砷對(duì)雄性大鼠睪丸組織AQP-8 及survivin 蛋白表達(dá)的影響

韓 菲，秦海霞，高曉勤，施 琳，李雅靜

（1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校組胚教研室，貴州遵義 563000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

韓 菲，秦海霞，高曉勤，等.砷對(duì)雄性大鼠睪丸組織AQP-8 及survivin 蛋白表達(dá)的影響［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：26-31.

砷是一種普遍存在的環(huán)境毒物，近年來(lái)由砷誘發(fā)的雄性生殖毒性引起廣泛關(guān)注。有研究表明，砷能大量蓄積在睪丸、附睪、精囊和前列腺誘導(dǎo)男性生殖障礙［1-2］，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)砷具有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［3-4］，當(dāng)砷濃度≥5.0 μmol/L 時(shí)能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］。砷進(jìn)入細(xì)胞是其發(fā)揮細(xì)胞凋亡等效應(yīng)的關(guān)鍵步驟。水通道蛋白（AQP）是一個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞膜上，是選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異通道。研究表明，砷類(lèi)化合物可通過(guò)AQP 出入細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。AQP-8 是哺乳動(dòng)物水通道蛋白中的獨(dú)特成員，在包括肝臟、睪丸和胰腺等各種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，并具有轉(zhuǎn)運(yùn)水的作用。存活素（survivin）被認(rèn)為是功能最強(qiáng)的一類(lèi)凋亡抑制蛋白，能抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞分裂。有觀點(diǎn)認(rèn)為survivin 可能是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的一種內(nèi)源性抑制劑［7］，可通過(guò)干擾caspase活性起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。目前，砷對(duì)雄性生殖系統(tǒng)毒性的研究主要集中在組織病理學(xué)、精子發(fā)生條件及其微環(huán)境等方面，而對(duì)砷的入胞途徑尚不明確。該研究通過(guò)建立大鼠飲水型亞慢性砷中毒模型，研究亞慢性砷中毒對(duì)大鼠睪丸組織中AQP-8 和survivin 蛋白表達(dá)的影響，探討砷入胞途徑及促進(jìn)生殖細(xì)胞凋亡機(jī)制，以期為揭示砷中毒誘發(fā)的雄性生殖毒性分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體重在160～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCK（黔）2002-0001。

1.2 主要藥物與試劑

亞砷酸鈉，購(gòu)自北京化工廠有限責(zé)任公司；survivin 兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；APQ-8 兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自Affinity Biosciences。

1.3 主要儀器設(shè)備

9905014 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（上海Leica 儀器有限公司），BSll0 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司），EG1150 包埋機(jī)（德國(guó)Leica 公司），JEE-5B 真空冷凍干燥機(jī)（北京永光明醫(yī)療儀器廠），普通光學(xué)顯微鏡（日本CX21 Olympus Japan）。

1.4 亞慢性砷中毒大鼠模型的建立

將40 只健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組以及低、中、高劑量砷染毒組，每組10 只。采用自由飲水方式進(jìn)行染毒。砷染毒組大鼠自由飲用由蒸餾水配制的亞砷酸鈉水溶液，低、中、高劑量染毒組飲水中亞砷酸鈉濃度分別為2.4、12.0、60.0 mg/L，連續(xù)染毒15 周，對(duì)照組飲用蒸餾水。染毒試驗(yàn)期間每天測(cè)定并記錄大鼠體重。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 精子計(jì)數(shù)及精子存活率

染毒試驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠右側(cè)附睪組織剪成小段，制備精子懸液，采用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子密度。利用臺(tái)盼藍(lán)排斥法計(jì)算精子存活率，光鏡下隨機(jī)觀察100 個(gè)精子，記錄未被染色的精子數(shù)量。精子存活率（%）=未被染色精子數(shù)/100×100。

1.5.2 睪丸組織病理學(xué)觀察

取大鼠左側(cè)睪丸，置于bouin 固定液中12～24 h后，經(jīng)無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度為4～7 μm），制備睪丸組織切片。HE 染色后，光鏡下觀察生精上皮細(xì)胞層次及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5.3 免疫組化法檢測(cè)睪丸組織中APQ-8 及survivin 蛋白表達(dá)情況

取大鼠左側(cè)睪丸分成4 份，迅速固定備用。常規(guī)脫水，石蠟包埋，取方位相同的標(biāo)本連續(xù)切片4張（厚度為4 μm）。采用免疫組化法檢測(cè)APQ-8及survivin 蛋白的表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格按照DAB 顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并以PBS 液代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野，結(jié)合MetaMorph 生物圖像軟件測(cè)量每個(gè)視野的光密度值，然后計(jì)算AQP-8 及survivin 免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（MOD）。

1.5.4 Western blotting 法測(cè)定睪丸組織中AQP-8 及survivin 蛋白表達(dá)量

每組隨機(jī)選取3 只大鼠，取右側(cè)睪丸，提取組織勻漿，制作樣品蛋白。煮沸10 min，制備12%的分離膠，每個(gè)孔蛋白上樣量為20 μL，室溫靜置2.5 h后電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h。孵育一抗（AQP-8、survivin，1∶1 000）4 ℃過(guò)夜，洗滌3 次，每次10 min，β-actin 作為內(nèi)參。孵育二抗2 h，洗膜3次，每次10 min，用ECL 發(fā)光液曝光成像，Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。若方差齊時(shí)，多個(gè)組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)；反之用Games-Howell 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠精子計(jì)數(shù)和精子存活率

由表1 可知，隨著染砷濃度的升高，大鼠精子數(shù)量呈下降趨勢(shì)，低劑量染毒組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；中、高劑量染毒組與對(duì)照組相比顯著（F=19.270，P＜0.05）降低。精子存活率也呈下降趨勢(shì)，低劑量染毒組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；中、高劑量染毒組與對(duì)照組相比顯著（F=306.532，P＜0.05）降低。

表1 大鼠精子計(jì)數(shù)及精子存活率計(jì)算結(jié)果

2.2 大鼠睪丸組織病理學(xué)觀察

對(duì)照組大鼠睪丸組織生精小管密集，基膜完整，細(xì)胞層次清楚，各級(jí)生精細(xì)胞正常，間質(zhì)無(wú)充血（見(jiàn)圖1A）；低劑量染毒組大鼠生精小管與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（見(jiàn)圖1B）；中劑量染毒組大鼠生精上皮層數(shù)減少，小管間隙增寬（見(jiàn)圖1C）；高劑量染毒組大鼠部分生精小管出現(xiàn)基膜溶解，生精上皮細(xì)胞層次紊亂，細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)出現(xiàn)水腫、滲出（見(jiàn)圖1D）。

2.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠睪丸組織中AQP-8 及survivin 蛋白表達(dá)情況

2.3.1 AQP-8 蛋白表達(dá)情況

由圖2 可知，AQP-8 蛋白主要表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞的細(xì)胞膜和精子，呈棕黃色或棕褐色。由表2 可知，與對(duì)照組相比，各劑量染毒組陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值（MOD）均升高，且差異顯著（F=19.927，P＜0.05）。

表2 大鼠睪丸組織中AQP-8 陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值

圖2 免疫組化法檢測(cè)大鼠睪丸生精細(xì)胞中AQP-8 蛋白表達(dá)情況（DAB 染色，400×）

2.3.2 survivin 蛋白表達(dá)情況

由圖3 可知，survivin 蛋白主要表達(dá)于次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的胞漿，呈棕黃色。由表3 可知，與對(duì)照組相比各劑量染毒組陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值（MOD）顯著（F=20.647，P＜0.05）降低。

表3 大鼠睪丸組織中survivin 陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值

圖3 免疫組化法檢測(cè)大鼠睪丸生精細(xì)胞中survivin 蛋白表達(dá)情況（DAB 染色，400×）

2.4 Western blotting 法測(cè)定大鼠睪丸組織中AQP-8 及survivin 蛋白的表達(dá)水平

由表4 和圖4 可知，對(duì)照組和染砷組大鼠睪丸組織中均存在AQP-8 及survivin 蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量染毒組AQP-8 蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值顯著（F=169.348，P=0）增高；低、中、高劑量染毒組survivin 蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值顯著（F=98.181，P=0）降低。

圖4 亞慢性砷中毒對(duì)大鼠睪丸生精細(xì)胞中AQP-8 及survivin 蛋白表達(dá)量的影響

表4 大鼠睪丸組織中AQP-8 及survivin 蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值

3 討論

雄性生殖能力主要取決于精子數(shù)量以及活性。睪丸是產(chǎn)生精子的場(chǎng)所，研究顯示砷可蓄積于睪丸組織，導(dǎo)致睪丸組織萎縮和生精細(xì)胞損害，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成精子生成減少、畸形率增加等［8-10］。該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各砷染毒組大鼠精子計(jì)數(shù)與精子活精率均降低，提示砷可導(dǎo)致大鼠精子生成減少；睪丸組織病理學(xué)觀察顯示，染砷組大鼠睪丸生精上皮變薄，細(xì)胞排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞減少，變化程度隨著染毒劑量的增加而加重，說(shuō)明砷對(duì)大鼠睪丸生精上皮具有損害作用并產(chǎn)生生殖毒性。近年來(lái)砷類(lèi)化合物應(yīng)用于腫瘤治療中，表明砷有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制其增殖的作用［11-12］。AQP-8 在肝臟、睪丸和胰腺等組織細(xì)胞中均表達(dá)［13］，定位于所有生殖細(xì)胞的質(zhì)膜和精子［14-15］。Khairul 等［16］和Hoonjan 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，AQP 家族是大鼠細(xì)胞攝取砷類(lèi)化合物的重要介導(dǎo)蛋白。該研究結(jié)果表明，各砷染毒組大鼠睪丸生精小管AQP-8 蛋白的表達(dá)水平隨著染砷濃度的增加而增加，說(shuō)明AQP-8 蛋白水平與細(xì)胞砷攝入相關(guān)，提示砷可能通過(guò)增加AQP-8 蛋白的表達(dá)促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒理作用。

survivin 是凋亡抑制蛋白（IAP）家族成員，可抑制細(xì)胞凋亡并參與細(xì)胞周期調(diào)控，可通過(guò)抑制caspase 通路而阻止細(xì)胞凋亡。研究表明，哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞凋亡也依賴于caspase 家族，其中caspase-3 是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［18］。Shin 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞周期G2/M 階段，主要是由survivin 抑制細(xì)胞凋亡并保證正常的細(xì)胞分裂，抑制caspase-3 和caspase-7 的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)，各砷染毒組睪丸生精小管中survivin 蛋白的表達(dá)水平隨染砷濃度的增加而降低，與Hu 等［20］研究發(fā)現(xiàn)砷類(lèi)化合物可以引發(fā)survivin 降解的結(jié)果一致，表明砷能夠下調(diào)大鼠睪丸組織survivin 蛋白的表達(dá)水平，解除survivin 對(duì)caspase-3 的抑制，活化caspase-3 使DNA 斷裂，促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

砷可能通過(guò)上調(diào)AQP-8 蛋白表達(dá)介導(dǎo)其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)下調(diào)大鼠睪丸組織中survivin 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)大鼠睪丸組織生精細(xì)胞凋亡。