原發(fā)性開角型青光眼房水中EPO、Sema3A、TGF-β1與視網(wǎng)膜纖維層厚度、視野缺損的相關(guān)性研

王丹 陳云珍 閆楠

原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是一種常見(jiàn)的視神經(jīng)退行性疾病,是導(dǎo)致眼盲的重要原因之一,主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損和視野缺損。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,主要與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致眼內(nèi)壓增高有關(guān)。眼內(nèi)微循環(huán)失調(diào)導(dǎo)致視乳頭血流灌注不足和局部缺血是引起視神經(jīng)病變的重要原因[1,2]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是紅細(xì)胞生成過(guò)程中重要的糖蛋白,眼部缺氧是紅細(xì)胞生成素與其受體結(jié)果促進(jìn)紅細(xì)胞釋放的重要原因;信號(hào)素3A(semaphorin3A,Sema3A)是一種多功能蛋白,在視網(wǎng)膜發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞軸突形成、血管發(fā)生中具有重要作用;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種多功能生長(zhǎng)因子,在多種細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、修復(fù)等過(guò)程發(fā)揮作用,但三者在POAG患者病情評(píng)估的報(bào)道較少[3,4]?；诖?本項(xiàng)研究擬以本院156例POAG患者為研究對(duì)象,檢測(cè)不同視野缺損程度患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平,分析其水平變化與患者視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損的關(guān)系,旨在為預(yù)防POAG患者病情進(jìn)展提供指導(dǎo)依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

前瞻性病例對(duì)照研究。選取本院2019年6月至2020年6月期間收治的156例(156只眼)POAG患者作為觀察組,并選取同期進(jìn)行手術(shù)的78例(78只眼)白內(nèi)障患者作為對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)白內(nèi)障患者術(shù)后視力校正0.6以上,屈光度±2.50D、試盤比<0.6,雙眼試盤差<0.2;(2)無(wú)青光眼相關(guān)癥狀(視乳頭損害、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層損害、視野缺損等);(3)常規(guī)視野檢測(cè)結(jié)果正常;(4)無(wú)青光眼疾病家族史及其它內(nèi)眼或視神經(jīng)疾病。

POAG觀察組根據(jù)患者視野缺損程度將患者分為A組(視野平均缺損程度≤-6 dB)55例、B組(視野平均缺損程度在-6 dB～-12 dB之間)66例和C組(視野平均缺損程度≥-12 dB)35例。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)青光眼患者符合全國(guó)青光眼學(xué)組提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],眼壓>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、青光眼性視乳頭損害和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層損害,或青光眼性視野缺損和前房角開放或全部符合即可確診為POAG[6];(2)初次就診;(3)無(wú)青光眼家族史;(4)患者知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并眼部外傷或內(nèi)眼手術(shù)史者;(2)合并心血管系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者;(3)合并視網(wǎng)膜和神經(jīng)病變者;(4)無(wú)法進(jìn)行光學(xué)相干斷層檢查者;(5)服用過(guò)免疫相關(guān)藥物者。研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

入院時(shí)搜集患者性別、年齡、血壓、心率等資料,然后進(jìn)行全面眼科檢查,測(cè)量眼壓、眼軸、前房深度及角膜中央厚度等,然后進(jìn)行視野檢查和相干光層析成像術(shù)(optical coherencetomography,OCT)檢查。術(shù)中取房水標(biāo)本保存待測(cè)。

三、觀察指標(biāo)

1. 一般資料比較:組間分析比較POAG患者和白內(nèi)障患者性別、年齡、眼軸、眼壓、視野平均缺損、杯盤比等一般資料情況。

2.2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平:于手術(shù)中進(jìn)行房水標(biāo)本采集,使用一次性無(wú)菌注射器于透明角膜緣穿刺進(jìn)入前房,緩慢抽取房水樣本50～100 μl,嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則,注入0.5 ml高壓滅菌的Eppendorf管中并作標(biāo)記,置于-80 ℃冰箱避光保存。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)房水中EPO水平。取房水樣本,用二喹啉酸試劑盒測(cè)定蛋白濃度,取20 μl蛋白濃度房水加入聚丙烯酰胺凝膠中,進(jìn)行電泳。然后置于硝酸纖維素膜,以5%脫脂牛奶室溫下封閉硝酸纖維素膜于4 ℃孵育2 h,加入稀釋好的一抗,過(guò)夜,加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶二抗,室溫孵育2 h。以β-catin作為內(nèi)參,凝膠成像顯影獲得Sema3A蛋白條帶,以蛋白條帶的灰度值計(jì)算Sema3A表達(dá)量。使用美國(guó)R&DSystems公司試劑盒,采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法檢測(cè)房水中TGF-β1水平,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線,將待測(cè)品孔每孔中加入房水樣本,并設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,于室溫下反應(yīng)2 h,以PBS洗滌5次,每孔加入一抗,于室溫孵育1 h,洗滌5次,加入二抗,于室溫孵育1 h,清洗反應(yīng)板,加入底物液,室溫避光反應(yīng)10 min,加入終止液,使用芬蘭Thermo公司酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度值。

3.組患者視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較:觀察組患者于入院就診時(shí)采用全自動(dòng)視野機(jī)進(jìn)行視野檢查,設(shè)置為24-2中心視野的閾值檢測(cè)程序,以SIT A-Fast統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算視野平均缺損程度,使用紅外攝像儀自動(dòng)監(jiān)測(cè)受檢眼的固視狀態(tài)。白內(nèi)障患者于術(shù)后第2周復(fù)查時(shí)進(jìn)行視野檢查。使用OCT(ZEISS,德國(guó))進(jìn)行視網(wǎng)膜纖維層厚度檢查,以視乳頭為掃描中心,掃描參數(shù)為:波長(zhǎng)840 mm,橫向分辨率15 μm,軸向分辨率5 μm,深度2 mm,直徑3.45 mm,長(zhǎng)度 12 mm,自動(dòng)獲取視盤周圍視網(wǎng)膜纖維層厚度,信號(hào)強(qiáng)度40分以上清晰圖像為檢查結(jié)果,檢查均由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成。然后進(jìn)行組間分析比較。

4.房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損程度的相關(guān)性分析:采用arson相關(guān)性分析房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平變化與視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損程度的關(guān)系。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、 一般資料比較

2組患者性別、年齡、眼軸等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性;而觀察組患者眼壓、視野平均缺損、杯盤比顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 一般資料比較

二、 2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比較

觀察組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平顯著高于對(duì)照組,且觀察組中B組和C組房水中EPO、GF-β1水平高于A組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比較

三、 2組患者視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較

觀察組患者視網(wǎng)膜纖維層厚度顯著低于對(duì)照組,且觀察組中B組和C組視網(wǎng)膜纖維層厚度低于A組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);觀察組患者視野平均缺損程度顯著高于對(duì)照組,且觀察組中B組和C組視野平均缺損程度顯著高于A組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組患者視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較

四、房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,房水中EPO水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= -0.348,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.518,P<0.05);房水中Sema3A水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= -0.426,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.629,P<0.05);房水中TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.457,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.532,P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損的相關(guān)性分析

討 論

POAG因早期無(wú)明顯癥狀,不易發(fā)生,具有較高潛在風(fēng)險(xiǎn)。臨床以O(shè)CT檢查測(cè)量視網(wǎng)膜纖維層厚度幫助早期診斷,但對(duì)無(wú)視野缺損患者存在一定爭(zhēng)議,影響其應(yīng)用[7,8]。尋找可評(píng)估POAG患者視網(wǎng)膜纖維層厚度和視野缺損程度的生物學(xué)指標(biāo),幫助早期診斷及治療是目前臨床重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容[9,10]。POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1顯著升高,且其水平隨視網(wǎng)膜纖維層厚度的變薄,視野缺損程度的加重而逐漸升高,可為預(yù)防POAG病情進(jìn)展提供重要參考。

本次研究結(jié)果顯示:觀察組患者眼壓、視野平均缺損、杯盤比顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明POAG的發(fā)生與患者眼壓、視野缺損及杯盤比有關(guān)。究其原因,青光眼主要與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突丟失導(dǎo)致盤沿、視乳頭心態(tài)凹陷、視網(wǎng)膜纖維層厚度改變,進(jìn)而導(dǎo)致視野缺損,甚至失明[11,12]。當(dāng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失30%時(shí)視功能損害,隨著丟失數(shù)量的升高,損害程度加重。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失,刺激眼壓升高,眼內(nèi)微循環(huán)改變,眼部缺氧導(dǎo)致視神經(jīng)病變,進(jìn)而參與青光眼疾病進(jìn)展[13,14]。并且,觀察組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平和視野缺損顯著高于對(duì)照組,而視網(wǎng)膜纖維層厚度低于對(duì)照組,說(shuō)明POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平顯著升高,視野缺損程度加重,視網(wǎng)膜纖維層變薄,而隨著視野缺損程度的不斷加重,視網(wǎng)膜纖維層逐漸變薄,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平逐漸升高,提示房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度和視野缺損程度密切相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網(wǎng)膜纖維層厚度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與視野缺損程度呈相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果提示:可通過(guò)檢測(cè)POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平了解患者視網(wǎng)膜纖維層厚度變化情況及視野缺損程度情況,進(jìn)而為早期診斷及治療提供依據(jù)。這可能是因?yàn)榫植咳毖跽T導(dǎo)虹膜血管異常新生,纖維血管膜收縮,刺激眼內(nèi)壓升高,導(dǎo)致小梁網(wǎng)粘黏,房水無(wú)法正常排出,加重眼壓,進(jìn)而影響視神經(jīng)[15,16]。EPO是促進(jìn)血管生成的糖蛋白激素,視網(wǎng)膜損害時(shí)EPO可通過(guò)刺激紅系祖細(xì)胞分化、增生,促進(jìn)神經(jīng)血管生長(zhǎng),保護(hù)患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受損傷。局部缺氧時(shí),視乳頭血流灌注不足及局部缺血,細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫含量減少會(huì)促進(jìn)紅細(xì)胞生成,進(jìn)而導(dǎo)致EPO水平升高,其水平升高時(shí)可促進(jìn)新生血管生成,致使眼壓升高。同時(shí),EPO升高還會(huì)引起虹膜組織黏連,影響血流動(dòng)力學(xué),進(jìn)而導(dǎo)致眼部微循環(huán)失調(diào),導(dǎo)致視野缺損,影響視功能[17,18]。Sema3A對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞軸突形成、血管發(fā)生產(chǎn)生具有較好調(diào)控作用,通常在缺血缺氧環(huán)境下發(fā)揮作用?？赏ㄟ^(guò)與受體神經(jīng)纖毛蛋白1結(jié)合介導(dǎo)促血管新生,阻礙視網(wǎng)膜血管重建,同時(shí)進(jìn)一步加重缺氧,還可通過(guò)破壞內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接,促進(jìn)視網(wǎng)膜血管閉塞和缺氧,進(jìn)而刺激血管異常新生,加重小梁網(wǎng)阻塞,最終促使眼壓升高[19,20]。TGF-β1是一種具有多種生物活性的多肽類生長(zhǎng)因子,在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)合成等過(guò)程發(fā)揮重要功能。TGF-β1可通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞的增殖來(lái)加固新生血管結(jié)構(gòu),還可作用于小梁網(wǎng),導(dǎo)致房水流出減少,進(jìn)而直接導(dǎo)致眼壓升高,參與青光眼進(jìn)展過(guò)程[21]。因此,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1可通過(guò)調(diào)控新生血管生成,并通過(guò)促使小梁網(wǎng)細(xì)胞凋亡,阻礙房水排出,加重眼壓,加劇視野缺損。因此,原發(fā)性開角型青光眼患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視野缺損加重,視網(wǎng)膜纖維層厚度變薄密切相關(guān),可為POAG預(yù)防病情進(jìn)展及治療提供新方向。

綜上所述,POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1顯著升高,其水平與患者與視網(wǎng)膜纖維層厚度及視野缺損程度密切相關(guān),檢測(cè)其水平可幫助患者病情評(píng)估,進(jìn)而為預(yù)防POAG病情進(jìn)展提供重要參考依據(jù),具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值。