連作年限對辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

李 瑩, 劉蘭英, 何肖云, 邱胤輝, 任麗花, 黃銳敏, 傅建煒

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,福建 福州 350003;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350003;3.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,福建 三明 365000)

近年來,果蔬消費(fèi)的增加及種植者對高經(jīng)濟(jì)效益的追求促使溫室果蔬生產(chǎn)體系迅速發(fā)展[1].當(dāng)前我國設(shè)施栽培模式多呈現(xiàn)出高投入和高產(chǎn)出,且作物類型單一化種植以及復(fù)種指數(shù)高等特點(diǎn)[2-4],但作物長期單一化連續(xù)種植會導(dǎo)致土壤退化、土傳病害頻發(fā)、作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降等連作障礙問題[3-6].研究表明,土壤環(huán)境惡化、病原菌繁殖、養(yǎng)分有效性失衡和自身毒性物質(zhì)積累都是引發(fā)連作障礙的重要原因[5-8].目前,種植者多嘗試使用化肥和殺蟲劑來克服設(shè)施農(nóng)業(yè)中的連作障礙,但收效甚微,且易適得其反[9].

土壤微生物是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,對土壤健康至關(guān)重要.研究表明,根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致作物連作障礙的最根本原因[5,10-11].作為土壤微生物區(qū)系的重要成員,真菌與其他微生物一起參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動,在促進(jìn)植物生長、維持土壤健康方面起到了重要作用[8,12],其群落結(jié)構(gòu)和多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的平衡及功能的發(fā)揮至關(guān)重要.研究證實(shí),作物長期連作后,土壤微生物由細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)變,而許多真菌與植物疾病密切相關(guān)[13].如辣椒和黃瓜等作物連作會導(dǎo)致土壤中鐮刀菌的相對豐度顯著增加[8],而鐮刀菌是一種重要的植物病原菌.相反地,一些真菌也可以通過抑制致病菌,在植物促生防病中發(fā)揮著積極作用[14].如:在葡萄連作的過程中,許多因素都可能導(dǎo)致病害壓力的增強(qiáng),其中,真菌致病菌的增加及有益真菌群落結(jié)構(gòu)的簡化可能是重要原因[6];相似的結(jié)論在地黃[15]、番茄[16]和百合[17]等作物連作中也被證實(shí).表明作物連作障礙與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān),目前已引起國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注[18].相對于土壤細(xì)菌群落,對設(shè)施栽培中作物連作導(dǎo)致的土壤真菌群落變化的研究仍較少.因此,研究連作管理下土壤真菌群落多樣性及其演變規(guī)律,對于探索土壤可持續(xù)利用、保持土壤健康至關(guān)重要.

隨著設(shè)施栽培技術(shù)的普及,辣椒設(shè)施栽培面積越來越大,但連作年限對土壤真菌群落的影響以及有益或致病真菌與土壤理化因子的關(guān)系卻鮮見報道.據(jù)此,本研究以福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所辣椒育種基地為研究對象,對設(shè)施栽培條件下不同連作年限辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,旨在揭示土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在不同連作年限下的變化規(guī)律,探索真菌群落特征與土壤理化因子之間的關(guān)系,為辣椒種植產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所辣椒種植基地(117°41′E,26°15′N)進(jìn)行.該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候,氣溫日際變化大,晝夜溫差懸殊,冷暖不定,一年四季明顯,雨水充沛,干濕分明,年均降雨日174 d,年日照時數(shù)1 878 h,無霜期303 d,年平均降水量1 754 mm.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選擇連續(xù)種植1、3、5、10 a的大棚辣椒地為樣地,辣椒品種為‘明椒系列’,不同連作年限的辣椒隸屬不同的大棚,且大棚間的直線距離不超過500 m.大棚建成之前,原始土壤性質(zhì)類似,大棚建成后均沒有其他作物種植歷史.所有大棚土壤類型均為紅壤土.

辣椒栽培一年兩季,種植茬口為春提早和秋延后.種植前先進(jìn)行翻土,隨后施用基肥,基肥為三明市森耕農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供的有機(jī)肥.基肥主要以豬糞、雞糞、蘑菇渣、木耳渣和輔料煙末等為原料,加入生物菌堆漚混合發(fā)酵腐熟,其中,ω(有機(jī)質(zhì))≥45%,水含量≤30%,ω(N+P2O+K2O)≥5.0%[19].通常每茬施用50 t·hm-2有機(jī)肥,待辣椒進(jìn)入旺盛生長期后,每兩周施用一次葉面肥(ωN∶ωP∶ωK=15∶15∶15).種植過程中均采用常規(guī)管理方式進(jìn)行病害防治,所有大棚管理方式一致.

1.3 土壤樣品采集

每個連作大棚被劃分為3個小區(qū)(5 m×5 m),于2021年11月在辣椒盛花期,按照5點(diǎn)采樣法,在每個小區(qū)用直徑2.5 cm的不銹鋼土鉆在耕層(0～20 cm)采集土壤樣品,取樣點(diǎn)距辣椒根系5～8 cm.將土壤充分混合后裝入無菌袋并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,去除根系等雜物后,一部分樣品放入冰箱(-80 ℃)保存用于土壤DNA的提取,測序工作委托北京奧維森生物科技有限公司完成.另一部分帶回實(shí)驗(yàn)室后立即測定含水量,其余樣品自然風(fēng)干后進(jìn)行土壤理化因子測定.不同連作年限處理下的土壤理化因子[19]如表1所示.

表1 不同連作年限處理下土壤理化因子的變化1)

1.4 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

土壤總DNA按照Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit(100)試劑盒說明書的步驟提取,每個樣品提取3個平行,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增.用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA的完整性,用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾公司)檢測DNA 的濃度和純度,選用特異性引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2F(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.熱啟動PCR反應(yīng)體系:2 μL DNA、上下游引物各1 μL、3 μL BSA、12.5 μL 2×TaqPlus Master Mix、5.5 μL ddH2O.反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共34個循環(huán);72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)對DNA 進(jìn)行回收.PCR產(chǎn)物利用Illumina Miseq PE300平臺進(jìn)行測序.

1.5 數(shù)據(jù)處理

Illumina Miseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)控、拼接與去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列(clean tags);利用Uparse軟件在97%相似度下對優(yōu)化序列進(jìn)行聚類,得到操作分類單元(operational taxonomic units, OTU);采用RDP Classifier算法對OTU代表序列進(jìn)行比對分析,得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息;采用Mothur軟件對全部有效序列進(jìn)行OTU聚類統(tǒng)計(jì),繪制韋恩圖[20];使用Qiime軟件計(jì)算樣品的Chao1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)等Alpha多樣性指數(shù),其中,以Chao1指數(shù)表征真菌群落的豐富度,以香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表征真菌Alpha多樣性.

采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan′s多重比較(P<0.05);使用Unweighted UniFrac距離矩陣對OTU水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行非加權(quán)組平均聚類(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)分析和非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)分析[21];使用冗余分析探索影響土壤真菌群落物種組成的關(guān)鍵環(huán)境因子;采用Canoco 4.5軟件進(jìn)行土壤真菌冗余分析和圖表繪制;利用Pearson等級相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連作年限下辣椒根際土壤真菌群落的多樣性

2.1.1 Alpha多樣性 本研究中,真菌基因文庫覆蓋率達(dá)99%,測序文庫已達(dá)到飽和,同時隨著測序量的增加,稀釋曲線趨于平坦,表明測序數(shù)據(jù)量合理,能夠準(zhǔn)確反映各處理土壤樣品的真菌群落特征.基于OTU水平的真菌群落Alpha多樣性(表2)顯示,隨著連作年限的延長,土壤中的Chao1指數(shù)無顯著差異,而連作3、5、10 a的辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均顯著低于連作1 a處理(P<0.05),表明連作3 a的真菌群落多樣性較連作1 a顯著下降,且逐漸趨于穩(wěn)定.

表2 不同連作年限處理下土壤真菌群落 ITS測序數(shù)據(jù)及Alpha多樣性1)

圖1顯示:4個連作處理所共有的OTU有340個,分別占1、3、5、10 a處理OTU總數(shù)的22.68%、22.02%、22.74%和23.58%;此外,1、3、5、10 a處理中特有的OTU分別為497、296、348和307個,各占其OTU總數(shù)的33.15%、19.17%、23.28%和21.29%.表明不同連作年限土壤的OTU組成存在差異.

每個圈表示一個處理,重疊部分的數(shù)字表示樣本之間共有的OTU個數(shù),非重疊部分的數(shù)字表示樣本特有的OTU個數(shù).

2.1.2Beta多樣性 分層聚類分析表明,5、10a連作處理土壤樣品中的真菌群落更為相似且聚類,與1、3a連作處理的真菌群落明顯分離(圖2A).NMDS分析(脅強(qiáng)系數(shù)=0.003 6)顯示,所有樣品分為3類,來自5、10a連作處理的樣品高度相似并聚集,與1、3a連作處理的樣品分離(圖2B),此結(jié)果與層次聚類分析結(jié)果相似.表明連作改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu),且不同連作年限下真菌群落結(jié)構(gòu)的差異顯著.

2.2 不同連作年限下辣椒根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成

4個連作處理土壤共鑒定出17個真菌門類.其中,子囊菌門(Ascomycota)是4個處理的絕對優(yōu)勢菌群(圖2A),占比達(dá)到了79.10%～95.12%;擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為亞優(yōu)勢菌門,其相對豐度為1.50%～13.54%;被孢霉門(Mortierellomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)的占比分別為0.34%～3.64%和0.60%～11.34%;梳霉門(Kickxellomycota)在5a連作處理中的相對豐度達(dá)1.0%,但在其他3個處理中幾乎沒有檢測到.

圖2 基于Unweighted UniFrac距離的 UPGMA聚類樹(A)和NMDS分析結(jié)果(B)

在屬水平上對真菌進(jìn)行物種注釋分析,共獲得18個優(yōu)勢屬群(平均相對豐度>1%)(表3).其中,子囊菌門中的Ovatospora、鐮刀菌屬和毛殼菌屬是4個連作處理共有的優(yōu)勢真菌屬.對比發(fā)現(xiàn),枝葡萄孢屬、木霉屬、伽穆孢屬和白鬼傘屬隨著連作年限的延長而逐漸下降,而矮菇屬、枝頂孢霉屬、帚霉屬和Alphamyces則呈相反趨勢;被孢霉屬在連作1～5 a的相對豐度穩(wěn)定,但在連作10 a后顯著下降;糞殼菌屬、麻孢殼菌屬、Ovatospora和毛殼菌屬隨著連作年限的延長呈先顯著增加后明顯下降的趨勢;而鐮刀菌屬和曲霉屬隨著連作年限的延長呈現(xiàn)出波浪形的變化趨勢.值得注意的是,在真菌類群中有一大部分仍未被分類,在4個處理中的占比達(dá)到了20.08%～31.67%,這表明可能還有很多對連作響應(yīng)敏感的類群有待探明.

表3 不同連作年限處理下土壤真菌屬水平的組成和分布1)

2.3 真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間的相互關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析(表4)表明,香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)與土壤pH均呈極顯著負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.846、-0.816),與土壤可溶性有機(jī)碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.597、-0.625).

表4 真菌群落多樣性指數(shù)與土壤理化因子間的相關(guān)系數(shù)1)

以不同連作年限處理的OTU水平作為響應(yīng)變量,研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的關(guān)系.結(jié)果(圖3)顯示,冗余的前2個軸解釋了真菌群落69.1%的變異,表明第1、2排序軸能較好地反映出真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子之間的相互關(guān)系.其中,3、1 a連作處理組分別分布在第1排序軸的兩側(cè),5、10 a連作處理組聚為一簇,與1 a連作處理組分別分布在第2排序軸的兩側(cè),與Beta多樣性的結(jié)果一致.被選擇的土壤理化因子中,pH及有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大,是影響真菌群落組成的重要因素.其中,pH主要影響3 a連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu),有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則主要影響5、10 a連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu).速效鉀、有效磷和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)矢量箭頭之間的夾角為銳角,表明這3種理化因子之間可能具有協(xié)同效應(yīng).

RDA1、RDA2分別表示第1、2排序軸.EC:電導(dǎo)率;C/N:碳氮比;銨態(tài)氮(硝態(tài)氮);DOC:ω(可溶性有機(jī)碳);AP:ω(有效磷);AK:ω(速效鉀);SOM:ω(有機(jī)質(zhì)).

3 討論

3.1 連作年限對辣椒根際土壤真菌群落多樣性的影響

土壤微生物的多樣性被認(rèn)為是維持土壤健康的關(guān)鍵[22].本研究中,盡管連作10 a下辣椒根際土壤的真菌豐富度與連作1 a的差異不顯著,但連作導(dǎo)致的真菌群落多樣性顯著降低;與之相似,黑胡椒、丹參、咖啡和黃瓜在長期連作后,其根際土壤真菌的香農(nóng)指數(shù)顯著下降[3,22-23];與之相反,草莓根際土壤真菌群落多樣性隨著連作年限的延長而增加[24].連作對真菌群落多樣性的影響可能與作物種類、管理措施、種植土壤和連作年限等因素有關(guān)[24].本研究中,化感物質(zhì)的累積以及辣椒根系分泌物長期釋放的生態(tài)效應(yīng),可能會促進(jìn)某些特定微生物富集[25];同時,多年相同的田間管理模式為特定真菌提供了優(yōu)良的繁殖環(huán)境,但也導(dǎo)致部分微生物在生物競爭中減少甚至消失,這些都可能是長期連作后真菌群落多樣性下降的重要原因[26].本研究的Beta多樣性顯示,連作年限顯著影響辣椒根際土壤真菌群落的多樣性,此結(jié)果與之前對細(xì)菌群落多樣性的分析結(jié)果[19]有所差異.3、5 a連作處理組的土壤真菌群落分散分布;相反,5、10 a連作處理組的真菌群落聚集,表明連作5 a后,真菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定.

3.2 連作年限對辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究中,子囊菌門是4個連作處理的絕對優(yōu)勢菌群.子囊菌門多為腐生營養(yǎng)型真菌,是土壤最重要的有機(jī)質(zhì)分解者[27].研究表明,子囊菌門更容易在高肥力的土壤中富集[28].但在本研究中,子囊菌門的相對豐度隨著連作年限的延長呈現(xiàn)出劇烈的波浪形變化,與土壤無機(jī)氮和有效磷等養(yǎng)分含量的變化未呈現(xiàn)出明顯的一致性,這可能與子囊菌門有較高的物種多樣性和進(jìn)化速度有關(guān).

真菌在土壤環(huán)境中起著重要作用,其與農(nóng)作物病害密切相關(guān)[29].其中,歸屬于子囊菌門的優(yōu)勢屬——鐮刀菌屬是土傳病害中主要的病原菌屬[6],會導(dǎo)致辣椒患枯萎病、根腐病、葉枯病和果腐病等[30].一般來說,連作極易造成土壤同質(zhì)性,導(dǎo)致潛在病原菌的累積.本研究中,鐮刀菌屬的相對豐度在連作5 a時達(dá)到最高,但在連作10 a時的相對豐度較其他處理顯著降低,此結(jié)果與葡萄長期連作后的結(jié)果[6]一致.土壤中致病真菌含量的增加會導(dǎo)致土傳病害發(fā)病率升高.據(jù)了解,10 a樣地在連作5～10年期間曾暴發(fā)大規(guī)模重的土傳病害,管理者進(jìn)行了大規(guī)模的藥物消殺,可能導(dǎo)致后期(連作10 a)病原體減少[19].這與本課題組前期在對細(xì)菌的研究中所發(fā)現(xiàn)的生防菌鏈霉菌屬(Streptomyces)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度在連作5 a后急劇增加的趨勢相吻合.本研究中,土壤枝頂孢霉屬、青霉菌屬和曲霉菌屬等生防菌的相對豐度在辣椒連作5 a后顯著增加,連作10 a時的相對豐度分別是連作1 a時的8.23、5.26和4.84倍.枝頂孢霉屬和青霉菌屬均屬于腐生營養(yǎng)型真菌,可以通過分泌某些酶來抑制病原細(xì)菌和真菌;青霉菌屬對纖維素和半纖維素有很強(qiáng)的降解能力,對植物有促生作用,對多種植物致病真菌也具有抑制或防治作用[31-34];曲霉菌屬的代謝產(chǎn)物能有效抑制27種農(nóng)作物病原菌的生長,是抑制青枯病的拮抗菌[35].研究表明,在纖維素降解和腐殖質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用的帚霉屬的相對豐度在連作5 a時顯著增加[36].植物可以通過招募保護(hù)性微生物抑制植物病原體來保護(hù)其免受侵害[6,37].以上結(jié)果表明,有益真菌在連作5 a時的相對豐度顯著增加可能是植物在暴發(fā)嚴(yán)重病害后的自我調(diào)節(jié)防御機(jī)制,鐮刀菌屬的相對豐度在連作5 a時也下降可能與有益微生物豐度的變化有關(guān).相反地,毛殼菌屬的相對豐度在連作5、10 a時顯著下降;連作1 a時的木霉菌屬占比為3.46%,但隨著連作年限的延長,該菌群幾乎監(jiān)測不到.相似地,被孢霉屬的相對豐度在連作1～5 a時穩(wěn)定在3%,但在連作10 a時不到1%.毛殼菌屬產(chǎn)生的毛殼菌素能夠有效抑制多種病原真菌的繁殖[6,38];而木霉菌屬被認(rèn)為是具有重寄生功能的生防菌[29];被孢霉屬具有潛在分泌抗菌素和抑制部分病原菌生長的能力,被確定為對土壤有益的微生物[39-40].這些潛在的植物有益真菌,其豐度的下降可能與辣椒連作障礙密切相關(guān).研究表明,植物生長狀況和連作障礙可能取決于致病微生物與有益微生物之間的競爭[6].辣椒長期連作后,部分生防菌的減少和病原菌的積累可能是造成辣椒連作障礙的原因之一.

3.3 土壤理化因子與真菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

真菌群落多樣性與pH呈顯著負(fù)相關(guān),這與“土壤pH過高會限制真菌存活”[41]的結(jié)果一致.土壤pH下降會刺激嗜酸性真菌繁殖[6];同時,土壤中的真菌大多為異養(yǎng)微生物,需要外界碳分解為其提供養(yǎng)分和能源.但微生物對碳有效性的需求和適應(yīng)能力存在差異,連作后可溶性有機(jī)碳含量的提高可能會導(dǎo)致適宜在低濃度碳環(huán)境下生存的真菌的減少,從而促進(jìn)適宜在高濃度碳環(huán)境下生存的真菌的繁殖,導(dǎo)致真菌群落多樣性下降.而微生物多樣性的減少是土傳病害發(fā)生的重要原因.

真菌的生長和繁殖依靠土壤的養(yǎng)分.本研究冗余分析表明,土壤pH及有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量對土壤真菌群落組成的影響較大.其中,連作3 a時的真菌群落結(jié)構(gòu)主要受pH影響,而連作5、10 a時的真菌群落結(jié)構(gòu)則主要受有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量的影響.表明在短期連作過程中,pH是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素,這可能是由于本研究施用的有機(jī)肥呈堿性,在短期連作下pH呈升高的趨勢,對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響更明顯.但隨著連作年限的延長,土壤養(yǎng)分的累積,有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)逐漸成為影響真菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子.此結(jié)果與Zhao et al[3]的研究結(jié)果相似.Zhao et al[3]在溫室條件下對黃瓜進(jìn)行連作處理,發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響可能比pH更大.

4 結(jié)論

辣椒根際土壤在長期連作后,其真菌群落多樣性隨著連作年限的延長而顯著降低;連作顯著改變了真菌群落結(jié)構(gòu),不同連作年限處理間的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異;長期連作導(dǎo)致部分有益真菌減少、病原真菌增多,而這主要與pH及有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量密切相關(guān).表明辣椒在長期連作下,合理的養(yǎng)分類型和數(shù)量對平衡土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、提高土壤健康、降低植株發(fā)病率至關(guān)重要.