牛源無乳鏈球菌對(duì)喹諾酮耐藥的基因特征

孟肖瀟, 吳建勇, 洪都孜·波拉提, 李建軍, 古努爾·吐爾遜, 努爾拜合提·努爾旦, 楊學(xué)云

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆 烏魯木齊 830010)

乳腺炎是奶牛常見多發(fā)病,也是影響奶牛產(chǎn)奶性能的重要病因[1],無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是引起奶牛乳腺炎的重要機(jī)會(huì)性致病菌,在世界各地廣泛流行[2].無乳鏈球菌傳播易受衛(wèi)生條件和環(huán)境因素影響,在20世紀(jì)20年代,90%的奶牛乳腺炎由無乳鏈球菌引起[3].隨著飼養(yǎng)條件的改善和抗菌藥物的使用,當(dāng)前北美地區(qū)無乳鏈球菌性奶牛乳腺炎所占比例已不足5%[2];而在我國(guó),乳腺炎奶樣中無乳鏈球菌的檢出率仍高達(dá)14%～20%[4-6],在奶牛場(chǎng)大罐奶中的檢出率甚至超過90%[7].據(jù)統(tǒng)計(jì),鏈球菌性奶牛乳腺炎可導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降3.7%～6.6%[8],給我國(guó)奶牛場(chǎng)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.

目前國(guó)內(nèi)沒有無乳鏈球菌性奶牛乳腺炎疫苗,獸醫(yī)臨床上一般采用抗菌藥物對(duì)其進(jìn)行治療,其中,喹諾酮類藥物是獸醫(yī)臨床上常用的治療奶牛乳腺炎的抗菌藥物[9],這促使無乳鏈球菌在喹諾酮類藥物選擇壓力下獲得耐該類藥物的能力.早在2003年日本就首次報(bào)道了喹諾酮耐藥無乳鏈球菌[10],此后無乳鏈球菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[11],一定程度影響了奶牛乳腺炎的臨床治療效果.因此對(duì)無乳鏈球菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)是保障臨床乳腺炎治療效果的重要手段.

研究表明,喹諾酮耐藥無乳鏈球菌主要通過DNA解旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region, QRDR)突變、攜帶耐藥基因質(zhì)粒的橫向轉(zhuǎn)移以及非特異的多重藥物外排泵等耐藥機(jī)制實(shí)現(xiàn)[12].其中,QRDR基因突變所引起的喹諾酮耐藥性較為常見.喹諾酮類抗菌藥物通過結(jié)合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ),干擾細(xì)菌基因組DNA復(fù)制進(jìn)而抑制細(xì)菌增殖,以達(dá)到控制細(xì)菌感染的目的.DNA解旋酶由2個(gè)GyrA和2個(gè)GyrB亞基組成,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ由2個(gè)ParC和2個(gè)ParE亞基組成,4種亞基中的QRDR可發(fā)生基因突變,不同突變對(duì)喹諾酮耐藥性的影響不同.目前發(fā)現(xiàn)喹諾酮耐藥人源無乳鏈球菌中GyrA的第81位氨基酸和ParC的第79位氨基酸發(fā)生突變最為常見[13-14],而牛源無乳鏈球菌耐藥機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少.據(jù)此,本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的110株奶牛隱性乳腺炎無乳鏈球菌進(jìn)行喹諾酮類藥物敏感性試驗(yàn)及QRDR基因檢測(cè),調(diào)查了解牛源無乳鏈球菌對(duì)喹諾酮耐藥的基因特征,旨在為無乳鏈球菌性奶牛乳腺炎的臨床治療提供參考資料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 110株無乳鏈球菌由本實(shí)驗(yàn)室保存,于2014—2017年分離自中國(guó)10省區(qū)21個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的隱性乳腺炎奶樣[4],其中,新疆49株、內(nèi)蒙古18株、四川11株、山東8株、遼寧8株、河南4株、浙江4株、陜西4株、山西3株、海南1株.質(zhì)控菌株為無乳鏈球菌ATCC27956.

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、2×TaqPlus PCR MasterMix購(gòu)自北京天根公司;左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;高分辨率瓊脂糖-1000購(gòu)自Life Technologies公司;CAMHB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博公司;常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 藥敏試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株和質(zhì)控菌株分別劃線接種于改良的格拉納達(dá)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36～48 h[15],挑取單菌落接種于含50 mL·L-1裂解馬血的CAMHB液體培養(yǎng)基中,采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[16]檢測(cè)左氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)110株無乳鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC).在該檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中,無乳鏈球菌對(duì)左氧氟沙星的MIC≤2 μg·mL-1為敏感菌株,2 μg·mL-116 μg·mL-1.

1.3 QRDR基因的檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA 的提取 將無乳鏈球菌接種于改良的格拉納達(dá)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36～48 h,挑選單菌落接種至5 mL TSB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)24 h后采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取無乳鏈球菌基因組DNA.

1.3.2 QRDR基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 參考文獻(xiàn)[13]的方法設(shè)計(jì)無乳鏈球菌gyrA、gyrB、parC和parE基因的特異性引物(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并交由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫上的NC004116序列進(jìn)行比對(duì)以確定其突變位點(diǎn).

表1 QRDR基因PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

左氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)110株奶牛隱性乳腺炎無乳鏈球菌的MIC50分別為16、32、32 μg·mL-1,MIC90分別為16、32、64 μg·mL-1,耐藥率分別為85.5%、98.2%、94.5%(表2).

表2 不同省份(自治區(qū))喹諾酮耐藥性無乳鏈球菌的檢出率

2.2 QRDR基因檢測(cè)情況

110株奶牛隱性乳腺炎無乳鏈球菌均成功擴(kuò)增出gyrA、gyrB、parC和parE基因,測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫上的NC004116序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),存在GyrA(Ser81Leu)、GyrA(Glu85Lys)、GyrB(Val498Ala)、ParC(Asp83Tyr)、ParC(Ser79Phe)、ParE(Asp437Asn)、ParE(Ile503Val)7種突變.所有供試菌株和參考菌株2603V/R(GenBank序列號(hào):NC004116)對(duì)比均存在GyrB(Val498Ala)和ParE(Ile503Val)突變,表明該突變與喹諾酮耐藥性可能無關(guān),在后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析中不予考慮.通過統(tǒng)計(jì)GyrA、ParC和ParE的突變類型,在110株菌株中,89.1%(98/110)菌株發(fā)生QRDR基因突變,共存在6種突變類型(表3).其中,GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn)為最主要的突變類型,占比72.7%.ParC的Asp83Tyr和Ser79Phe突變類型對(duì)左氧氟沙星敏感,但對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥.GyrA(Ser81Leu)、GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn)、GyrA(Ser81Leu)+ParC(Ser79Phe)、GyrA(Glu85Lys)+ParC(Ser79Phe)4種突變類型對(duì)3種喹諾酮類藥物均耐藥.

表3 菌株基因突變類型與喹諾酮類藥物耐藥性統(tǒng)計(jì)1)

2.3 菌株基因突變類型對(duì)3種喹諾酮類藥物MIC的影響

分析菌株基因不同突變類型對(duì)左氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星3種藥物MIC的影響.結(jié)果(圖1-3)顯示,對(duì)左氧氟沙星耐藥的菌株對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星也耐藥,且諾氟沙星和環(huán)丙沙星的MIC約為左氧氟沙星的2倍.耐藥菌株基因最主要的突變類型是GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn),該突變類型對(duì)喹諾酮類藥物呈現(xiàn)中高度耐藥.根據(jù)CLSI推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)[16],菌株基因ParC的Asp83Tyr和Ser79Phe突變類型對(duì)左氧氟沙星敏感,該突變類型的菌株對(duì)左氧氟沙星的MIC略高于無突變菌株(圖1),且ParC的這兩種突變類型對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥(圖2-3).表明ParC的Asp83Tyr或Ser79Phe突變可能會(huì)導(dǎo)致無乳鏈球菌對(duì)左氧氟沙星的敏感性下降.當(dāng)菌株基因存在ParC的Ser79Phe突變與GyrA的Ser81Leu或Glu85Lys突變聯(lián)合時(shí)則表現(xiàn)出高度耐藥.

圖1 菌株基因突變類型對(duì)左氧氟沙星MIC的影響

圖3 菌株基因突變類型對(duì)環(huán)丙沙星MIC的影響

3 討論與結(jié)論

我國(guó)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)隱性乳腺炎發(fā)病率高達(dá)50%以上[6,17],它不僅導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降,還可由于治療該病時(shí)抗菌藥物殘留、耐藥菌產(chǎn)生等原因造成乳制品質(zhì)量下降,甚至危及人類健康[18].近年來,無乳鏈球菌性奶牛乳腺炎的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[19],已成為部分規(guī)?；膛?chǎng)乳腺炎防控的重點(diǎn),但耐藥菌的產(chǎn)生嚴(yán)重降低了對(duì)奶牛乳腺炎的治療效果.

喹諾酮類藥物是4-喹諾酮-3-羧酸結(jié)構(gòu)化衍生物,自1962年由Lesher et al[20]初次合成至今,已有4代喹諾酮類藥物問世,其中,氟喹諾酮類是喹諾酮類的第3代產(chǎn)物.喹諾酮類藥物在治療和預(yù)防動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面應(yīng)用廣泛,臨床上使用較多的是氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等藥物.由于存在藥物殘留、產(chǎn)生耐藥菌等影響動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全的潛在風(fēng)險(xiǎn),中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部自2016年起禁止在食品動(dòng)物中使用氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星和培氟沙星4種喹諾酮類藥物[21].盡管如此,喹諾酮類藥物的品種和制劑數(shù)量多,仍然是獸醫(yī)臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗菌藥物之一.據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)使用的獸用抗菌藥有69種,其中有10種為氟喹諾酮類藥物,占總量的14.5%,排名第一[22].

人源無乳鏈球菌對(duì)左氧氟沙星的敏感率低,不敏感度高達(dá)50%～70%[23-24];牛源無乳鏈球菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率大多為0～50%,不同地區(qū)、養(yǎng)殖場(chǎng)的無乳鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率差別較大[25].值得注意的是,近年來中介菌增多,在河北、內(nèi)蒙古和寧夏分離的牛源無乳鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星的中介率分別為83%[26]、31%[27]、63%[28].中介菌的增多表明耐藥率將呈現(xiàn)上升趨勢(shì).本研究對(duì)分離自我國(guó)10省區(qū)21個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的110株奶牛乳腺炎無乳鏈球菌進(jìn)行了氟喹諾酮類藥物的敏感性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)耐藥率超過80%,高于已往報(bào)道的數(shù)據(jù)[25],可能與養(yǎng)殖場(chǎng)用藥種類和用藥方法不同有關(guān).比較分析本研究3種喹諾酮類藥物對(duì)菌株的MIC發(fā)現(xiàn),大多數(shù)耐藥菌同時(shí)對(duì)3種喹諾酮類藥物耐藥.這與文獻(xiàn)報(bào)道的“左氧氟沙星耐藥菌對(duì)多種喹諾酮類藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性”[29]一致.

QRDR基因突變是細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制之一.與參考菌株對(duì)比,本研究所有供試菌株基因均存在GyrB(Val498Ala)和ParE(Ile503Val)突變,而GyrB(Val498Ala)突變與菌株耐藥性無明顯關(guān)聯(lián)[13,30],因此,本研究在進(jìn)行基因突變統(tǒng)計(jì)分析時(shí)未考慮這兩個(gè)位點(diǎn).耐藥菌基因最常見的突變位點(diǎn)為GyrA(Ser81Leu),占左氧氟沙星耐藥菌的92.6%(87/94);其次為ParE(Asp437Asn),占左氧氟沙星耐藥菌的85.1%(80/94).本研究中,菌株基因ParE(Asp437Asn)突變與GyrA(Ser81Leu)突變同時(shí)出現(xiàn),且GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn)突變與GyrA(Ser81Leu)突變對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性并無明顯差異,均呈現(xiàn)中高度耐藥,因此,ParE(Asp437Asn)突變是否影響喹諾酮類藥物敏感性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證.研究表明,基因GyrA和ParC的雙突變會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥程度[29],這與本研究結(jié)果一致.本研究中,菌株基因ParC第79和83位氨基酸突變雖然對(duì)左氧氟沙星敏感,但其對(duì)左氧氟沙星的MIC高于無突變菌株,且該菌株對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星耐藥;菌株基因若同時(shí)存在ParC(Ser79Phe)突變和GyrA第81或85位氨基酸突變,則該菌株對(duì)喹諾酮類藥物呈現(xiàn)高度耐藥.本研究存在一些基因無突變的菌株,表現(xiàn)出對(duì)諾氟沙星或環(huán)丙沙星的低度耐藥,這可能與其他耐藥機(jī)制相關(guān).除了QRDR基因突變以外,細(xì)菌攜帶含耐藥基因的質(zhì)粒、外排泵系統(tǒng)功能的增強(qiáng)和細(xì)胞膜通透性的降低也可導(dǎo)致其對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性,但目前對(duì)于無乳鏈球菌的這些相關(guān)機(jī)制研究較少.

本研究結(jié)果表明,我國(guó)牛源無乳鏈球菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率較高,對(duì)左氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為85.5%、98.2%、94.5%,其耐藥性與菌株QRDR基因突變有關(guān).本研究結(jié)果對(duì)獸醫(yī)臨床上合理使用喹諾酮類藥物具有指導(dǎo)作用.