腹瀉型腸易激綜合征大鼠炎癥因子與腸道微生物的相關(guān)性研究

張儒奇，朱炳旭，孫金鵬，王 榮，孫 閔

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067）

張儒奇，朱炳旭，孫金鵬，等.腹瀉型腸易激綜合征大鼠炎癥因子與腸道微生物的相關(guān)性研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：17-25.

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種病因復(fù)雜、發(fā)病機(jī)理尚未明確的功能性腸道疾病，主要表現(xiàn)為慢性腹痛或不適以及排便習(xí)慣異常等，其中腹瀉型腸易激綜合征 （diarrheapredominant irritable bowel syndrome，IBS-D）臨床最為常見。進(jìn)一步探索IBS-D 發(fā)病機(jī)制對(duì)于臨床防治具有重要意義。已有報(bào)道顯示IBS-D 患者中TNF-α、IL-6 等促炎細(xì)胞因子顯著增高，而IL-10等抗炎細(xì)胞因子顯著降低［1］。腸道炎癥因子是IBS-D 重要致病因素之一，炎癥因子的失衡可破壞腸道免疫系統(tǒng)，下調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，影響腸道黏膜屏障功能與通透性，造成胃腸功能紊亂［2-3］。腸-腦軸與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的失調(diào)，是腸道炎癥因子誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏性，參與IBS-D 發(fā)生與病情反復(fù)的主要作用途徑。研究表明，腸道菌群亦能通過(guò)腸-腦軸雙向影響腸道炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)。腸道微生態(tài)紊亂一方面會(huì)刺激機(jī)體NF-κB等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［4］，另一方面則通過(guò)調(diào)控模式識(shí)別受體（PRRs）產(chǎn)生，抑制免疫表達(dá)，從而加劇IBS-D［5］。濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合治療脾胃病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D 大鼠存在腸道菌群紊亂的同時(shí)伴有不同程度的炎癥反應(yīng)［6］，腸道微生物與機(jī)體免疫之間具有一定相互作用。因此，該試驗(yàn)通過(guò)“乙酸結(jié)腸灌注聯(lián)合束縛刺激法”構(gòu)建IBS-D 大鼠模型，探討IBS-D 大鼠血清炎癥因子與腸道菌群的變化以及相關(guān)性，旨在為腹瀉類相關(guān)疾病臨床檢測(cè)炎癥因子以指導(dǎo)益生菌或抗生素的選用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)程序均在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)與監(jiān)督下完成，倫理批號(hào)為JNMC-2022-DW-084。選取SPF 級(jí)雄性SD 大鼠12 只，體重230～250 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.370726200100661354。

1.2 主要儀器與試劑

BSA124S-CW 電子天平購(gòu)自德國(guó)Sartorivs 公司，IL-10、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為A31001245、A30601231、A38210145。

1.3 IBS-D 模型大鼠建立

12 只大鼠分籠飼養(yǎng)于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（21±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12 h/12 h明暗周期交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（CON）與模型組（MOD），每組6只。模型組依照“乙酸結(jié)腸灌注聯(lián)合束縛刺激法”［7］進(jìn)行造模。正常組、模型組均給予蒸餾水10 mL/（kg·BW）灌胃，干預(yù)1 次/d，連續(xù)8 d 模型穩(wěn)定后進(jìn)行樣本采集。

1.4 樣本采集

大鼠末次干預(yù)后禁食不禁水12 h，無(wú)菌條件下留取結(jié)腸中糞便樣品于無(wú)酶EP 管中，-80 ℃冰箱保存。腹主動(dòng)脈取血5 mL 到促凝管，之后4 000 r/min 離心10 min 分離血清，吸取上層血清分裝至標(biāo)記好的1.5 mL EP 管中，將血清標(biāo)本放入-80 ℃冰箱保存以備指標(biāo)檢測(cè)用。

1.5 腸道菌群檢測(cè)

通過(guò)深圳微生態(tài)科技有限公司完成腸道菌群16S rDNA V3～V4 區(qū)高通量測(cè)序，采用CTAB 法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，選用引物序列341F （5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，混樣與純化，應(yīng)用Qubit 進(jìn)行文庫(kù)定量及檢測(cè)，應(yīng)用NovaSeq 6000 PE250 平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。并選擇美吉生物云平臺(tái)（http：//cloud.majorbio.com）進(jìn)行菌群多樣性分析、優(yōu)勢(shì)物種組成與差異分析、單因素網(wǎng)絡(luò)分析、指示物種分析以及Spearman 相關(guān)性分析。

1.6 血清炎癥因子檢測(cè)

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照IL-10、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說(shuō)明書要求，檢測(cè)血清中IL-10、IL-6、TNF-α 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并滿足方差齊性時(shí)，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群物種多樣性分析

物種累計(jì)曲線結(jié)果顯示，伴隨樣本量的增加曲線整體走勢(shì)趨于平緩，提示兩組樣本量充足，測(cè)序數(shù)據(jù)基本覆蓋樣本中所有物種。Ace、Chao、Shannon、Coverage、Sobs、Simpson 指數(shù)可用于反映腸道菌群α 多樣性，結(jié)果顯示MOD 組Ace、Chao、Shannon、Coverage、Sobs 指數(shù)均低于CON 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01 或P<0.001），提示IBS-D 大鼠腸道菌群豐富度與多樣性明顯降低。樣本層級(jí)聚類分析可用于反映腸道菌群β 多樣性，結(jié)果顯示MOD 組樣本間菌群結(jié)構(gòu)相似，聚類在上方；CON 組中一個(gè)樣本與其他樣本差異度略高，其余聚類在下方?？傮w上MOD 組與CON 組基本分開，各自聚類為一簇，提示IBS-D 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，具體結(jié)果見圖1。

圖1 腸道菌群物種多樣性分析（n=6，x±s）

2.2 腸道菌群組成分析

優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度與腸道微生態(tài)功能變化密切相關(guān)。腸道菌群相對(duì)豐度表分析結(jié)果顯示，在門水平上，兩組大鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要?dú)w屬于擬桿菌門（Bacteroidota）與厚壁菌門（Firmicutes）。但兩組菌群相對(duì)豐度變化不同，結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD 組Bacteroidota 相對(duì)豐度升高，F(xiàn)irmicutes、脫硫菌門（Desulfobacterota）、變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）。在屬水平上，兩組大鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要?dú)w屬于普雷沃菌屬（Prevotella）與乳酸桿菌屬（Lactobacillus），組間差異結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD 組擬普雷沃菌屬 （Alloprevotella）相對(duì) 豐 度 升 高，Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae 相對(duì)豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體結(jié)果見表1。

表1 門、屬水平下腸道菌群相對(duì)豐度表（n=6，x±s）

2.3 腸道菌群?jiǎn)我蛩鼐W(wǎng)絡(luò)分析

單因素網(wǎng)絡(luò)分析可用于分析菌群之間相關(guān)性，網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)為species-node 節(jié)點(diǎn)，通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度分布、節(jié)點(diǎn)聯(lián)通性（Degree）等屬性，獲得各組菌群間相關(guān)性，并全面反映數(shù)據(jù)信息。選擇分類水平總豐度前30、相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.5（P<0.05）的物種，構(gòu)建屬水平單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)大小表示物種豐度；連線顏色表示正負(fù)相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)；線的粗細(xì)、數(shù)量表示物種之間的相關(guān)性。前部分研究中，在屬水平上進(jìn)行差異菌群組成分析發(fā)現(xiàn)，MOD 組中Alloprevotella 相對(duì)豐度較CON 組明顯上升，Lachnospiraceae_NK4A136_group 等菌屬相對(duì)豐度明顯降低，因此進(jìn)行重點(diǎn)研究。單因素網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，MOD 組中Alloprevotella 與羅氏菌屬（Roseburia）、羅 姆 布 茨 菌 屬 （Romboutsia）、Lachnospiraceae_NK4A136_group 呈 負(fù) 相 關(guān)；Lachnospiraceae_NK4A136_group 與Romboutsia、UCG-003、Oscillibacter、Roseburia 具 有 較 強(qiáng) 正 相 關(guān) 性，具體結(jié)果見圖2。

圖2 屬水平下腸道菌群?jiǎn)我蛩鼐W(wǎng)絡(luò)分析

2.4 腸道菌群指示物種分析

指示物種分析可用于處理存在顯著正效應(yīng)的微生物，同時(shí)兼顧存在組間差異的高豐度與低豐度菌群，區(qū)分正常大鼠與IBS-D 大鼠菌群差異性，進(jìn)而為研究菌群效應(yīng)及互作機(jī)制提供一定指導(dǎo)。選取屬水平上存在明顯差異 （P<0.05）的指示物種，依據(jù)指示能力與相對(duì)豐度繪圖，結(jié)果顯示CON組中指示物種主要包括鹽弧菌屬（Salinivibrio）、四聯(lián)菌屬（Tetragenococcus）等，MOD 組中指示物種主 要 包 括 Candidatus_Stoquefichus、Candidatus_Arthromitus 等，具體結(jié)果見圖3。

圖3 屬水平下指示物種分析

2.5 血清炎癥因子差異性分析

兩組血清炎癥因子分析結(jié)果顯示，與CON 組相比，MOD 組在IL-6、TNF-α 水平提高（P<0.01），在IL-10 水平降低（P<0.01），具體結(jié)果見圖4。

圖4 炎癥因子水平差異性分析（n=6，x±s）

2.6 腸道菌群與血清炎癥因子相關(guān)性分析

采用RDA 分析屬水平上兩組腸道菌群與炎癥因子（IL-10、IL-6 及TNF-α）的相關(guān)性，同時(shí)利用相關(guān)性Heatmap 圖直觀展示。選擇RDA 呈圖（Axis-lengths<3.5），紅色箭頭表示炎癥因子，炎癥因子箭頭方向顯示IL-6、TNF-α 對(duì)模型組影響程度最大，而IL-10 對(duì)正常組影響最大。腸道菌群投影與炎癥因子箭頭關(guān)聯(lián)顯示，模型組與IL-6、TNF-α 方向一致，呈正相關(guān)，與IL-10 方向相反，呈負(fù)相關(guān)；正常組與IL-6、TNF-α 方向相反，呈負(fù)相關(guān)，與IL-10 方向一致，呈正相關(guān)，具體結(jié)果見圖5。相關(guān)性Heatmap 圖結(jié)果顯示在門水平上，梭桿菌門（Fusobacteriota）、黏菌門（Myxococcota）、變形菌門（Proteobacteria）、Halanaerobiaeota 與IL-10呈正相關(guān)，Bacteroidota 與IL-10 呈負(fù)相關(guān)；Bacteroidota 與IL-6 呈正相關(guān)，Campilobacterota、Halanaerobiaeota 與IL-6 呈負(fù)相關(guān)；Desulfobacterota、Campilobacterota、Halanaerobiaeota 與TNF-α 呈負(fù)相 關(guān)。在 屬 水 平 上，Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella 與IL-10 呈負(fù)相關(guān)，而Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG-001 與IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)；Lachnospiraceae_NK4A136_group、UCG-003、Oscillibacter 與IL-10 呈正相關(guān)，與IL-6、TNF-α 呈負(fù)相關(guān)，上述結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01 或P<0.001），具體結(jié)果見圖6。

圖5 腸道菌群與炎癥因子RDA 分析

圖6 腸道菌群與炎癥因子相關(guān)性Heatmap 圖

3 討論

IBS-D 屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腹痛”等范疇，病位在大腸，多責(zé)之于肝脾。脾主運(yùn)化水谷津液，脾虛無(wú)以運(yùn)化，則生濕生痰，而濕證的病因病機(jī)與炎癥關(guān)系密切。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，痰濕的物質(zhì)基礎(chǔ)包括了炎癥反應(yīng)中的多種免疫產(chǎn)物，痰濕體質(zhì)更是處于慢性低度炎癥的潛在狀態(tài)［8］，因此IBS-D 存在的炎癥反應(yīng)與腸道菌群紊亂有關(guān)，而腸道菌群與炎癥在IBS-D 發(fā)生時(shí)亦可同時(shí)出現(xiàn)。既往研究中，有臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者雙歧桿菌、乳桿菌等菌群相對(duì)豐度降低，同時(shí)伴隨血清IL-6、IL-8 和TNF-α 水平升高［9］；也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IBS-D 大鼠促炎因子IL-8、MyD88 及TNF-α 均高于正常大鼠，而抗炎因子IL-10 與腸道益生菌群均低于正常大鼠［10］；更有研究直接指出腸道菌群與炎性因子之間可能存在相互作用關(guān)系［11］。這些證據(jù)均表明了IBS-D 腸道菌群與炎性因子具有相關(guān)性，而明確兩者的具體關(guān)系對(duì)于治療IBS-D 具有重要意義。

該試驗(yàn)通過(guò)“乙酸結(jié)腸灌注聯(lián)合束縛刺激法”構(gòu)建IBS-D 大鼠模型，并采用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)與ELISA 法血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)與血清炎癥因子發(fā)生改變，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析菌群與血清炎癥因子的具體關(guān)聯(lián)性。腸道優(yōu)勢(shì)菌群組成分析顯示，在門水平上，主要優(yōu)勢(shì)菌為Bacteroidota 與Firmicutes，與正常大鼠相比，模型組大鼠Bacteroidota 相對(duì)豐度升高，F(xiàn)irmicutes 相對(duì)豐度降低。研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroidota 可致使腸道炎癥，其所屬部分脆弱擬桿菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶與內(nèi)毒素脂多糖等致炎物質(zhì)，同時(shí)該菌門與Firmicutes 比例失衡下，會(huì)導(dǎo)致過(guò)度免疫損傷［12］。在屬水平上，模型組大鼠中Prevotella為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度的增加，可抑制抗炎因子表達(dá)，提高炎癥易感性［13］。同時(shí)組間差異結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，模型組大鼠Alloprevotella 相對(duì)豐度升高，而Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae 相對(duì)豐度降低。對(duì)模型組大鼠主要差異菌屬進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)豐度提高的Alloprevotella 與Roseburia、Romboutsia、Lachnospiraceae_NK4A136_group 呈負(fù)相關(guān)。Roseburia 是促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)、維持免疫穩(wěn)態(tài)并具有抗炎活性的一類腸道共生菌［14］；Romboutsia同樣屬于腸道正常菌群，該菌屬相對(duì)豐度的降低，可使腸道菌群與黏膜屏障之間的功能交互作用減弱，從而誘發(fā)低度炎癥反應(yīng)［15］。而相對(duì)豐度降低的Lachnospiraceae_NK4A136_group 與 Romboutsia、UCG -003、Oscillibacter、Roseburia 呈 正 相 關(guān)。Lachnospiraceae_NK4A136_group 隸 屬 于 Firmicutes，其相對(duì)豐度與丁酸等短鏈脂肪酸 （shortchain fatty acids，SCFAs）含量成正比，同時(shí)該菌屬能 夠 和 上 述Romboutsia、UCG-003、Oscillibacter、Roseburia 等益生菌相互協(xié)同發(fā)揮作用，共同參與維持腸道正常生理功能。指示物種分析發(fā)現(xiàn)，模型組 大 鼠 中 Candidatus_Stoquefichus、Candidatus_Arthromitus 等菌屬指示能力較強(qiáng)。Candidatus_Stoquefichus 相對(duì)豐度升高，與既往研究結(jié)果一致［16］；Candidatus_Arthromitus 為腸道黏膜共生菌，具有促進(jìn)免疫、清除腸道病原體作用［17］，然而目前關(guān)于兩者相關(guān)報(bào)道較少，能否作為IBS-D 大鼠與正常大鼠的鑒別物種，需要臨床進(jìn)一步研究。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，模型組與IL-6、TNF-α含量水平呈正相關(guān)，與IL-10 呈負(fù)相關(guān)；正常組與IL-6、TNF-α 含量水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-10 呈正相關(guān)。具體分析菌群與炎癥因子之間相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在門水平上，模型組大鼠主要優(yōu)勢(shì)菌Bacteroidota 與抗炎因子IL-10 呈負(fù)相關(guān)，與促炎因子IL-6 呈正相關(guān)。而另一個(gè)菌群Halanaerobiaeota 與IL-10 呈正相關(guān)，與IL-6、TNF-α 呈負(fù)相關(guān)，這也提示了Halanaerobiaeota 可能是IBS-D 炎癥反應(yīng)的保護(hù)菌群。在屬水平上，模型組大鼠主要差異菌屬Alloprevotella 與IL-10 呈負(fù)相關(guān)，而與IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，與已有臨床報(bào)道一致［18］。研究發(fā)現(xiàn)脾虛泄瀉大鼠的Alloprevotella 相對(duì)豐度提高，其能夠通過(guò)破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)腹痛、腹瀉等癥狀［19］。相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)，Bacteroidota 的2 個(gè)菌屬Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella 與IL-10 呈 負(fù) 相關(guān)，與IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)，而Firmicutes 的3個(gè) 菌 屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、UCG-003、Oscillibacter 與IL-10 呈 正 相 關(guān)，與IL-6、TNF-α 呈負(fù)相關(guān)。這也提示模型組大鼠的炎癥反應(yīng)主要與Firmicutes 和Bacteroidota 相對(duì)豐度的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，并且在屬水平上表現(xiàn)為Firmicutes 部分菌屬相對(duì)豐度降低、Bacteroidota 部分菌屬相對(duì)豐度升高，這種相互作用另加上其他菌門下菌屬的參與，共同導(dǎo)致IBS-D 炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。需要指出的是，參與IBS-D 發(fā)病的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，單一菌群對(duì)于疾病的作用有限，而多菌群的相互影響以及炎癥反應(yīng)等綜合作用可能才是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的原因［20］。該試驗(yàn)也存在著樣本量較少、免疫指標(biāo)檢測(cè)有限等局限性，有待繼續(xù)開展試驗(yàn)研究，并進(jìn)一步探索和分析IBS-D 發(fā)生發(fā)展中具有重要影響的菌群與免疫產(chǎn)物。

4 結(jié)論

與健康大鼠相比，IBS-D 大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)、血清炎癥因子均發(fā)生變化，且部分菌門、菌屬與IL-10、IL-6、TNF-α 存在相關(guān)性，這可能為腹瀉類相關(guān)疾病臨床檢測(cè)炎癥因子以指導(dǎo)益生菌或抗生素的選用提供有益參考。