細(xì)胞焦亡最新進展及在心臟移植排斥反應(yīng)中的作用

王松，冉栓，牛裕晴，吳杰，夏家紅（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，湖北 武漢 430022）

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，多項研究表明焦亡參與了腫瘤、自身免疫性疾病、感染等多種疾病的病理過程。心臟移植排斥反應(yīng)主要病理過程是抗原提呈細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞捕獲外來抗原并活化T 細(xì)胞等獲得性免疫細(xì)胞，活化后的T 細(xì)胞通過直接殺傷或激活巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞參與移植物的排斥反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明焦亡可能參與到心臟移植排斥反應(yīng)過程，本文將針對焦亡在心臟移植排斥中潛在作用的研究進展進行闡述，加深對移植排斥反應(yīng)的認(rèn)識，通過靶向焦亡的相關(guān)通路為臨床治療提供新策略。

1 細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由Gasdermin蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡［1］，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹破裂，內(nèi)容物釋放。經(jīng)典的焦亡途徑是指病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）或者損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）被細(xì)胞模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別，從而激活下游信號，與前體半胱天冬酶（pro-Caspase-1）以及凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）組裝形成炎癥小體（inflammasome），再激活pro-Caspase-1，活化后的Caspase-1 切割二聚體狀態(tài)Gasdermin，N 端Gasdermin 在細(xì)胞膜上形成孔道。同時被成熟Caspase-1 激活的IL-1β、IL-18 及HMGB1 等炎癥因子，通過孔道釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞的焦亡。非經(jīng)典焦亡途徑主要由Caspase-11 介導(dǎo)。AIM2炎癥小體作為PRR 來感受DNA 的損傷信號，AIM2介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡不依賴于Caspase-1、IL-1β 及IL-18［2］。Caspase-1/4/5/11 都參與焦亡相關(guān)通路。Gasdermin 蛋白家族主要成員有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD 及GSDME，而GSDMD 是其中重要成員之一，是細(xì)胞發(fā)生焦亡的執(zhí)行者［3-13］。

焦亡與另外一種經(jīng)典的程序性細(xì)胞死亡——凋亡不同。凋亡過程表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮，核膜破裂，形成凋亡小體，通過細(xì)胞內(nèi)在分子程序?qū)е录?xì)胞死亡，對周圍正常組織及細(xì)胞無其他影響［7］。而細(xì)胞焦亡發(fā)生時胞核完整，僅細(xì)胞質(zhì)發(fā)生腫脹，形成炎癥小體，內(nèi)容物流出，釋放炎癥因子，誘發(fā)細(xì)胞外部炎癥［14］。

2 焦亡在免疫相關(guān)疾病中的作用

2.1 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種由自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的肝炎。在AIH 中，輔助性Ⅰ型T 細(xì)胞（helper type Ⅰ T cells，Th1）刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1 和TNF-α，IL-1β 與IL-18 都屬于IL-1 家族蛋白。伴刀豆凝集素A（concanavalin A，ConA）構(gòu)建自身免疫性肝炎動物模型，經(jīng)ConA處理后，NLRP3 炎癥小體、剪切后的Caspase-1 以及IL-1β 表達上調(diào)。與野生型小鼠相比，NLRP3-/-小鼠肝細(xì)胞損傷明顯降低，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平降低，肝細(xì)胞勻漿中Caspase-1和IL-1β 蛋白水平下調(diào)［15］。其研究表明抑制肝細(xì)胞焦亡可以明顯改善自身免疫性肝炎。

在酒精性肝炎中，敲除非經(jīng)典通路中關(guān)鍵分子Caspase-11 可以抑制GSDMD 的激活，減少肝細(xì)胞死亡。焦亡的下游效應(yīng)分子IL-18 被認(rèn)為是促炎因子，同時也是重要的抗微生物細(xì)胞因子。但在酒精性肝炎中，IL-18 的缺乏并不能保護肝臟，反而會促進GSDMD 的激活，加速肝細(xì)胞死亡從而加重肝炎［16］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一種以肝臟炎癥及肝臟纖維化為特征的非酒精性脂肪性肝病。近期有研究表明，在NASH 中，肝星狀細(xì)胞吞噬細(xì)胞外NLRP3 炎癥小體顆粒后通過經(jīng)典途徑激活Caspase-1，使肝臟星狀細(xì)胞發(fā)生焦亡，導(dǎo)致IL-1β 的釋放，過表達NLRP3 可以導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)自發(fā)性肝纖維化，加重非酒精性脂肪肝炎［17］。

2.2 焦亡在自身免疫性腦脊髓炎中的作用：實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）動物模型是用來研究多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）自身免疫性疾病的理想模型。MS以神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及脫髓鞘為主要表現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在其中扮演著重要的角色［18］。作為NLRP3 下游，焦亡的關(guān)鍵分子GSDMD 在EAE 發(fā)病小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達升高，主要聚集在血管周圍區(qū)域附近。使用GSDMD 敲除鼠誘導(dǎo)EAE 發(fā)現(xiàn)，外周髓系細(xì)胞的GSDMD 缺失抑制了免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和脫髓鞘發(fā)生的比例減少。此外，敲除GSDMD 減少了脾臟及引流淋巴結(jié)中T 細(xì)胞的活化和分化，并阻止了T 細(xì)胞浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，敲除小鼠Gsdmd 基因后，明顯減輕EAE 發(fā)病嚴(yán)重程度［19］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在EAE 模型中少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡后，可以募集更多的小膠質(zhì)細(xì)胞在其周圍聚集［20］。EAE 模型中，巨噬細(xì)胞中Vsig4 可以激活JAK2-STAT3-A20級聯(lián)反應(yīng)，通過抑制NF-κB 通路來降低NLRP3 及IL-1β 的表達。敲除Vsig4 明顯加重EAE 的發(fā)病程度［21］。因此靶向Vsig4 調(diào)控細(xì)胞焦亡可能成為治療多發(fā)性硬化的新靶點。但是AIM2 全敲小鼠誘導(dǎo)EAE 之后臨床評分更高、神經(jīng)炎和脫髓鞘更嚴(yán)重，這可能與AIM2 破壞了Treg 的穩(wěn)定有關(guān)［22］。

2.3 焦亡在腫瘤中的作用

2.3.1 細(xì)胞焦亡在乳腺癌中的作用：乳腺癌中GSDMB 的高表達與腫瘤進展和對HER-2 靶向治療反應(yīng)差相關(guān)，高水平的GSDMC 表達與乳腺癌的預(yù)后不良相關(guān)［23-24］。這意味著GSDMB、GSDMC 有可能成為腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志物。在使用EO771 大鼠腫瘤細(xì)胞構(gòu)建原位乳腺癌模型中，野生型小鼠中IL-1β 的水平升高，腫瘤生長迅速且肺轉(zhuǎn)移發(fā)生比例高。而Caspase-1 敲除的小鼠構(gòu)建腫瘤模型，腫瘤生長明顯減緩且肺轉(zhuǎn)移明顯減少。此外IL-1β 可以促進腫瘤及巨噬細(xì)胞表達趨化因子CCL2，募集髓系細(xì)胞到炎癥部位，并促進巨噬細(xì)胞浸潤到腫瘤中［25］。此外，IL-1β 還可以促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及增殖，增加的骨轉(zhuǎn)移［26］。

2.3.2 細(xì)胞焦亡與肺癌：GSDMD 蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達明顯升高，且GSDMD 的高表達會導(dǎo)致腫瘤侵襲性強，腺癌預(yù)后差。下調(diào)GSDMD 后，腫瘤細(xì)胞焦亡受抑制，凋亡增加，并通過EGFR/Akt 通路減弱腫瘤細(xì)胞增殖［27］。He 等［5］在巨噬細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：GSDMD 敲除后，巨噬細(xì)胞不發(fā)生焦亡，而是通過Caspase-3/7 通路發(fā)生凋亡。模式識別受體AIM2 激活后形成炎癥小體，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達AIM2，可以增強非小細(xì)胞肺癌的活力以及加強其遷移能力，在體內(nèi)促進腫瘤的生長［28］。以上研究表明，焦亡在肺癌中的水平與肺癌的炎癥程度、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后相關(guān)，有望成為重要的生物標(biāo)志物。

2.3.3 細(xì)胞焦亡與黑色素瘤：聯(lián)合使用BRAF 抑制劑及MEK 抑制劑是FDA 批準(zhǔn)的治療BRAFV600E/K突變的黑色素瘤的有效方法［29］。BRAF 抑制劑 +MEK 抑制劑誘導(dǎo)了GSDME 介導(dǎo)的焦亡細(xì)胞死亡，在GSDME 敲除小鼠中，腫瘤浸潤的T 細(xì)胞減少，且在聯(lián)合治療中不發(fā)生焦亡［30］。另外一種模式識別受體NLRP1 不需要ASC 便可以激活Caspase-1 形成炎癥小體，NLRP1 通過增強炎癥小體和抑制巨噬細(xì)胞凋亡來促進黑色素瘤的生長［31］。因此，焦亡相關(guān)分子NLRP1 可能成為治療人黑色素瘤的新靶點。NLRC4 在黑色素瘤中可以抑制黑色素瘤的生長，NLRC4 炎癥小體由NLRC4、ASC 與Caspase-1組成，敲除ASC 與Caspase-1 不能抑制移植黑色素瘤的生長，說明NLRC4 抑制黑色素瘤的生長不通過NLRP3 炎癥小體途徑［32-33］。

隨著研究的深入，細(xì)胞焦亡與腫瘤的關(guān)系逐漸被認(rèn)識。細(xì)胞焦亡與肝細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌及白血病等都密切相關(guān)［4］。一部分腫瘤細(xì)胞可以有效調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的強大抗腫瘤免疫反應(yīng)［34］。靶向焦亡相關(guān)蛋白AIM2、NLRP3炎癥小體、Caspase-1 以及Gasdermin 蛋白有望成為抑制腫瘤生長，治療耐藥性腫瘤、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑［34-38］。

3 焦亡在器官移植中的作用

實體移植目前仍然是終末期器官衰竭的最終治療手段［39］。器官移植術(shù)后，移植物經(jīng)歷缺血/再灌注損傷、排斥反應(yīng)等過程，天然免疫和適應(yīng)性免疫在其中扮演著重要的作用。

3.1 焦亡與缺血/再灌注損傷：缺血/再灌注損傷（ischemic reperfusion injury，IRI）是指由于各種原因引起的缺血和血液灌注恢復(fù)引起的組織或者器官損傷。在肝、腎、肺及心臟移植中，缺血/再灌注損傷是影響早期功能恢復(fù)和長期存活的主要原因之一。之前的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機制及治療策略主要涉及線粒體的功能：電子傳遞體系、線粒體滲透性改變以及自噬相關(guān)。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，焦亡在缺血/再灌注損傷中也有著重要的作用［40］。在體外肺灌注的過程中，來自供體肺的白細(xì)胞通過Caspase-1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡來損傷肺移植物，如果清除這些白細(xì)胞或者抑制焦亡，可以明顯延長肺移植物的存活時間［41］。SIRT1 激動劑在IRI 缺血性損傷期間，可通過Akt 依賴性代謝調(diào)節(jié)抑制NLRP3 炎性小體的激活［42］。多種焦亡相關(guān)抑制劑已被證明可通過抑制心肌細(xì)胞焦亡減輕小鼠心肌梗死面積、改善心功能障礙，抑制劑Ac-YVAD-cmk［43］與VX765［44-45］通過抑制Caspase-1 抑制心肌細(xì)胞焦亡,抑制劑MX1013可以抑制多種Caspase 蛋白激活［46］,大黃素（emodin）通過抑制GSDMD 表達從而抑制心肌細(xì)胞焦亡［47］。GSDMD 全敲小鼠對心肌IRI 具有抗中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的心臟保護作用［48］。此外，使用MCC950 和Ac-YVAD-cmk 阻斷焦亡通路的NLRP3 炎癥小體或者Caspase-1 可以減輕因心臟驟停后神經(jīng)系統(tǒng)損傷［49］。SHI 等［50］2021 年發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷選擇性的激活心肌細(xì)胞中Caspase-11 而不是Caspase-1，從而剪切GSDMD。隨后他們構(gòu)建心肌細(xì)胞條件性敲除GSDMD（GSDMDflox/flox；CreαMHC）的小鼠，發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注的敲除小鼠中心肌梗死面積明顯減輕，LDH 釋放明顯減少，且心肌細(xì)胞凋亡沒有明顯差異。以上研究表明靶向焦亡可以明顯減輕缺血/再灌注損傷。

3.2 焦亡相關(guān)分子與排斥反應(yīng)：在2010 年有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟移植急性排斥階段，炎癥小體相關(guān)的ASC 在移植物中升高，且IL-1β 升高，其中機制不明［51］，受體小鼠Nos2 敲除后，Caspase-1 的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，減輕心臟移植排斥反應(yīng)［52］，當(dāng)時認(rèn)為以上過程是細(xì)胞凋亡的結(jié)果，目前來看，此過程很有可能跟細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，GvHD）仍然是使用同種異體造血干細(xì)胞移植治療惡性造血系統(tǒng)腫瘤的主要障礙。Caspase-11 激活后切割GSDMD，導(dǎo)致IL-1α 釋放。Caspase-11 或者GSDMD 缺乏可以減輕同種異體造血干細(xì)胞移植后的腸道炎癥、組織損傷，降低移植后的病死率。此外，Caspase-11 的缺乏不會產(chǎn)生移植物抗白血病效應(yīng)，這對防止癌癥復(fù)發(fā)至關(guān)重要［53］。在同種異體心臟移植中，冬凌草甲素（oridonin）可以通過NF-κB 通路抑制T 細(xì)胞的增殖和IFN-γCD4+T 細(xì)胞的分化，導(dǎo)致脾臟中Treg的比例增加，下調(diào)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表達，延長心臟移植物存活時間［54］。

此外，在器官移植排斥反應(yīng)中，T 細(xì)胞起著重要作用，CD4+T 細(xì)胞是心臟移植和腎移植中急性排斥反應(yīng)充分且必要條件［55-56］，目前有大量CD4+T細(xì)胞在器官移植急性排斥反應(yīng)中的研究。CD4+T 細(xì)胞分為Th1、Th2、Th17、Treg 及Tfh 細(xì)胞亞群。闡明CD4+T 細(xì)胞與焦亡的關(guān)系，有望為防止心臟移植排斥反應(yīng)提供新的治療策略。NLRP3 炎癥小體在CD4+T 細(xì)胞中組裝然后激活Caspase-1 依賴的IL-1β 分泌，從而促進IFN-γ 的產(chǎn)生，進一步促進CD4+T 細(xì)胞分化為Th1 型輔助T 細(xì)胞，且此過程需要補體激活NLRP3［57］。NLRP3 缺乏影響T 細(xì)胞激活及Th1 的分化，還會調(diào)節(jié)致病性T 細(xì)胞向胰島遷移［58］。有研究表明，NLPR3 抑制劑MCC950 顯著降低Th1/17 的細(xì)胞比例及IFN-γ 和IL-17 的分泌，增加Treg 的比例及IL-10 的分泌，而且此過程是由IL-1β 和IL-18 分泌受抑制介導(dǎo)的，從而減輕同種異體器官移植及角膜移植的排斥反應(yīng)［59-60］。靶向焦亡相關(guān)分子NLRP3 有望成為同種異體移植的新的治療策略。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，AIM2 通過與RACK1-PP2A 磷酸化復(fù)合物的交互作用抑制AKT 的磷酸化，從而促進Treg 的穩(wěn)定［22］。AIM2 通過增強Treg 的穩(wěn)定，減輕適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

作為天然免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，在免疫排斥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。在心臟移植術(shù)后患者心內(nèi)膜活檢中，有超過半數(shù)的移植物中存在炎癥，有約1/3 的標(biāo)本中沒有CD4+和CD8+T 細(xì)胞，而是存在不同表型的巨噬細(xì)胞［61］。巨噬細(xì)胞有供體和受體兩種來源，研究表明，供體來源的巨噬細(xì)胞調(diào)控心臟移植排斥反應(yīng)和GvHD［62-63］。在慢性排斥反應(yīng)中，單核巨噬細(xì)胞CX3CR1/CX3CL1 和RhoA信號通路的相關(guān)性為抗慢性排斥療法提供潛在靶點［64］。移植物血管病變是慢性排斥反應(yīng)的重要病理過程，有研究表明，PCSK9 抑制了移植物血管中巨噬細(xì)胞的募集及IL-1β 及IL-18 的表達，這與抑制NLRP3 的表達有關(guān)［65］。焦亡最早在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Caspase-1/4/5/11 被炎癥小體激活后，切割GSDMD，N 端的GSDMD 在細(xì)胞膜上打孔，細(xì)胞發(fā)生焦亡，釋放IL-1β 及HMGB1［1，5］。

4 細(xì)胞焦亡在心臟移植排斥反應(yīng)中的潛在作用

細(xì)胞焦亡在多種疾病中主要發(fā)揮促炎效應(yīng)，而在心臟移植排斥反應(yīng)中，無論是由適應(yīng)性免疫T細(xì)胞介導(dǎo)，還是由天然免疫巨噬細(xì)胞參與，炎癥都在其中扮演著重要的角色。受限于目前研究手段，心臟移植后的缺血/再灌注損傷、急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程的界定尚未明確，它們間的交互作用尚待研究。有研究表明，高親和力的CAR-T 細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤靶細(xì)胞發(fā)生焦亡，釋放炎癥因子IL-1β及IL-18，可以募集更多的巨噬細(xì)胞在局部聚集［66］。IL-1β 可以促進巨噬細(xì)胞表達趨化因子CCL2，募集到炎癥部位［25］。而在心臟移植排斥反應(yīng)中，表達CCL2 的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)排斥反應(yīng)［62］，由此我們提出一種假設(shè)：在心臟移植后，T 細(xì)胞殺傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生焦亡，釋放炎癥因子IL-1β，募集供體高表達CCR2 的巨噬細(xì)胞向移植物聚集，進一步加強炎癥反應(yīng)，移植物焦亡將適應(yīng)性免疫與天然免疫聯(lián)系起來（圖1）。靶向焦亡的執(zhí)行者——GSDMD，有望切斷上述聯(lián)系，減輕移植物單核細(xì)胞的浸潤，延長移植物生存時間，為減輕心臟移植排斥反應(yīng)提供潛在的治療新策略。

圖1 細(xì)胞焦亡在心臟移植排斥反應(yīng)中的作用假設(shè)圖

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，在多種疾病進程中發(fā)揮重要作用，其參與了自身免疫疾病、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等病理過程。深入探究心臟移植排斥反應(yīng)中焦亡的作用與機制有助于我們更進一步認(rèn)識排斥反應(yīng)的病理過程，靶向細(xì)胞焦亡有望成為移植物排斥反應(yīng)治療或輔助治療的有效手段。同一種疾病中不同細(xì)胞的焦亡可能發(fā)揮同向作用或反向作用，挖掘心臟移植中不同細(xì)胞焦亡在其中發(fā)揮的作用及意義有望助于新一類抗排斥藥物的研發(fā)。