表皮蛋白基因參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成

陳二虎，沈丹蓉，杜文蔚，孟宏杰，唐培安

表皮蛋白基因參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成

南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

【目的】作為昆蟲表皮重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，表皮蛋白（cuticle protein，CP）在昆蟲對(duì)農(nóng)藥表皮穿透抗性形成過程中承擔(dān)重要作用。銹赤扁谷盜（）磷化氫抗性問題日益突出，論文旨在揭示表皮蛋白基因在該害蟲磷化氫抗性形成過程中的作用?！痉椒ā炕诼?lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦的生物測定方法解析5個(gè)地理種群（張家港、湘陰、淮安、懷化和太倉種群)銹赤扁谷盜磷化氫敏感性差異。首先通過銹赤扁谷盜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲得4個(gè)表皮蛋白基因，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行分析。利用基因定量技術(shù)（RT-qPCR）解析上述4個(gè)銹赤扁谷盜表皮蛋白基因時(shí)空（不同發(fā)育階段和成蟲不同組織）和不同磷化氫抗性水平下的表達(dá)模式，以及表皮蛋白基因?qū)α谆瘹涿{迫響應(yīng)的表達(dá)模式。使用RNAi（RNA interference）技術(shù)對(duì)特定的表皮蛋白基因（）進(jìn)行沉默，并研究被有效沉默后銹赤扁谷盜磷化氫敏感性變化情況?！窘Y(jié)果】磷化氫敏感性測定結(jié)果顯示，不同地理種群銹赤扁谷盜磷化氫敏感性水平差異顯著，藥劑抗性倍數(shù)（RR）范圍為7.2—1 906.8。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白均隸屬于CPR家族RR2亞家族，且它們氨基酸序列都擁有RR2型幾丁質(zhì)結(jié)合域，將其分別命名為、、和?；虮磉_(dá)模式分析顯示4個(gè)表皮蛋白基因均在銹赤扁谷盜蛹期特異性高表達(dá)，且在成蟲外周組織中表達(dá)水平較高；此外，表皮蛋白基因均在磷化氫極高抗種群中（太倉種群，RR=1 906.8）顯著高表達(dá)，且銹赤扁谷盜經(jīng)磷化氫熏蒸脅迫后，表皮蛋白基因可被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。最后，選擇進(jìn)行功能驗(yàn)證，注射dsRNA干擾極高抗種群（TC）的表達(dá)后，導(dǎo)致銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫抗性水平顯著降低?！窘Y(jié)論】表皮蛋白基因過表達(dá)參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成。

銹赤扁谷盜；磷化氫抗性；表皮蛋白；RNA干擾

0 引言

【研究意義】磷化氫（phosphine，PH3）是國際上使用最為廣泛的儲(chǔ)糧害蟲熏蒸劑，用于防治赤擬谷盜（）、銹赤扁谷盜（）、谷蠹（）等儲(chǔ)糧害蟲[1-3]。然而，由于糧食倉儲(chǔ)行業(yè)對(duì)這種熏蒸劑的長期過度使用，導(dǎo)致不同種類儲(chǔ)糧害蟲均對(duì)磷化氫產(chǎn)生一定程度的抗性，其中尤以銹赤扁谷盜的抗性問題最為突出，已經(jīng)成為制約糧食行業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素[4-5]。盡管磷化氫抗性發(fā)生嚴(yán)重，但目前尚無其他熏蒸劑可以取而代之，因此磷化氫抗性已經(jīng)對(duì)國家糧食安全構(gòu)成巨大威脅，是糧食行業(yè)亟需解決的問題。避免和減緩磷化氫抗性發(fā)展已成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)，開展磷化氫抗性形成分子機(jī)制的研究，對(duì)緩解糧食行業(yè)面臨的困局具有重要意義[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)磷化氫作用機(jī)制及昆蟲抗藥性形成機(jī)理的研究結(jié)果表明，磷化氫主要利用害蟲的呼吸作用進(jìn)入蟲體內(nèi)，其作用靶標(biāo)為線粒體組織，因而昆蟲可通過調(diào)節(jié)線粒體和呼吸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，降低呼吸速率，減少熏蒸劑的吸收，進(jìn)而使昆蟲獲得磷化氫抗性[7-8]。例如，赤擬谷盜和谷蠹磷化氫抗性品系的呼吸速率顯著低于敏感品系[9-10]，而且昆蟲磷化氫抗性形成還與線粒體二聚體酶二氫硫辛酰胺脫氫酶基因突變密切相關(guān)[11-12]。此外，解毒代謝途徑是形成磷化氫抗性的另一個(gè)重要機(jī)制，包括細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶（carboxylesterase）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase）等解毒代謝酶均被證實(shí)參與赤擬谷盜等儲(chǔ)糧害蟲的磷化氫抗性形成[13-14]。同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲可通過提高表皮蛋白、幾丁質(zhì)合成酶等基因的轉(zhuǎn)錄水平來改變表皮結(jié)構(gòu)和增厚表皮，從而降低表皮穿透性來阻止或減少殺蟲劑進(jìn)入蟲體，進(jìn)而形成抗藥性，證明昆蟲表皮穿透性亦可介導(dǎo)昆蟲抗藥性形成[15-17]。例如，德國小蠊（）表皮相關(guān)基因的過表達(dá)引起上表皮碳?xì)浠衔锖吭黾樱砥ねㄍ感燥@著降低，造成昆蟲對(duì)高效氯氰菊酯產(chǎn)生抗性[18-19]。昆蟲表皮的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)包括幾丁質(zhì)和表皮蛋白，其中表皮蛋白種類繁多，并且其在昆蟲中的表達(dá)模式具有明顯的時(shí)空特異性。表皮蛋白家族基因數(shù)量眾多，約占基因總數(shù)的1%，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，主要包括CPR（擁有Rebers and Riddiford（R&R）保守基序）、CPAP1（含1個(gè)ChtBD2幾丁質(zhì)結(jié)合域）、CPAP3（含3個(gè)ChtBD2幾丁質(zhì)結(jié)合域）、Tweedle（含4個(gè)氨基酸保守區(qū)域）、CPF（含44個(gè)氨基酸的保守區(qū)域）等10余個(gè)家族類群[20-21]。表皮蛋白在昆蟲表皮各層中均有分布和表達(dá)[22-23]，且前人研究已經(jīng)證實(shí)表皮蛋白基因參與介導(dǎo)昆蟲對(duì)不同藥劑的抗性形成過程[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】表皮蛋白基因介導(dǎo)昆蟲對(duì)殺蟲劑穿透抗性的研究已逐漸成為熱點(diǎn)問題，之前的研究發(fā)現(xiàn)表皮蛋白基因和參與赤擬谷盜磷化氫抗性形成，進(jìn)一步證明二者之間存在密切聯(lián)系[24]。鑒于此，本研究以磷化氫抗性問題突出的銹赤扁谷盜為研究對(duì)象，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，分別采集不同地理種群試蟲，綜合運(yùn)用生物測定、RT-qPCR、RNA干擾等方法探究表皮蛋白基因與磷化氫抗性間的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】闡釋表皮蛋白基因介導(dǎo)銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成的基本科學(xué)問題，為儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年3月至2021年6月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院儲(chǔ)糧害蟲防治實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)所用5個(gè)地理種群銹赤扁谷盜于2016年采自張家港（Zhangjiagang，ZJG）、湘陰（Xiangyin，XY）、淮安（Huaian，HA）、懷化（Huaihua，HH）和太倉（Taicang，TC）儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)20代以上。試驗(yàn)過程中所使用的人工飼料配方為全麥粉﹕酵母粉=19﹕1，無光照，飼養(yǎng)條件為溫度（30±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%。

1.2 磷化氫敏感性測定

基于聯(lián)合國糧農(nóng)組織（1975）推薦的磷化氫生物測定方法：將試蟲置于廣口熏蒸瓶并密封瓶口，平衡4 h后注入不同濃度磷化氫氣體，正常試蟲飼養(yǎng)條件下密閉熏蒸20 h；處理結(jié)束后于通風(fēng)櫥中散去磷化氫氣體（約10 min），待氣體散去后統(tǒng)計(jì)試蟲死亡數(shù)量（毛筆輕觸蟲體尾部，附肢無反應(yīng)即為死亡），連續(xù)統(tǒng)計(jì)14 d。生物測定試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，所選試蟲均為7日齡成蟲，每個(gè)重復(fù)包含50頭試蟲。以聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的磷化氫敏感基線（LC50=0.011 mg·L-1）進(jìn)行銹赤扁谷盜抗性倍數(shù)（resistance ratio，RR）的計(jì)算。抗性倍數(shù)=不同地理種群銹赤扁谷盜LC50/0.011 mg·L-1。其中，抗性倍數(shù)介于2.5—10為低抗性，10—40倍為中等抗性，160倍以上為極高抗性。

1.3 生物信息學(xué)分析

依據(jù)銹赤扁谷盜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（accession number：SRA245468），鑒定獲得4個(gè)表皮蛋白基因，分別使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html）、SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP）和在線軟件InterPro（http://www.ebi.ac. uk/interpro/search/sequence-search）預(yù)測表皮蛋白基因的完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）、信號(hào)肽和保守特征氨基酸序列。針對(duì)系統(tǒng)發(fā)育分析研究，首先使用ClustalW軟件對(duì)昆蟲表皮蛋白進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)，接著利用鄰接法（neighbor- joining，NJ）在Mega 6.0軟件中構(gòu)建銹赤扁谷盜和赤擬谷盜表皮蛋白的進(jìn)化樹，各樹分支1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)[25]。

1.4 不同發(fā)育階段表皮蛋白基因表達(dá)模式分析

銹赤扁谷盜（張家港種群）不同發(fā)育階段樣品收集：將蟲卵在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)至卵孵化，分別收集1—4齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹和7日齡成蟲各30頭。用Trizol法提取各樣品總RNA（RNA濃度為500—600 ng·μL-1），RQ1 Rnase-Free Dnase清除基因組DNA。通過核酸濃度測定儀進(jìn)行樣本RNA濃度和純度測定，同時(shí)使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品RNA完整性進(jìn)行檢測。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技有限公司，中國）合成第一鏈cDNA，所獲得的目標(biāo)產(chǎn)物于-20℃冰箱中進(jìn)行保存，以備后續(xù)使用。

銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白基因的特異性RT-qPCR引物如表1所示，以和為內(nèi)參基因[26]。定量PCR試驗(yàn)使用20 μL反應(yīng)體系，并利用ChamQTMSYBR? qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）試劑盒開展試驗(yàn)，反應(yīng)液包括2 μL Template cDNA、10 μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）、上下游引物各1 μL、Rnaes-free water 6 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃延伸30 s（40個(gè)循環(huán)），最后95℃延伸30 s，整個(gè)PCR過程均在ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）中進(jìn)行。利用2-??Ct方法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析[27]。

1.5 不同組織表皮蛋白基因表達(dá)模式分析

解剖羽化后7日齡成蟲50頭（張家港種群試蟲），分別收集不同組織部位表皮（頭、胸、腹）、翅、足、脂肪體的樣本。總RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR試驗(yàn)均參照1.4節(jié)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 不同地理種群表皮蛋白基因的表達(dá)模式分析

供試銹赤扁谷盜試蟲分別采自張家港、湘陰、淮安、懷化和太倉，每個(gè)地理種群分別選取30頭7日齡成蟲為一個(gè)樣本，總RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR試驗(yàn)參照1.4節(jié)，共設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 磷化氫脅迫下表皮蛋白基因表達(dá)模式分析

選取銹赤扁谷盜張家港種群7日齡成蟲開展磷化氫脅迫試驗(yàn)。根據(jù)1.2節(jié)磷化氫敏感性測定結(jié)果，采用LC30作為磷化氫熏蒸濃度，熏蒸處理1、2、6和12 h后快速挑取存活的試蟲轉(zhuǎn)入液氮冷凍備用。參照1.4節(jié)的方法進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR試驗(yàn)，共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)均包含50頭試蟲。

表1 本研究所用引物序列

1.8 RNA干擾后CfRR2-1表達(dá)量檢測及磷化氫敏感性測定

選擇進(jìn)行功能驗(yàn)證，根據(jù)基因序列信息設(shè)計(jì)含有T7啟動(dòng)子的引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)T7 RiboMAXTMExpress RNA（Promega）試劑盒體外合成ds和ds。參照Huang等[13]的方法，將100 nL（1 μg·μL-1）dsRNA注射到銹赤扁谷盜（太倉種群試蟲）蛹內(nèi)（注射位置為蛹的腹側(cè)第一節(jié)或第二節(jié)），以注射等量ds和正常飼養(yǎng)的試蟲作為對(duì)照。待蛹羽化后正常飼養(yǎng)，收集第7天成蟲。參照1.4節(jié)的方法進(jìn)行總RNA提取，合成cDNA，并采用基因定量技術(shù)檢測相應(yīng)表皮蛋白基因（）的沉默效率。最后，被有效沉默后進(jìn)行磷化氫敏感性檢測，選取7日齡成蟲，并以磷化氫的亞致死濃度（LC30）對(duì)試蟲進(jìn)行處理，并參照1.2節(jié)方法進(jìn)行熏蒸以及統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量，以此分析磷化氫敏感性變化情況。共設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)均包含30頭試蟲。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其中對(duì)于基因表達(dá)模式、基因沉默效率和試蟲死亡率數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行均值多重比較，并利用圖基檢驗(yàn)法（Tukey’s test）進(jìn)行顯著性分析（＜0.05）；基于獨(dú)立樣本檢驗(yàn)（student-test）對(duì)磷化氫脅迫下基因表達(dá)模式進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)比較的顯著性差異分析（*＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 不同地理種群銹赤扁谷盜磷化氫敏感性

5個(gè)地理種群銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫抗性倍數(shù)介于7.2—1 906.8（表2）。其中張家港（ZJG，抗性倍數(shù)=7.2）屬于低抗性種群，湘陰（XY，抗性倍數(shù)=29.6）屬于中等抗性種群，淮安（HA，抗性倍數(shù)=325.4）、懷化（HH，抗性倍數(shù)=362.7）和太倉（TC，抗性倍數(shù)=1 906.8）均屬于極高抗性種群。

表2 不同地理種群銹赤扁谷盜磷化氫敏感性測定

2.2 銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白序列分析

表皮蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析表明銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白基因均隸屬昆蟲CPR家族的RR2亞家族，分別命名為、、和（圖1-A）。氨基酸序列分析顯示上述4個(gè)表皮蛋白基因分別編碼172、176、145和173個(gè)氨基酸（圖1-B），其中CfRR2-1蛋白信號(hào)肽序列位于第1—20氨基酸位點(diǎn)，CfRR2-2、CfRR2-3和CfRR2-4蛋白信號(hào)肽序列均位于第1—18氨基酸位點(diǎn)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明CfRR2-1（第63—131個(gè)氨基酸）、CfRR2-2（第60—128個(gè)氨基酸）、CfRR2-3（第50—118個(gè)氨基酸）和CfRR2-4（第59—127個(gè)氨基酸）蛋白序列均包含R&R（Rebers and Riddiford）型特征序列（pfam00379），且上述表皮蛋白的保守區(qū)域均屬于典型的RR2幾丁質(zhì)結(jié)合域（圖1-B）。

紅色圓圈代表銹赤扁谷盜表皮蛋白，黑框代表信號(hào)肽序列，紅色框代表保守結(jié)構(gòu)域

2.3 表皮蛋白基因在銹赤扁谷盜不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

表皮蛋白基因在銹赤扁谷盜不同發(fā)育階段的表達(dá)模式顯示、、和在幼蟲期和成蟲期表達(dá)水平相對(duì)較低，均在蛹期表達(dá)量最高，呈現(xiàn)特異性高表達(dá)，且表達(dá)水平均顯著高于其他發(fā)育階段（＜0.05）（圖2）。

2.4 表皮蛋白基因在銹赤扁谷盜不同組織表達(dá)模式

銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白基因均在昆蟲外周組織高表達(dá)（圖3）。其中在銹赤扁谷盜成蟲胸部表皮和翅中表達(dá)水平顯著高于其他組織（＜0.05），在頭部和腹部表皮的表達(dá)量次之，且它們的表達(dá)水平均高于內(nèi)部組織脂肪體（圖3-A）；在試蟲頭部表皮組織顯著高表達(dá)（＜0.05），在其他組織間表達(dá)量無顯著差異（圖3-B）；除在外周組織翅和足中顯著高表達(dá)，還在昆蟲內(nèi)部組織脂肪體高表達(dá)，且基因表達(dá)量顯著高于頭、胸和腹部表皮組織（＜0.05）（圖3-C）；只在銹赤扁谷盜翅組織特異性高表達(dá)（＜0.05），在頭、胸和腹部表皮組織、足和脂肪體表達(dá)量均相對(duì)較低（圖3-D）。

L1—L4：1—4齡幼蟲1st-4th instar larva；PP：預(yù)蛹期pre-pupal stage；P：蛹期pupal stage；A：成蟲adult

H：頭部表皮Head cuticle；T：胸部表皮Thorax cuticle；A：腹部表皮Abdomen cuticle；W：翅Wing；L：足Leg；Fb：脂肪體Fat body

2.5 表皮蛋白基因在不同地理種群銹赤扁谷盜中的表達(dá)模式

、、和均在極高抗種群（太倉種群）中特異性高表達(dá)，且其表達(dá)水平與其他種群間差異顯著（＜0.05）。在張家港、湘陰、淮安和懷化種群間，上述4個(gè)表皮蛋白基因的表達(dá)水平均無顯著差異（圖4）。

2.6 磷化氫脅迫下表皮蛋白基因的表達(dá)模式

銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白基因均可被磷化氫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，且在12 h內(nèi)基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖5）。其中、和表達(dá)量在磷化氫熏蒸后2 h達(dá)到峰值，分別是對(duì)照組的2.0、3.5和3.5倍；表達(dá)量在熏蒸處理6 h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.8倍。

圖4 銹赤扁谷盜表皮蛋白基因在不同磷化氫抗性種群中的表達(dá)模式

2.7 表皮蛋白基因沉默對(duì)銹赤扁谷盜磷化氫敏感性的影響

利用RNAi技術(shù)有效沉默極高抗種群（太倉種群）的表達(dá)，分析表皮蛋白基因與磷化氫抗性形成的關(guān)系?；蚨縋CR結(jié)果顯示RNA干擾能有效沉默的表達(dá)，沉默效率達(dá)60%，且ds注射組與空白對(duì)照組間表皮蛋白基因表達(dá)量無顯著差異（圖6-A）。有效沉默的表達(dá)后，銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫的抗性水平顯著降低，磷化氫（LC30）處理后試蟲死亡率較對(duì)照組顯著升高（＜0.05），且空白對(duì)照組和ds處理組之間試蟲死亡率無顯著差異（圖6-B）。

3 討論

3.1 銹赤扁谷盜磷化氫抗性發(fā)生嚴(yán)重

由于磷化氫熏蒸劑在世界范圍內(nèi)的大量使用，導(dǎo)致眾多儲(chǔ)糧害蟲對(duì)磷化氫產(chǎn)生不同程度的抗藥性，其中尤以銹赤扁谷盜磷化氫抗性問題最為突出，已逐漸成為限制世界各國糧食儲(chǔ)藏行業(yè)健康發(fā)展的制約因素之一，目前已經(jīng)在美國、印度、澳大利亞等國家發(fā)現(xiàn)銹赤扁谷盜的磷化氫抗性種群，且其抗性水平遠(yuǎn)高于其他儲(chǔ)糧害蟲[28-29]。已有研究報(bào)道銹赤扁谷盜是磷化氫抗性發(fā)生最為嚴(yán)重的糧食倉儲(chǔ)害蟲之一，且其在世界范圍內(nèi)分布廣泛，一旦發(fā)生危害便能給國家糧食行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1,6]。本研究中，分別采集獲得5個(gè)地理種群的銹赤扁谷盜，進(jìn)一步的磷化氫生物測定結(jié)果顯示銹赤扁谷盜磷化氫抗性倍數(shù)最高可達(dá)1 900余倍（表2）。該研究結(jié)果也直接證實(shí)了銹赤扁谷盜抗性問題在我國日益嚴(yán)重，抗性水平甚至已經(jīng)達(dá)到難以控制的地步。然而，目前銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫產(chǎn)生抗性的機(jī)理研究卻嚴(yán)重滯后，相關(guān)磷化氫抗性分子機(jī)制尚屬未知。

圖6 CfRR2-1沉默效率及基因沉默后磷化氫敏感性變化

3.2 銹赤扁谷盜表皮蛋白具有CPR家族典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

近年來，表皮蛋白基因介導(dǎo)殺蟲劑穿透抗性已逐漸成為熱點(diǎn)研究問題[17]，但表皮蛋白介導(dǎo)磷化氫抗性的報(bào)道較為鮮見。值得注意的是，已有研究表明磷化氫不但可以利用呼吸作用伴隨空氣主動(dòng)進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，亦可通過擴(kuò)散作用穿透表皮進(jìn)入蟲體：當(dāng)昆蟲呼吸急促時(shí)，呼吸作用表現(xiàn)為主要吸收途徑；而當(dāng)昆蟲呼吸作用逐漸減弱時(shí)，表皮穿透作用則上升為主要方式，表皮蛋白影響表皮穿透性，因此表皮蛋白基因與磷化氫抗性形成可能存在密切聯(lián)系[30-31]。本研究在銹赤扁谷盜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定獲得4個(gè)表皮蛋白基因，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示它們均隸屬于表皮蛋白CPR家族的RR2亞家族（圖1-A）。對(duì)家蠶（）和雙叉犀金龜（）的研究表明，CPR家族蛋白與不同類型幾丁質(zhì)間存在相互作用和結(jié)合特性[32-33]。氨基酸序列分析表明銹赤扁谷盜4個(gè)表皮蛋白均包含保守的RR2型幾丁質(zhì)結(jié)合域，具備潛在的幾丁質(zhì)結(jié)合能力（圖1-B），該特征與昆蟲CPR家族蛋白所具備的保守幾丁質(zhì)結(jié)合域相符。

3.3 銹赤扁谷盜表皮蛋白基因具有發(fā)育階段和組織表達(dá)特異性

表皮蛋白CPR家族主要包含RR1和RR2兩個(gè)亞家族，研究表明上述兩個(gè)亞家族基因的表達(dá)模式具有明顯的組織特異性，即RR1亞家族蛋白主要存在于柔軟表皮組織中（如昆蟲幼蟲表皮），RR2亞家族蛋白通常參與昆蟲堅(jiān)硬表皮組織的形成[34]。與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)、、和在幼蟲階段的表達(dá)均維持在較低水平，而在擁有堅(jiān)硬外殼的蛹期階段顯著高表達(dá)（圖2）。成蟲不同組織表達(dá)水平分析顯示，4個(gè)表皮蛋白基因均在銹赤扁谷盜外周表皮組織高表達(dá)（圖3），暗示上述表皮蛋白可能是組成昆蟲表皮的重要物質(zhì)之一，參與表皮形成過程，承擔(dān)表皮相關(guān)的重要功能。大量研究已經(jīng)證實(shí)表皮蛋白基因在昆蟲外周組織中具有較強(qiáng)的表達(dá)特異性[35]，如褐色橘蚜（）CPR家族基因在胸腹部表皮的表達(dá)量顯著高于頭部表皮組織[36]。本研究發(fā)現(xiàn)銹赤扁谷盜表皮蛋白基因表達(dá)模式同樣具有復(fù)雜性和特異性，如在頭胸腹表皮和翅中表達(dá)水平顯著高于其他組織（圖3-A），（圖3-B）和（圖3-D）分別在頭部表皮和翅中特異性高表達(dá)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)除在外周組織中高表達(dá)（圖3-C），還在內(nèi)部器官脂肪體中顯著高表達(dá)。脂肪體承擔(dān)昆蟲眾多生理功能，其中免疫反應(yīng)尤為重要，例如家蠶脂肪體中發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)表皮蛋白基因，已被證實(shí)參與昆蟲對(duì)大腸桿菌的識(shí)別反應(yīng)[37]。銹赤扁谷盜在成蟲脂肪體高表達(dá)，據(jù)此推斷該表皮蛋白可能在昆蟲免疫過程中發(fā)揮重要作用。

3.4 沉默表皮蛋白基因CfRR2-1顯著增強(qiáng)銹赤扁谷盜磷化氫敏感性

表皮蛋白基因在不同地理種群銹赤扁谷盜中的表達(dá)量分析顯示，、、和均在磷化氫極高抗種群（太倉）中特異性高表達(dá)（圖4）。在赤擬谷盜[31]、桃蚜（）[38]、中華按蚊（）[39]、淡色庫蚊（）[40-41]、岡比亞按蚊（）[42]、溫帶臭蟲（）[43]等昆蟲中同樣發(fā)現(xiàn)表皮蛋白CPR家族基因在藥劑抗性品系中顯著高表達(dá)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示在經(jīng)磷化氫熏蒸脅迫處理6 h內(nèi)，4個(gè)表皮蛋白基因均可被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，可能是銹赤扁谷盜響應(yīng)磷化氫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)（圖5）。類似地，經(jīng)甲氧蟲酰肼藥劑脅迫處理后，棉鈴蟲（）2個(gè)表皮蛋白CPR家族基因表達(dá)量顯著升高[44]，橘小實(shí)蠅（）經(jīng)馬拉硫磷處理后，同樣發(fā)現(xiàn)眾多表皮蛋白基因的表達(dá)量顯著升高[45]。

4個(gè)表皮蛋白基因中只有在銹赤扁谷盜外周組織翅和頭胸腹表皮中均具有較高表達(dá)水平，且表達(dá)量都顯著高于內(nèi)部組織脂肪體，暗示其可能在表皮中承擔(dān)著重要生理功能?；诖?，本研究選擇開展進(jìn)一步的功能研究。使用RNAi技術(shù)對(duì)進(jìn)行有效沉默，發(fā)現(xiàn)經(jīng)磷化氫（LC30）處理后銹赤扁谷盜的死亡率顯著升高（圖6），證明表達(dá)水平降低后，銹赤扁谷盜對(duì)于磷化氫的敏感性顯著增強(qiáng)。同樣地，淡色庫蚊表皮蛋白基因表達(dá)水平在擬除蟲菊酯抗性品系中顯著上調(diào)，且該表皮蛋白主要在試蟲外周組織足和翅中高表達(dá)，利用siRNA沉默該基因?qū)е潞οx表皮厚度顯著降低，通透性增加，進(jìn)而殺蟲劑在昆蟲體表滲透率升高，最終引起試蟲對(duì)藥劑敏感性顯著增強(qiáng)[41]。在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系和溫帶臭蟲抗氟氯氰菊酯品系均發(fā)現(xiàn)表皮蛋白CPR家族基因顯著上調(diào)，且利用RNAi技術(shù)對(duì)表達(dá)量上調(diào)的表皮蛋白基因進(jìn)行有效沉默，害蟲對(duì)農(nóng)藥的抗性水平均顯著下降[40,43]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果可得出特定的表皮蛋白基因參與銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫抗性形成，進(jìn)一步推測該害蟲可能通過上調(diào)特定表皮蛋白基因的表達(dá)量來增加表皮厚度或改變表皮結(jié)構(gòu)和組分，從而減小表皮穿透性，降低磷化氫體表滲入，最終形成抗藥性[17]。

4 結(jié)論

銹赤扁谷盜磷化氫敏感性檢測結(jié)果表明我國儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性發(fā)生嚴(yán)重；表皮蛋白CfRR2-1、CfRR2-2、CfRR2-3和CfRR2-4均包含RR2型幾丁質(zhì)結(jié)合域，暗示它們具有潛在幾丁質(zhì)結(jié)合能力；上述4個(gè)表皮蛋白基因具有明顯發(fā)育階段和組織表達(dá)特異性，均在磷化氫極高抗種群中顯著高表達(dá)，且磷化氫脅迫可誘導(dǎo)表皮蛋白基因表達(dá)；通過RNAi干擾技術(shù)沉默特定表皮蛋白基因，銹赤扁谷盜磷化氫敏感性顯著升高。綜上，表皮蛋白基因的過表達(dá)與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成密切相關(guān)。

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Cuticle Protein Genes are Involved in Phosphine Resistance of

College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety of Jiangsu Province/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Province, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023

【Objective】As an important structural component of insect cuticle, the cuticle protein (CP) plays an important role in the formation of cuticle penetration resistance to pesticides. The phosphine resistance ofis increasingly prominent, and the current study was conducted to reveal the roles of CP genes in the formation of phosphine resistance in.【Method】According to the phosphine bioassay method that recommended by the Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), the difference in phosphine sensitivity from five geographical populations (Zhangjiagang, Xiangyin, Huaian, Huaihua and Taicang populations) ofwas analyzed. The four CP genes were identified from the previous transcriptome data of,and then the phylogenetic tree of CPs was constructed and the corresponding amino acid sequence ofCPs was further analyzed. Afterwards, the RT-qPCR was used to analyze the spatio-temporal (different developmental stages and different tissues of adults) expression patterns of four CP genes, and their expression levels under different phosphine resistance levels, as well as the expression patterns of four CP genes in response to phosphine stress were explored. Subsequently, a specific CP gene () was selected to be knocked down by using RNAi (RNA interference) technology, and the change of phosphine sensitivity ofwas determined.【Result】The results of phosphine sensitivity bioassay analysis showed that there were significant differences in phosphine resistance levels of different geographical populations, and the range of insecticide resistance ratio (RR) was 7.2-1 906.8. The further sequence analysis suggested that the four CPs all contained chitin binding domain, which belonged to the RR2 subfamily of CPR family, and they were named as,,and,respectively. The gene expression patterns demonstrated that four CP genes were specifically highly expressed in the pupal stage of, and the high expression levels of four CP genes were detected in the peripheral tissues ofas well. Besides, the CP genes were highly expressed in the phosphine resistant population (Taicang population, RR=1 906.8), and their expression levels could be significantly induced by phosphine in. Lastly, a CP genewas selected for the further functional study. After the gene expression level ofwas significantly knocked down in phosphine resistance (TC) population ofvia the injection of dsRNA, the sensitivity ofto phosphine was significantly increased.【Conclusion】The over-expression of CP gene is involved in the formation of phosphine resistance.

; phosphine resistance; cuticle protein; RNA interference (RNAi)

2023-01-20；

2023-02-24

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD2100604）、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（BE2022377）、國家自然科學(xué)基金（32001915，32272388）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（YXK2103）、江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX22_1714）

陳二虎，E-mail：erhuchen1104@163.com。通信作者唐培安，E-mail：tangpeian@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.09.007

（責(zé)任編輯 岳梅）