮氨酸占比5.36%,亮氨酸占比8.39%,酪氨酸占比4.00%,苯丙氨酸占比5.04%,賴氨酸占比7.33%,組氨酸占比2.55%,精氨酸占比6.18%,脯氨酸占比4.03%.秀珍菇多肽包含纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸8種必需氨基酸,必需氨基酸占氨基酸總量的43.24%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為76.18%,符合聯合國糧農組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)對優(yōu)質蛋白質的要求.谷氨酸(14.51%)和天門冬氨酸(10.46%)是秀珍菇多肽中最豐富的氨基酸.研究表明:谷氨酸、天門冬氨酸與抗氧化能力呈正相關[29];也是中樞神經系統(tǒng)中重要的興奮性神經遞質,是哺乳動物腸道細胞中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的重要來源,并可以通過脫羧和轉氨轉化為其他營養(yǎng)物質,在體內發(fā)揮作用[30].由此可知秀珍菇多肽的營養(yǎng)價值較高.

3 結論

秀珍菇多肽最佳酶解工藝參數為:pH 11、堿性蛋白酶濃度6 000 U·g-1、溫度55 ℃、時間1.5 h;采用最佳酶解工藝制備的秀珍菇多肽得率為70.96%,其分子質量最大,約為5.8 ku;秀珍菇多肽抗氧化能力強,2.5 mg·mL-1多肽對DPPH、ABTS+和羥基自由基的清除率分別達到81.57%、99.81%、98.84%.本研究結果可為后續(xù)將秀珍菇多肽開發(fā)為功能性食品和藥品提供參考.