猴痘病毒的感染與猴痘的動(dòng)物模型

包 容

(武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心/ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430071)

猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)屬正痘病毒(Orthopoxvirus,OPXV)科成員。 在該病毒家族中,有十多個(gè)成員,但只有天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒等四種可感染人類。 在天花消滅之后,一種類似天花的疾病繼續(xù)在剛果(金)農(nóng)村流行[1]。 1970 年當(dāng)?shù)貎和霈F(xiàn)天花樣癥狀,猴痘病毒隨即從人痘疹標(biāo)本中分離,該病毒對人致病的事實(shí)也得到確認(rèn)[1]。 現(xiàn)在這種病毒正逐漸擴(kuò)散到非洲以外的大洲,被感染的人群正逐漸擴(kuò)大。 非人靈長類(nonhuman primates,NHPs)被認(rèn)為是偶然的宿主;嚙齒類的非洲松鼠、非洲睡鼠是更可能的宿主,但并未完全確定。 以前的感染一般由密切接觸染病的野生動(dòng)物或者寵物而引發(fā);最近的猴痘病毒的傳播與感染對象呈現(xiàn)新的特點(diǎn),同性戀和雙性戀成了猴痘病毒感染的主要群體,其致病性也正發(fā)生變化。MPXV 的感染因?yàn)閯?dòng)物種類、感染途徑、感染劑量、毒株等多種因素不同而有較大差異。 我國面臨境外猴痘病毒傳入的風(fēng)險(xiǎn),因此有必要全面了解猴痘病毒的感染特點(diǎn),并建立相應(yīng)的動(dòng)物模型。 本文論述了猴痘病毒的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過、流行與感染類型和多種動(dòng)物的感染模型,并總結(jié)了多種嚙齒類、非人靈長類的感染以及多種類型的感染,如自然感染、隱性感染、顯性感染、共感染等;還介紹了各種實(shí)驗(yàn)性感染與動(dòng)物模型特點(diǎn),包括動(dòng)物對病毒的敏感性、病毒的組織嗜性,不同途徑的感染、不同毒株的感染等;希望對構(gòu)建猴痘動(dòng)物模型提供更多的認(rèn)識。

1 猴痘病毒發(fā)現(xiàn)的經(jīng)過與早期疫情

1958 年,來自馬來(西)亞的食蟹猴運(yùn)輸?shù)降湼绫竟鶉已逖芯克蟊┌l(fā)兩次疫情。 部分猴出現(xiàn)痘疹,疑在運(yùn)輸途中被感染。 曾發(fā)現(xiàn)缺損病毒的干擾現(xiàn)象的Von Magnus 分離出病原體,并鑒定為猴痘病毒[2]。 1964 年12 月,荷蘭鹿特丹動(dòng)物園23 只動(dòng)物被感染,11 只動(dòng)物死亡。 疫情引發(fā)外界關(guān)注,1967 年WHO 調(diào)查歐美26 個(gè)靈長類機(jī)構(gòu),發(fā)現(xiàn)9 個(gè)(分別來自丹麥、荷蘭和美國)都曾暴發(fā)過猴痘或類似病情,其中5 次被病毒分離證實(shí)。 次年巴黎也暴發(fā)猴痘疫情,2 只來自塞拉利昂的黑猩猩出現(xiàn)廣泛性皮疹[2]。 在這些疫情中,被感染的主要是東南亞的食蟹獼猴(食蟹猴)和亞洲的普通獼猴(恒河猴),但是這些猴的老家并未發(fā)生類似疫情。

這被后來的病毒基因測序與序列分析所證實(shí),以往多個(gè)MPXV 流行株都是西非來源;包括1958年的丹麥哥本哈根株、1962 年的Walter-Reed 陸軍研究所株、1964 年的荷蘭鹿特丹株、1968 年巴黎株以及2003 年的美國株等[3]。 不確定疫情是否全部與動(dòng)物有關(guān),可以肯定的是歐美國家眾多動(dòng)物園與實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)的黑猩猩、多種非洲猴、狒狒均來源于非洲國家。 這也說明,說明猴痘與天花曾經(jīng)同時(shí)在非洲和歐洲流行;所謂的小天花、類天花也可能是猴痘。 另外,在MPXV 分離鑒定之前,野生猴群中也發(fā)生過類似天花的疫情[4]。

2 非人靈長類與嚙齒類動(dòng)物的自然感染

2.1 非人靈長類的自然感染

在丹麥猴痘疫情之后,亞洲猴首先被懷疑是可能的天然宿主。 1969 ～1970 年,1200 份亞洲猴血清檢測發(fā)現(xiàn)抗痘病毒抗體均為陰性,隨后更多的來自非洲稀樹草原的猴血清標(biāo)本也未檢測到陽性[5]。從1969 年開始,多種西非的赤猴、狒狒的血清標(biāo)本抗牛痘血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測到陽性[6],1973 ～1974 年,對206 只西非NHP 的血清調(diào)查發(fā)現(xiàn)8%的樣本HI 陽性,21%樣本中和抗體陽性,包括以前被歸為長尾猴屬的非洲綠猴(C.aethiops)、西非紅疣猴和多種長尾猴。 此外,還在4 份NHPs 血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)3 份特異性抗體陽性[7]。 隨后在13 只野生猴中發(fā)現(xiàn)4 只抗MPXV 特異性抗體陽性[8]。 1979 年,在剛果進(jìn)行的大規(guī)模的血清抗體檢測顯示,在43 種動(dòng)物包括嚙齒類、非人靈長類等動(dòng)物中有2%～70%的抗OPXV 抗體陽性[5]。 1986 年剛果(金)北部的一項(xiàng)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)39 只從原始森林捕獲的NHPs 中,3只長尾猴特異性抗體陽性[9]。 1988 年大規(guī)模的調(diào)查發(fā)現(xiàn),在剛果(金)的兩個(gè)地區(qū)的NHPs(主要是紅尾長尾猴)中,7.8%的標(biāo)本特異性抗體陽性[10]。 這些針對NHPs 的大規(guī)模的調(diào)查是50 年前WHO 為消滅天花而組織的國際合作的一部分,NHPs 的感染后來也有零星的報(bào)道。

2012 年科特迪瓦Ta? 國家公園一只死亡的野生白枕白眉猴(sooty mangabey,SM)幼體被發(fā)現(xiàn),有典型皮疹。 檢測發(fā)現(xiàn)MPXV 陽性,皮膚、咽拭子、胸腺病毒載量非常高[11]。 2017 年該公園3 個(gè)相鄰黑猩猩群體出現(xiàn)猴痘疫情,發(fā)病的主要是幼齡個(gè)體,猩猩有呼吸道癥狀;分離出的3 個(gè)毒株與死亡的SM毒株的有非常近的遺傳距離[12]。 2014 年喀麥隆中部NHPs 收容所的黑猩猩暴發(fā)猴痘疫情。 72 只中至少6 只檢測出MPXV DNA 陽性。 2016 年黑猩猩再次發(fā)生疫情,同樣未找到傳染源[13]。

總之,MPXV 感染的NHPs 種類很多,包括多種猩猩[14]、新大陸猴;也包括舊大陸猴中常見的亞洲獼猴和非洲猴[1,15]。 在最近的暴發(fā)中,宿主或主要載體的身份仍未確定,NHPs 被認(rèn)為只是偶然的宿主;這也可能是缺乏持續(xù)更新的血清調(diào)查數(shù)據(jù)。 基于動(dòng)物倫理、動(dòng)物保護(hù)和生物安全的考慮,現(xiàn)在已經(jīng)不可能像當(dāng)年研究天花一樣深入非洲叢林。

2.2 嚙齒類動(dòng)物的自然感染

1970 年在人猴痘病例出現(xiàn)后,收集動(dòng)物樣本的地理范圍縮小到剛果的熱帶雨林。 1985 年從西非松鼠體內(nèi)分離出猴痘病毒,被捕獲的松鼠體表有明顯的皮疹[5]。 1986 年在剛果(金)的大規(guī)模調(diào)查發(fā)現(xiàn),24.7%的西非松鼠、16.2%的紅腿太陽松鼠有特異性抗體;松鼠也是當(dāng)?shù)匚ㄒ灰环N常被人捕捉的動(dòng)物[9]。 包含這項(xiàng)研究的更大規(guī)模的生態(tài)學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)23.7%非洲松鼠(屬)、14.9%的太陽松鼠(屬)特異性抗體陽性,而超1000 例其他嚙齒類與食蟲類則未檢出[10]。 1996～1997 年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),25%的野生動(dòng)物(以松鼠為主)檢出抗OPXV 中和抗體。 病毒蝕斑減少中和抗體試驗(yàn)顯示,剛果(金)一地區(qū)59只動(dòng)物中15 只陽性,包括岡比亞頰囊鼠、四趾巖象鼩、西非松鼠、庫氏非洲松鼠、太陽松鼠等[16]。

2003 年美國發(fā)生猴痘疫情,傳染源被確定為運(yùn)輸途中3 種從非洲進(jìn)口的嚙齒類動(dòng)物。 包括1 只岡比亞頰囊鼠、3 只非洲睡鼠和2 只繩松鼠;與岡比亞頰囊鼠密切接觸的(北美)草原犬鼠被感染并將病毒傳播給人類[2]。 盡管這些動(dòng)物受到普遍關(guān)注,但2012～2015 年在剛果(金)捕獲的353 只動(dòng)物中陽性率很低;僅7 只有抗OPXV 的IgG 陽性,種類包括非洲松鼠、紅腿太陽松鼠、扎伊爾頰囊鼠、扎伊爾睡鼠、四趾巖象鼩、褐鼻鼠[17]。 2017 年剛果(布)的調(diào)查發(fā)現(xiàn),在嚙齒類105 只動(dòng)物中僅2 只非洲巨頰囊鼠抗OPXV 的IgG 抗體陽性[18]。 2018 年調(diào)查發(fā)現(xiàn),西非(主要是剛果)的猴痘疫源地與非洲松鼠屬的分布高度重疊,包括西非松鼠、高山非洲松鼠、庫氏非洲松鼠、飾紋非洲松鼠、紅足非洲松鼠等[19]。

非洲嚙齒動(dòng)物被認(rèn)為是最可能的宿主,既包括松鼠科的非洲松鼠(繩松鼠)、太陽松鼠,也包括其他嚙齒類動(dòng)物如非洲睡鼠、岡比亞頰囊鼠、非洲跳鼠、非洲帚尾豪豬等;還包括其他非嚙齒類動(dòng)物,如象鼩、非洲刺猬等。 除此之外,其他大洲的動(dòng)物也能被病毒感染,如旱獺(Marmotabobak)、草原犬鼠、(美洲)負(fù)鼠、大食蟻獸等[1,15]。

3 猴痘病毒的隱性感染與顯性感染

3.1 猴痘病毒的隱性感染

動(dòng)物的MKXV 自然感染,部分是隱性感染。1959 年美國賓夕法尼亞州默沙東實(shí)驗(yàn)室的食蟹猴和恒河猴因?yàn)榕c非洲綠猴共用籠舍而感染,大約5%非洲綠猴被感染而沒有癥狀[2]。 1962 年,美國Walter-Reed 陸軍研究所報(bào)告27 只食蟹猴中3 只出現(xiàn)猴痘癥狀。 其余的食蟹猴、恒河猴、非洲綠猴群HI 抗體呈不同程度陽性[4]。 當(dāng)時(shí)普遍接種天花疫苗,工作人員未見感染[4]。

野外的成年黑猩猩可以表現(xiàn)為隱性感染,既無癥狀也無皮疹,也有少數(shù)青少年或更小的黑猩猩表現(xiàn)為隱性感染[12],個(gè)別成年黑猩猩偶發(fā)咳嗽。 自然感染的非洲巨頰囊鼠也可以表現(xiàn)為隱性感染,外表無異常,僅性腺檢出病毒DNA,且抗體陽性[20]。

MPXV 的實(shí)驗(yàn)性感染也可表現(xiàn)為隱性感染。 食蟹猴和某些新大陸猴在MPXV 滴鼻感染后無癥狀,而抗牛痘的HI 抗體陽性[6]。 岡比亞頰囊鼠滴鼻感染后沒有明顯臨床癥狀,病毒載量升高不明顯,體液可檢測到活病毒[21]。

隱性感染在非洲當(dāng)?shù)厝巳褐袕V泛存在。 如49.1%剛果(布)北部人群(≤25 歲)和37%的加納年輕人(＜23 歲)抗OPXV 抗體陽性。 更具有說服力的是針對喀麥隆黑猩猩收容所疫情的調(diào)查報(bào)告。在受訪的63 人中(未接種天花疫苗),4 人(1 個(gè)飼養(yǎng)員和3 個(gè)附近的村民)血清抗OPXV 抗體IgG 陽性而從未出現(xiàn)過猴痘癥狀[13]。

臨床病例也可見隱性感染。 有報(bào)道發(fā)現(xiàn)224 例臨床男性肛腸標(biāo)本中3 例猴痘PCR 陽性。 他們在采樣前后的幾周內(nèi)都沒有出現(xiàn)過任何癥狀。 采樣后21～37 d,標(biāo)本檢測不到病毒DNA[22]。 98%的感染者是同性戀或雙性戀男性[23]的事實(shí)也說明非肛交途徑感染如呼吸道途徑、接吻等途徑感染極少出現(xiàn)癥狀,而表現(xiàn)為隱性感染。

3.2 猴痘病毒的顯性感染

嚙齒類動(dòng)物一般表現(xiàn)為顯性感染。 這些敏感動(dòng)物的種類很多,但只有部分感染后出現(xiàn)皮疹,如西非松鼠、草原犬鼠[24]、旱獺[25]、非洲巨頰囊鼠[21,26]等,其他動(dòng)物感染后即使死亡也未見皮疹或者尚未發(fā)皮疹。 睡鼠、松鼠猴等多種動(dòng)物感染后不一定出現(xiàn)皮疹[20]。

非人靈長類的顯性感染:NHPs 的顯性感染最經(jīng)典案例是荷蘭鹿特丹動(dòng)物園的疫情。 大食蟻獸首先發(fā)病,并出現(xiàn)典型癥狀后死亡,接著紅毛猩猩、黑猩猩、大猩猩、梟面長尾猴、亞洲獼猴、長臂猿、松鼠猴、狨被感染并出現(xiàn)類似皮疹。 半圈養(yǎng)的黑猩猩感染后食欲不振,前肢出現(xiàn)漸進(jìn)性小皰和皮膚結(jié)節(jié)樣突起,并有1 只死亡[13]。 在野外,部分自然感染的幼齡黑猩猩發(fā)病,呼吸道癥狀明顯,如呼吸困難、咳嗽等;可伴發(fā)疹,而不一定是彌漫性的痘疹;但是成年個(gè)體一般無癥狀[12];病情與年齡相關(guān)的原因不明。 監(jiān)測表明,該地區(qū)的MPXV 是突然出現(xiàn)的,這意味著成年個(gè)體不是因?yàn)殚L期在環(huán)境中接觸過該病毒的抗原而獲得了免疫力。

人類的顯性感染:人類的顯性感染至少有3 種類型。 第一類是典型的天花樣病變,如剛果(金)1970～1983 年的病例,有發(fā)疹、淋巴結(jié)腫大等體征,約60%的患者皮疹超過100 個(gè)。 這些癥狀、體征都無法與天花區(qū)分。 第二類是2003 年美國猴痘疫情,與患病的草原犬鼠的密切接觸者出現(xiàn)多種癥狀。非侵入性感染者病情較輕,相應(yīng)癥狀和體征出現(xiàn)比例更少[27]。 復(fù)雜途徑感染者潛伏期更短,前驅(qū)期無發(fā)熱而直接出現(xiàn)皮疹,短暫的皮疹期之后有長的發(fā)熱期[27]。 第三類是非典型癥狀的猴痘感染,如2022 年新出現(xiàn)的肛交感染群體,其中包括部分人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者,這類感染者缺乏呼吸道病變癥狀,如咳嗽等,皮疹也很少,大部分人只有數(shù)個(gè)[23]。

4 猴痘病毒與HIV 的共感染

最近,同性戀和雙性戀群體因肛交(肛門直腸粘膜感染)而成為MPXV 感染的主要群體,該群體也是HIV 感染的高發(fā)群體。 大型病例分析發(fā)現(xiàn),HIV 感染的猴痘患者比例很高。 英國26%的已知猴痘病例是HIV 感染者,而歐洲國家這一比例為37%;美國41%的MPXV 感染者同時(shí)也是HIV 感染者;西班牙的兩個(gè)大城市,40%感染者HIV 陽性[23]。

西非近年來出現(xiàn)的猴痘患者的死亡被認(rèn)為與未經(jīng)治療的HIV 感染有關(guān)。 尼日利亞40 名MPXV感染者中5 人死亡;合并HIV 的感染患者9 人,其中2 人死亡。 與MPXV 單感染相比,共感染患者病程更長,痘疹更大,繼發(fā)性細(xì)菌皮膚感染和生殖器潰瘍的比例更高[28];這與歐美的發(fā)病率有較大差距。 尼日利亞5 名共感染患者均有繼發(fā)性感染,而MPXV 單感染患者繼發(fā)性感染不到1/3,這說明這些共感染患者的病毒載量沒有得到控制,有免疫缺陷而無法控制感染,因此死亡風(fēng)險(xiǎn)較高。 歐美共感染患者的病毒載量控制在非常低的水平,CD4+T 細(xì)胞數(shù)量也大致在正常水平[23],這應(yīng)該是歐美共感染極少出現(xiàn)死亡病例的原因。 最近幾年的調(diào)查也顯示,剛果(金)HIV 的實(shí)際上的感染率為11%,這遠(yuǎn)超過先前的估計(jì)的2.86%[29]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),SIV 感染的恒河猴進(jìn)入艾滋病階段后即使用天花疫苗免疫,MPXV 攻毒的恒河猴也會(huì)很快死亡[30]。

還有部分非洲猴痘患者死亡與HIV-1 共感染無關(guān),當(dāng)?shù)氐暮锒徊《居休^高的致病性。 尼日利亞MPXV 單感染患者中,3/31 死亡,3/5 的患者皮疹數(shù)在100 個(gè)以上[28]。 2003 年美國疫情患者中,約半數(shù)以上患者皮疹少于25 個(gè)[27],而2022 年的歐美同性戀群體中接近40%的患者皮疹不到5 個(gè),且尚未出現(xiàn)死亡病例。 這說明非洲當(dāng)?shù)氐暮锒桓腥镜牟∏楸绕渌貐^(qū)更嚴(yán)重。

除了HIV,猴免疫缺陷病毒(SIV)可能是另外一種共感染的病原體。 喀麥隆的調(diào)查發(fā)現(xiàn),獵人(高暴露群體)的SIV 陽性率為17.1%,而這些人同時(shí)也是猴痘的高發(fā)人群[31]。

非洲當(dāng)?shù)氐腘HP 也存在共感染。 西非和中非是SIV 的疫源地,SIV 的自然宿主主要是攜帶SIVsmm 的白枕白眉猴和攜帶SIVcpz 的黑猩猩,也包括非洲綠猴、疣猴和狒狒等。 另外,猴痘病毒宿主與SIV 靈長類自然宿主的種類與分布地域重合。

5 實(shí)驗(yàn)性感染與動(dòng)物模型

5.1 不同毒株的實(shí)驗(yàn)性感染

WHO 將MPXV 分為兩個(gè)演化支。 包括剛果盆地支和西非支。 前者感染病死率約為10%,后者感染較輕,致死率低。 剛果支(中非支)可以繼續(xù)細(xì)分為Ⅰ～Ⅴ組[3]。 一種新的分類方法將剛果支命名為Clade 1,將西非支進(jìn)一步分為Clade 2 和Clade 3;演化支Clade 3 基本上都是人源性毒株[32];也有分類方法直接將人人傳播的所有毒株歸屬于Calde 3[33]。

剛果株(Zr-599)比西非株(Liberia)病毒致病性更強(qiáng)。 從食蟹猴的實(shí)驗(yàn)性感染看,不管是皮下注射還是滴鼻感染,剛果株感染后,猴呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)和胃腸道病變更嚴(yán)重,剛果株感染猴的血液病毒載量比利比里亞株高約10 倍。 剛果株感染比西非株有更多的皮疹數(shù)量和更嚴(yán)重的潰瘍性病灶[34]。

小鼠(CAST/EiJ)的滴鼻的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),剛果株(Z79-CB2)感染的存活率更低,10 PFU 腹腔注射可導(dǎo)致半數(shù)死亡,但動(dòng)物體重并未見下降;滴鼻感染時(shí),半數(shù)致死劑量(LD50)比西非株感染至少低一個(gè)數(shù)量級。 剛果株滴鼻感染的小鼠以肺組織病毒滴度最高,達(dá)109PFU/g,肝、脾的病毒滴度明顯偏低;腹腔注射時(shí),脾、肝、肺病毒載量都很高,而脾最高。西非株(USA-C1)滴鼻感染時(shí),感染劑量達(dá)到104時(shí)才出現(xiàn)半數(shù)死亡率。 肺、卵巢、脾都有較高滴度病毒;感染劑量與組織中的病毒滴度峰值缺乏相關(guān)性[35]。 這說明不同毒株在小鼠組織器官中增殖與感染途徑和劑量有關(guān)。

最近發(fā)現(xiàn),加拿大的分離株Clade 1(剛果株V79-1)和Clade 2(西非株SP2833)對CAST/EiJ 并未顯示強(qiáng)的致病性,甚至104PFU 滴鼻感染未見死亡[36],這說明該小鼠模型還有進(jìn)一步優(yōu)化的必要。

5.2 嚙齒類的實(shí)驗(yàn)性感染與動(dòng)物模型

豚鼠、倉鼠對MPXV 不敏感,無皮疹,實(shí)驗(yàn)性感染無死亡。 成年兔和成年大白鼠感染后不易死亡,但幼齡的兔和大鼠很易死亡。 棉鼠、歐亞紅松鼠、非洲松鼠、十三紋地松鼠、草原犬鼠、CAST/EiJ 小鼠、睡鼠均非常敏感,攻毒易導(dǎo)致死亡。 死亡也與感染途徑有關(guān),如小鼠、草原犬鼠滴鼻感染的死亡率比靜脈注射的死亡率少50%[24]。

旱獺模型:旱獺低劑量滴鼻感染顯示,病毒首先在氣管、肺組織復(fù)制,然后是鼻甲、結(jié)腸、皮膚等處。 中高劑量皮下注射感染時(shí),除了氣管、支氣管和肺,皮疹、鼻粘膜、睪丸/卵巢、腹股溝淋巴結(jié)、腎、腦等組織器官病毒滴度也很高[25]。 肝并未檢出高滴度的病毒,這有別于草原犬鼠等其他動(dòng)物。 睪丸與腦組織中檢出一定量的病毒,這說明病毒能通過腦屏障和血睪屏障,可能出現(xiàn)神經(jīng)病變。 實(shí)際上旱獺容易出現(xiàn)生殖系統(tǒng)病變。 兩種不同劑量的攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在多種組織器官中,睪丸甚至與皮疹有同樣高的病毒滴度[25]。 這與同為地松鼠族的草原犬鼠有較大差異。 天花疫苗免疫過的旱獺能預(yù)防MPXV 感染的動(dòng)物發(fā)病,而未免疫組全部動(dòng)物發(fā)病,半數(shù)動(dòng)物死亡。 這說明旱獺合適作為猴痘疫苗有效性評價(jià)的模式動(dòng)物[25]。

草原犬鼠模型:野外捕捉的黑尾草原犬鼠在熒光素酶基因的重組病毒(西非株USA-2003)腹腔注射(105.1PFU)感染后,所有動(dòng)物在11 d 內(nèi)全部死亡。 尸檢發(fā)現(xiàn),肝、脾、肺、腎的病毒滴度較高。 病理染色可見肝、脾有小灶性壞死,肺內(nèi)輕度炎性改變。 滴鼻途徑感染的主要病理改變在肺和胸膜腔;因?yàn)樾啬で焕w維素滲出而有胸膜和肺的輕度粘連。3/5 的動(dòng)物死亡,死亡動(dòng)物中,僅1 只肺檢出高滴度病毒。 動(dòng)物的嘴唇、舌和頰黏膜上也有潰瘍性改變[37]。 腹腔注射與滴鼻感染的死亡率和生存時(shí)間差異較大,這說明感染部位或攻毒方式對感染結(jié)局影響較大。 通過活體成像技術(shù)檢測動(dòng)物的病毒載量也是一種非常直觀的方法,如用熒光素酶基因的重組MPXV(西非株)和野生型毒株(5×104PFU)滴鼻感染(德克薩斯州)野外捕捉的黑尾草原犬鼠。該方法的局限性是組織器官的病毒量檢測需要離體標(biāo)本。 感染第6 天,肝的熒光強(qiáng)度最高,個(gè)別腸段、下頜淋巴結(jié)熒光強(qiáng)度較高,心、肺較低;感染第9天病毒載量較低。 感染后6～17 d,皮疹的病毒滴度最高,其次是舌;其他組織如鼻甲和頜下淋巴結(jié)也較高[38]。

免疫組化染色發(fā)現(xiàn),病毒抗原在有皮疹、舌鱗狀上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞質(zhì)中含量很豐富[39]。 局部病毒富集引起了組織病變,如水腫、滲出、壞死,出現(xiàn)了膿皰、潰瘍。

十三紋地松鼠(學(xué)名多紋黃鼠)在105.1PFU(USA-03 毒株)腹腔注射和滴鼻途徑后,所有動(dòng)物都出現(xiàn)暴發(fā)性感染,并在感染后6 ～9 d 后死亡,腹腔注射比滴鼻感染生存時(shí)間更短。 死亡前數(shù)天的血液和口咽分泌物可通過培養(yǎng)分離到活病毒;尸檢發(fā)現(xiàn)器官的病毒滴度從高到低依次為肝、脾、肺、腎、心、腦;但兩種途徑感染后組織器官的病毒載量幾乎無差異。 肝、脾病毒抗原陽性表達(dá)明顯,HE 染色可見明顯肺間質(zhì)增寬[40]。 肺間質(zhì)增寬是病毒性肺炎的病理改變,是呼吸系統(tǒng)應(yīng)該關(guān)注的病變類型。

西非松鼠模型:剛果(金)當(dāng)?shù)氐奈鞣撬墒笥脽晒馑孛笜?biāo)記的MKXV 剛果株用106PFU 滴鼻感染后,排毒以口腔拭子滴度最高,鼻拭子樣滴度稍低;肛門排毒持續(xù)時(shí)間最短。 皮內(nèi)感染后,口拭子、肛拭子病毒滴度峰值稍高于眼、鼻拭子;口、鼻、眼的排毒持續(xù)時(shí)間基本相同。 兩者比較,滴鼻感染的體外排毒期短,而病毒滴度峰值稍高。 從體內(nèi)病毒復(fù)制看,滴鼻途徑的熒光強(qiáng)度稍高,而兩者病毒增殖的趨勢基本相同。 總體上,滴鼻組3/4 的動(dòng)物死亡,皮內(nèi)組2/4 的動(dòng)物死亡;但取材后僅在唇、舌、皮疹等處檢測到高病毒載量[41]。 這對于猴痘感染疑似人群的篩查有指導(dǎo)意義。

岡比亞頰囊鼠模型:美國佛羅里達(dá)州野外捕捉的岡比亞頰囊鼠,用帶熒光素酶的重組病毒(中非株)106PFU 經(jīng)皮內(nèi)注射感染,通過熒光值估計(jì)病毒載量,3 只動(dòng)物病毒載量在第8 ～14 天達(dá)到峰值,21 d 后恢復(fù)到背景水平。 病鼠可見角膜炎、牙齦炎;皮膚有突起,但無潰瘍[21]。 同樣地點(diǎn)捕捉的岡比亞頰囊鼠(或?yàn)樵翣栴a囊鼠)用剛果株和西非株(4×104PFU)皮下接種后,體溫顯著升高,活動(dòng)減少,體重下降。 西非株感染后病毒載量最高的組織是腸系膜淋巴結(jié),其次是接皮膚接種點(diǎn);其他組織器官如皮膚、脾、腎、心、肺、肝等病毒載量也較高。 皮膚、舌面可見皮疹,但不同毒株組未見差異。 總體上,西非株感染組排毒量更高,口腔拭子的病毒載量峰值比鼻拭子高2 個(gè)數(shù)量級以上,肛拭子載量最低。 剛果株感染后排毒非常早,無死亡。 兩毒株活病毒排毒持續(xù)時(shí)間基本相同,但拭子PCR 檢測發(fā)現(xiàn),西非株的陽性持續(xù)時(shí)間更長[26]。

非洲睡鼠模型:非洲睡鼠對MPXV 十分敏感,5 PFU 滴鼻即可導(dǎo)致20%的死亡[35];還有研究顯示2 PFU 滴鼻感染即可引起＞1/3 的睡鼠死亡。 104PFU滴鼻感染后組織器官的病毒滴度在2 ～5 d 內(nèi)逐漸升高;滴度最高的是肝,其次是脾和肺,再次為鼻洗液和血液。 睡鼠感染后可見消瘦和結(jié)膜炎、鼻黏膜壞死性炎,未見皮疹;但內(nèi)臟病變十分明顯。 病變包括壞死性改變,如呼吸道黏膜柱狀上皮細(xì)胞層壞死、肝內(nèi)點(diǎn)狀壞死、淋巴結(jié)與脾中淋巴細(xì)胞減少,特別是部分淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞明顯減少;還可見出血性改變,如腦出血、膽管的粘膜下出血[42]。 非洲睡鼠在低劑量滴鼻感染帶熒光素酶的重組病毒后,活體成像顯示睡鼠腹部、口鼻部和胸部熒光強(qiáng)度非常高;組織器官中肝的病毒滴度最高(＞109PFU);其次為脾、肺、鼻甲等,而卵巢載量較低[43]。 自然感染的睡鼠,病毒載量最高的器官也是肝,其次為脾和肺[20]。 總之,非洲睡鼠滴鼻感染MPXV 后,肝的病毒載量[20]或滴度最高[42-43],其滴度甚至明顯高于其他器官[42]。 非洲睡鼠自然感染的途徑不明,氣溶膠吸入、唾液吞食或抓咬傷等都有可能。 用該模型檢驗(yàn)天花疫苗Dryvax 或藥物Cidofovir 的有效性,發(fā)現(xiàn)Cidofovir 能明顯降低滴鼻感染的死亡率,而Dryvax 接種對猴痘也有很好的保護(hù)效果[42]。

小鼠模型:小鼠屬各品種、品系對MPXV 敏感性的差異非常大。 常見的近交系小鼠BALB/c 和C57BL/6 對MPXV 有很強(qiáng)的抵抗力;而野生近交系小鼠,如CAST/EiJ、MOLF/EiJ、PERA/EiJ 等在低劑量MPXV 剛果株感染后會(huì)發(fā)病并死亡。 CAST/EiJ小鼠的腹腔注射感染比滴鼻感染病變更嚴(yán)重,半數(shù)致死量(LD50)更小。 腹腔注射(104PFU)感染的小鼠脾、肝、肺病毒滴度都高,而滴鼻感染的肺病毒滴度很高,其他器官較低[35];另一實(shí)驗(yàn)也證實(shí),CAST/EiJ 小鼠滴鼻感染(2×104～2×105PFU)Z06 毒株后,病毒主要聚集在口鼻部位,內(nèi)臟中肺的病毒滴度最高,其他組織如肝、脾、腦、卵巢病毒載量比肺低兩個(gè)數(shù)量級以上[43]。 CAST/EiJ 小鼠滴鼻感染(102～106PFU)Z79 毒株后,組織器官的病毒滴度以肺為最高,明顯高于肝、脾、腦、腎等,另外肺病毒滴度持續(xù)時(shí)間也更長[44]。

CAST/EiJ 小鼠模型也被用于藥物的有效性評價(jià),如細(xì)胞因子IL-15 注射被證實(shí)對MPXV 的腹腔感染有明顯的保護(hù)作用[45]。 也有研究表明,CAST/EiJ 對MPXV 并不是很敏感,104PFU 的病毒滴鼻感染后,小鼠無死亡[36]。 病毒在小鼠呼吸道中能有效復(fù)制,每日口服TPOXX 治療可顯著降低感染后1 周和2 周組織中的病毒滴度[36]。 另外,干擾素及其受體基因缺陷,如C57BL/6 小鼠IFNγ和IFNγR基因缺失在一定程度上影響感染的結(jié)局[44]。 干擾素通路相關(guān)基因缺失也會(huì)影響感染結(jié)局,如C57BL/6stat1-/-小鼠,相對低劑量的鼻內(nèi)感染后10 d 內(nèi)全部死亡,而C57BL/6 小鼠用更高劑量感染也不死亡?；蛉毕輰Σ《靖腥镜挠绊戇€與動(dòng)物背景有關(guān),如剛果株滴鼻感染,C57BL/6stat1-/-比129stat1-/-小鼠病變更嚴(yán)重,甚至出現(xiàn)神經(jīng)病變。 免疫缺陷小鼠SCID 比IFN-α/βR-/-和IFN-γR-/-小鼠更敏感,低劑量滴鼻也會(huì)出現(xiàn)死亡[46]。 總體上,體重變化和死亡率等與毒株、感染劑量和感染途徑有關(guān)。

BALB/c 小鼠對MPXV 不敏感,滴鼻感染時(shí)病毒復(fù)制主要局限于肺部[44],可以用作輕癥模型。

總之,動(dòng)物種類、感染方式和感染劑量對病毒的組織嗜性有較大影響。 滴鼻途徑感染時(shí),病毒更傾向于在肺組織中復(fù)制。 對草原犬鼠、十三紋地松鼠和非洲睡鼠而言,MPXV 有更明顯的嗜肝性,這可能是這些動(dòng)物比其他敏感動(dòng)物更容易死亡的原因。

5.3 非人靈長類的實(shí)驗(yàn)性感染與動(dòng)物模型

黑猩猩對天花病毒很敏感,是理想的模式動(dòng)物。 后來發(fā)現(xiàn)黑猩猩對猴痘病毒也很敏感,黑猩猩也因此一度作為猴痘的模式動(dòng)物。

美洲的普通狨(Callithrixjacchus)對猴痘病毒也十分敏感,病毒血癥出現(xiàn)早。 狨猴模型與睡鼠模型均有嚴(yán)重的出血癥狀,與出血型天花類似。 極低劑量即可導(dǎo)致動(dòng)物死亡,因此是非常合適的重癥感染模型[47]。

食蟹猴與恒河猴是抗猴痘病毒藥物與疫苗有效性評價(jià)最常用的模式動(dòng)物。 與黑猩猩和狨猴相比,這兩種舊大陸猴對MPXV 的相對不敏感性,但中高劑量病毒感染后也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡[2]。 氣溶膠霧化吸入感染實(shí)驗(yàn)猴是最常用的方法之一,在以前被認(rèn)為是最接近人類自然感染的攻毒方法,靜脈注射病毒也是較常用的方法,但不是自然感染。 氣管內(nèi)滴注也是一種模擬自然感染的方法,病毒液會(huì)進(jìn)入某個(gè)肺葉,這樣可能會(huì)出現(xiàn)某個(gè)肺葉病變嚴(yán)重而其他肺葉病變輕或無病變的情況。 還有一種支氣管鏡深入支氣管分叉處噴霧的方法,有別于普通的氣管內(nèi)滴注[48]。 同樣劑量的病毒通過呼吸道途徑感染時(shí),感染方式不同(如氣溶膠、氣管內(nèi)滴注、支氣管內(nèi)滴注、經(jīng)支氣管噴霧等),實(shí)驗(yàn)猴的癥狀、體征、病毒血癥持續(xù)時(shí)間及生存時(shí)間也會(huì)有一定差異。 這些也因動(dòng)物種類不同而有所差異,如食蟹猴與恒河猴靜脈注射相同劑量剛果株(Z79),恒河猴血中病毒載量出現(xiàn)更早,而皮疹和死亡出現(xiàn)稍晚[2]。 食蟹猴感染后血液的病毒載量呈一過性升高,然后回落到基線,沒有平臺(tái)期。 攻毒劑大時(shí)動(dòng)物容易死亡,而血液病毒載量過高也容易導(dǎo)致動(dòng)物死亡,但病猴死亡時(shí)血液病毒載量不一定很高[48]。

食蟹猴在氣溶膠感染后的大體病變以肺/支氣管炎、皮疹及口腔、舌黏膜炎癥為主,鏡下病變以呼吸系統(tǒng)(包括氣管/支氣管、肺、咽喉等)和淋巴結(jié)炎性改變?yōu)橹?少見肝受累[49]。 支氣管噴霧攻毒(Zr-79)可以導(dǎo)致部分食蟹猴死亡。 病肺離體后保持膨脹狀態(tài)。 鏡下呈小葉性肺炎改變,細(xì)小支氣管內(nèi)有大量炎性壞死性物質(zhì),伴肺水腫,管腔周邊肺泡中可見大量液體滲出,這可以導(dǎo)致肺泡喪失氣體交換功能。 此外還可見肺充血和肺間質(zhì)增寬,偶見腎小球血栓形成[48]。 另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示不同的感染途徑結(jié)果差異較大。 皮下感染比滴鼻感染病變更重,剛果株(Zr-599)皮下感染后組織器官普遍有病毒增殖,甚至胃粘膜表面也出現(xiàn)密集痘疹,而滴鼻感染后病變以淋巴結(jié)、皮疹為主。 皮下感染比滴鼻感染的猴進(jìn)食更少,體重減少更多,體溫升高、病毒載量更高、急性期蛋白水平更高,總之,后果更嚴(yán)重[34]。

氣溶膠實(shí)驗(yàn)性感染的食蟹猴,免疫組化染色可見病毒抗原集中在鱗狀上皮層表達(dá),與周圍組織界限分明,或在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞,其他管周細(xì)胞與滲出的炎性細(xì)胞也有表達(dá)。 食蟹猴呼吸道感染的動(dòng)物,下呼吸道上皮是原發(fā)性感染的主要靶點(diǎn)之一[48-49]。 不同巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞、DC 細(xì)胞有陽性表達(dá)。 隨著病程延長,病毒會(huì)隨細(xì)胞從基底層遷移到更淺的鱗狀上皮層,淋巴結(jié)皮質(zhì)也有表達(dá)[49]。

食蟹猴氣管內(nèi)或者靜脈途徑感染Z79 后,急性期睪丸組織可見出炎癥和壞死,睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精管和附睪管腔中檢測到MPXV。 在恢復(fù)期,病毒已從大多數(shù)組織器官中清除,但睪丸中依然可以檢測到病毒,病毒滯留時(shí)間長達(dá)37 d。 這說明MPXV 通過性途徑傳播的可能性是很大的[50]。

5.4 當(dāng)前動(dòng)物模型的問題

盡管敏感的動(dòng)物很多,但理想的模式動(dòng)物依然很少。 現(xiàn)有的模式動(dòng)物主要是松鼠科,體型偏大,使用很少,也非SFP 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 現(xiàn)有的模型中,小鼠模型非常少,這不利于猴痘的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展。

現(xiàn)在已經(jīng)有多種感染途徑的動(dòng)物模型,但是缺乏模擬近階段人類自然途徑感染的動(dòng)物模型,如肛門、直腸途徑甚至口咽途徑(口交)感染的動(dòng)物模型。 由于部分感染者是雙性戀,女性可能通過性途徑感染,包括生殖道黏膜的局部感染與上行感染,如陰道、宮頸、子宮甚至卵巢的急性炎癥,因此需要建立經(jīng)生殖道感染的動(dòng)物模型。 現(xiàn)有病人中,HIV感染者占很大比例,因此需要利用免疫缺陷小鼠建立猴痘動(dòng)物模型,如SCID 小鼠、裸鼠、NSG 小鼠。

現(xiàn)有的動(dòng)物模型以重癥模型為主,發(fā)病動(dòng)物的體征與癥狀非常明顯,但是現(xiàn)階段的猴痘病例中,嚴(yán)重病例非常少。 因此,有必要建立輕癥的動(dòng)物模型或者隱性感染的動(dòng)物模型。 現(xiàn)有的動(dòng)物模型一般使用成年動(dòng)物,缺少嬰幼個(gè)體等未成年動(dòng)物模型,同時(shí)也缺少母嬰傳播的動(dòng)物模型。

6 結(jié)語

猴痘疫情的暴發(fā)的原因是復(fù)雜的。 除了常見的當(dāng)?shù)氐膮擦植东C、叢林動(dòng)物肉類交易和林地墾殖;也有我們忽略的原因,如叢林生態(tài)游、高端狩獵等;還有不為人知原因,如野生動(dòng)物活體的非法貿(mào)易、飼養(yǎng)與肉類走私[14]。

構(gòu)建動(dòng)物模型是非常必要的,如氣溶膠/飛沫等呼吸道途徑感染的模擬;孕婦感染后垂直傳播模型的驗(yàn)證;抗猴痘疫苗與藥物的有效性和安全性的評價(jià);猴痘包括相關(guān)合并癥、并發(fā)癥等治療方案的優(yōu)化。 構(gòu)建不同病變程度的動(dòng)物模型,如輕癥模型、重癥模型,不同組織器官的損傷模型,如呼吸道病變模型、肛腸粘膜病變模型和神經(jīng)病變模型也是非常必要的。

構(gòu)建動(dòng)物模型也是非常緊迫的。 MPXV 的暴發(fā)呈現(xiàn)新的特點(diǎn),可能再次暴發(fā)并廣泛傳播,可能會(huì)發(fā)生重組與變異,出現(xiàn)高致病性毒株的流行。 雖然猴痘病毒感的體征不嚴(yán)重,但患者主觀上感受到劇烈持久的疼痛。 這嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,也違背了生命倫理。 因此我們應(yīng)該及時(shí)構(gòu)建動(dòng)物模型控制這種疾病。

建議與措施:應(yīng)盡快構(gòu)建適合當(dāng)前疫情的動(dòng)物模型,特別是肛腸途徑感染的動(dòng)物模型和免疫功能缺陷的動(dòng)物模型;應(yīng)盡快構(gòu)建適合抗猴痘疫苗與藥物評價(jià)的動(dòng)物模型,特別是殺精劑、抗病毒凝膠等外用藥物;應(yīng)盡快構(gòu)建簡便實(shí)用的小動(dòng)物模型,特別是小鼠模型。 2022 年6 月,中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)的第一屆猴痘病毒在線學(xué)術(shù)沙龍呼吁從5 個(gè)方面應(yīng)對猴痘病毒的流行,包括加強(qiáng)基礎(chǔ)研究、研發(fā)疫苗、加強(qiáng)生物安全管理、對公眾普及猴痘的科學(xué)知識、加強(qiáng)國際合作等[51]。 生物安全專家魏強(qiáng)教授也對此給出了類似的更詳細(xì)的建議[52]。

人類、動(dòng)物與自然環(huán)境是一個(gè)利害關(guān)聯(lián)的整體,并擁有一個(gè)共同的命運(yùn)。 MPXV 的傳播不是一個(gè)孤立的事件,而是一個(gè)危害這一整體健康(One Health)的人獸共患病,因此我們應(yīng)加強(qiáng)合作與聯(lián)系,共同應(yīng)對這種流行[53]。 截至2023 年6 月,中國內(nèi)地新增猴痘確診病例達(dá)106 例。 這存在大流行的可能性,已經(jīng)構(gòu)成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[54]。 用不同種類的動(dòng)物,建立感染與疾病模型,或者建立不同感染途徑的動(dòng)物模型、不同病變類型的動(dòng)物模型或者不同毒株感染的動(dòng)物模型是非常必要的,這可以更深入的研究猴痘的致病特點(diǎn),更有利于預(yù)防與治療猴痘病毒的感染,更有利于人類衛(wèi)生健康共同體的構(gòu)建。