二代測(cè)序技術(shù)在原發(fā)灶不明腫瘤診療中的研究進(jìn)展*

陳美麗 錢漢清 張全安 楊艷 馬亞軍

原發(fā)灶不明腫瘤（cancer of unknown primary，CUP）是一類相對(duì)罕見的腫瘤，即在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了惡性腫瘤細(xì)胞，但無(wú)法通過臨床、影像、病理及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等全面檢查從解剖學(xué)上確定原發(fā)灶部位的轉(zhuǎn)移性腫瘤。大多數(shù)CUP 患者由于原發(fā)灶不明確，通常只能接受含鉑/紫杉類的經(jīng)驗(yàn)性化療，預(yù)后較差，生存期較短，中位總生存期＜1 年[1-3]，所以積極尋找原發(fā)部位、研究組織類型或分子免疫特征對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義。第二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）也稱高通量測(cè)序，是目前最常用的基因檢測(cè)手段之一，可以在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出腫瘤患者的基因變異情況，輔助指導(dǎo)臨床診療。歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（ESMO）、國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）及中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)都發(fā)布了關(guān)于在CUP 患者中使用NGS 的建議，NGS 可以幫助50.9%的CUP 患者找到原發(fā)灶[4]，并可檢測(cè)出具有臨床指導(dǎo)意義的基因改變[5]，包括靶向治療靶點(diǎn)和免疫治療生物標(biāo)記物。本文針對(duì)NGS 樣本的選擇、NGS 指導(dǎo)下的CUP 患者的組織溯源、分子特征、指導(dǎo)治療等方面進(jìn)行綜述。

1 NGS 樣本的選擇

對(duì)于適合NGS 檢測(cè)分析樣本的選擇，臨床中首選新鮮腫瘤組織標(biāo)本，也可選擇福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本及血漿等。未接受過靶向/免疫藥物治療的患者，NGS 檢測(cè)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本，優(yōu)先使用手術(shù)切除樣本，也可選擇活檢樣本，再次檢測(cè)可選擇液體活檢樣本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；接受過靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本，進(jìn)而尋找治療后新出現(xiàn)的耐藥突變?；谑中g(shù)切除或穿刺活檢的腫瘤組織是CUP 分子檢測(cè)的主要樣本，當(dāng)轉(zhuǎn)移性腫瘤組織樣本難以獲取或組織樣本質(zhì)控不合格時(shí)，體液樣本，尤其是外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）則是研究CUP起源和分子特征的一種可行方法。與組織學(xué)檢測(cè)相比，外周血ctDNA 檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)、可反復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)[6]，但受正常細(xì)胞胚系變異或克隆性造血細(xì)胞體系突變干擾，也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[7-8]，假陽(yáng)性率＜1%[9]。

2 NGS 在CUP 診療中的意義

2.1 組織溯源，明確診斷

基因表達(dá)譜可在分子水平揭示腫瘤的組織起源，通過對(duì)比分析待測(cè)腫瘤組織樣本與已知來源腫瘤分子層面的相似性，可以鑒別其腫瘤類型，尋找原發(fā)灶。日本研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)前瞻性、多中心、非隨機(jī)的臨床Ⅱ期 研 究[10]招募了111 例CUP 患者，基 于NGS 的RNA 和DNA 圖譜分析預(yù)測(cè)出15 個(gè)腫瘤原發(fā)部位，其中最常見的是肺癌（21.6%）、肝癌（15.5%）、腎癌（15.5%）、結(jié)直腸癌（12.4%），這與既往尸檢分析的結(jié)果類似[11]。Schipper 等[12]基于全基因組測(cè)序設(shè)計(jì)了一種預(yù)測(cè)算法，在CUP 隊(duì)列中，最常見的原發(fā)腫瘤略有不同，分別為非小細(xì)胞肺癌、胃食管癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌。

Mo 等[13]報(bào)道了1 例原發(fā)灶不明同時(shí)伴乳腺、肺、胃和卵巢多發(fā)性腫瘤的患者，在乳腺和肺腫瘤組織中使用NGS 檢測(cè)到伴有棘皮動(dòng)物微管結(jié)合蛋白樣與間變性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）重排，該基因改變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中較常見，綜合免疫組織化學(xué)及NGS 結(jié)果考慮原發(fā)灶為肺。Yu 等[14]報(bào)道了1 例胸骨后惡性占位性病變的患者，影像學(xué)均無(wú)法確定原發(fā)部位，通過NGS 檢測(cè)到人表皮生長(zhǎng)因子受體2（receptor tyrosine-protein kinase 2，ERBB2）擴(kuò)增，協(xié)助臨床找到原發(fā)灶為乳腺。本中心也報(bào)道了1 例影像學(xué)和常規(guī)組織病理學(xué)無(wú)法確診，經(jīng)NGS 測(cè)序明確診斷的罕見胰腺癌結(jié)腸轉(zhuǎn)移的案例[15]。綜上所述，NGS 的組織溯源作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1）當(dāng)影像及組織病理學(xué)同時(shí)發(fā)現(xiàn)多處腫瘤病灶，無(wú)法明確原發(fā)病灶時(shí)；2）當(dāng)影像及組織病理學(xué)只發(fā)現(xiàn)一處病灶，無(wú)法明確原發(fā)病灶時(shí)；3）當(dāng)患者在腫瘤病史（包括單原發(fā)或多原發(fā)）基礎(chǔ)上出現(xiàn)新的病灶，無(wú)法明確為轉(zhuǎn)移還是繼發(fā)時(shí)。

2.2 揭示分子特征，指導(dǎo)個(gè)體化治療

2.2.1 基于基因變異的靶向治療 NGS 技術(shù)對(duì)一定數(shù)量的癌癥相關(guān)基因編碼區(qū)進(jìn)行大規(guī)模基因組測(cè)序來分析存在的基因組改變以指導(dǎo)臨床治療，這些基因組改變包括突變、基因重組、DNA 插入/缺失、拷貝數(shù)變化等。Ross 等[16]對(duì)200 例CUP 組織標(biāo)本進(jìn)行NGS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)169 例（85%）檢測(cè)到一個(gè)或多個(gè)潛在可靶向治療的基因變異，在原發(fā)灶不明的腺癌中有72%的CUP 患者存在臨床上常見的酪氨酸激酶信號(hào)通路上的基因變異，其中最常見的基因變異為腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、Kirsten 大鼠肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、髓細(xì)胞組織增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）、富含AT 的相互作用域1A 基因（AT-rich interaction domain 1A，ARID1A）、髓樣細(xì)胞白血病蛋白1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、ERBB2、上皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）等，這與以往報(bào)道的CUP 隊(duì)列相似[10,17]。Varghese 等[18]對(duì)150 例CUP 患者進(jìn)行NGS 檢測(cè)，結(jié)果顯示137 例（91%）至少檢測(cè)到一種基因改變，45 例（30%）具有靶向治療的基因改變，接受靶向治療的患者治療失敗時(shí)間1～14個(gè)月不等。Jia 等[19]對(duì)1 例CUP 患者的外周血進(jìn)行NGS 檢測(cè)，檢出乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）R71K突變，接受奧拉帕利治療后無(wú)進(jìn)展生存期超過15 個(gè)月。1 例原發(fā)灶不明的轉(zhuǎn)移性腺癌患者組織經(jīng)NGS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）擴(kuò)增，服用克唑替尼1 個(gè)月后獲得完全緩解，腫瘤標(biāo)志物恢復(fù)正常水平[20]。大多數(shù)CUP 患者可通過NGS檢測(cè)出至少一個(gè)基因改變，是靶向治療潛在的優(yōu)勢(shì)群體。

隨著泛瘤種的靶向藥物逐漸獲批上市，治療不再局限于單一瘤種，這為CUP 帶來了福音。目前泛癌種靶向基因主要包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶(neurotrophin receptor tyrosine kinase,NTRK) 融合、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 突變和轉(zhuǎn)染重排原癌基因（rearranged during transfection proto-oncogene，RET）融合。NTRK抑制劑拉羅替尼是全球首個(gè)泛瘤種的靶向藥物，NTRK基因改變?cè)贑UP 中的發(fā)生率為12%，二線接受NTRK抑制劑無(wú)進(jìn)展生存期可達(dá)9 個(gè)月[21]。Ricco 等[22]報(bào)道了1 例原發(fā)灶不明的大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的患者，NGS 檢測(cè)出BRAF V600E突變，化療進(jìn)展后使用達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療達(dá)到部分緩解，并通過檢測(cè)cfDNA 中BRAF V600E的表達(dá)情況對(duì)疾病的反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。RET融合常見于分化良好的甲狀腺癌和非小細(xì)胞肺癌，在CUP 中的發(fā)生率為0.7%[23-24]。LIBRETTO-001 研究納入41 例RET融合陽(yáng)性CUP 患者進(jìn)行療效分析發(fā)現(xiàn)，總體客觀緩解率為 44%，緩解持續(xù)時(shí)間為 24.5 個(gè)月，其中CUP 患者對(duì)塞普替尼的治療也有客觀反應(yīng)[25-26]。

綜上所述，NGS 檢測(cè)可以幫助CUP 患者找到可指導(dǎo)靶向治療的基因變異，篩選CUP 靶向治療的獲益人群，臨床療效的評(píng)估仍需大樣本的臨床研究進(jìn)一步探索。

2.2.2 基于腫瘤突變負(fù)荷、程序性細(xì)胞死亡-配體1、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的免疫治療 腫瘤突變負(fù)荷高（tumor mutation burden high，TMB-H）、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability high，MSI-H）及程序性細(xì)胞死亡-配體1（programmed cell death-ligand 1，PDL1）高表達(dá)已經(jīng)被批準(zhǔn)作為評(píng)估免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果的泛癌種生物標(biāo)志物，不再考慮腫瘤的組織來源。2017 年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）會(huì)議上報(bào)道了一項(xiàng)研究，對(duì)6 116 例CUP 標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，其中10.1%的CUP 存在TMB-H（≥20 mut/Mb），1.6%的CUP 存在MSI-H。Gatalica 等[27]報(bào)道了相似的比例。Haratani 等[28]通過免疫組化和免疫相關(guān)基因表達(dá)譜檢測(cè)確定92 例CUP 患者腫瘤組織中PD-L1 的表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的密度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUP 患者的免疫特征與免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)性實(shí)體瘤相似，表明CUP 患者能從免疫治療中獲益。基于此研究，納武利尤單抗治療CUP 療效的開放標(biāo)簽Ⅱ期研究結(jié)果顯示[29]，既往接受過化療的CUP 患者的中位總生存時(shí)間為15.9 個(gè)月，且在PD-L1 高表達(dá)、TMB-H 及MSI-H 的亞組中療效更好，表明納武利尤單抗是CUP 的潛在額外治療選擇。納武利尤單抗也因此于2021 年底在日本獲批用于治療CUP。NCCN 指南推薦對(duì)于基因檢測(cè)結(jié)果為錯(cuò)配修復(fù)缺陷(dMMR）/MSI-H 或TMBH（≥10 mut/Mb）的 CUP 患者，可以選擇帕博利珠單抗治療。在 Mei 等[30]報(bào)道的CUP 患者中，NGS 未檢測(cè)出特殊靶點(diǎn)，但PD-L1 腫瘤比例評(píng)分為80%，TMB 16.7 mut/Mb，在以免疫治療為主的綜合治療后獲得了40 個(gè)月以上的生存期，CUP 患者在NGS 指導(dǎo)下的免疫治療中顯著受益。

2.2.3 耐藥機(jī)制分析與動(dòng)態(tài)檢測(cè)療效 由于腫瘤存在異質(zhì)性，空間異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致局部的組織活檢難以準(zhǔn)確反映腫瘤的全貌，時(shí)間異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致一次檢測(cè)無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療過程中腫瘤演變以及耐藥。外周血NGS 檢測(cè)既能克服腫瘤空間異質(zhì)性，可相對(duì)全面地反映患者的腫瘤分子特征[31]，也可在治療不同階段多次送檢，克服腫瘤時(shí)間異質(zhì)性。Zhao 等[32]報(bào)道了1 例對(duì)化療不耐受的CUP 病例，胸壁、肝臟、縱隔淋巴結(jié)病灶中用NGS 均檢測(cè)到EML4-ALK融合，經(jīng)ALK抑制劑克唑替尼治療有效，耐藥后ctDNA 檢測(cè)顯示出ALK L1196M和G1269A耐藥突變，更換布加替尼療效顯著。提示ctNDA 在腫瘤獲得性耐藥機(jī)制分析方面發(fā)揮著重要作用。同時(shí)ctDNA 在CUP 患者的療效動(dòng)態(tài)評(píng)估方面也扮演著重要角色。Jia 等[19]報(bào)道了1 例使用奧拉帕利治療BRCA1突變的CUP 患者，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了ctDNA 中的腫瘤特有突變TP53 S241C持續(xù)減少，提示治療有效。在胃腸胰起源或原發(fā)灶不明的神經(jīng)內(nèi)分泌癌中NGS 檢測(cè)也可以用于預(yù)測(cè)化療反應(yīng)[33]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

NGS 檢測(cè)具有所需DNA 樣本量較高、操作流程復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)（3～10 d 出報(bào)告）、費(fèi)用相對(duì)較高等缺點(diǎn)，但與免疫組織化學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光原位雜交檢測(cè)等其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，它可以同時(shí)涵蓋數(shù)十至數(shù)百個(gè)基因，檢測(cè)所有位點(diǎn)突變、未知伴侶的融合基因、拷貝數(shù)變異等多種變異類型。同時(shí)可評(píng)估TMB、MSI 等免疫治療相關(guān)分子標(biāo)志物，提供全面的基因變異數(shù)據(jù)，幫助CUP 患者明確診斷，找到原發(fā)灶，常見的原發(fā)灶包括肺、肝、腎、結(jié)直腸、胃、食管等，可以針對(duì)原發(fā)腫瘤制定相對(duì)應(yīng)的治療方案及選用適應(yīng)證范圍內(nèi)的藥物。大多數(shù)CUP患者都擁有至少1 個(gè)臨床有意義的基因變異，最常見的基因變異為TP53、KRAS、CDKN2A、MYC、ERBB2等。NGS 為CUP 患者提供精準(zhǔn)個(gè)體化用藥指導(dǎo)，包括選擇合適的靶向治療方案、協(xié)助判斷是否可使用免疫治療。泛瘤種靶向藥物在CUP 患者中也顯示出一定的療效，但仍需要大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，獲得性耐藥是影響精準(zhǔn)治療療效的重要因素，NGS 檢測(cè)可以用于獲得性耐藥分子機(jī)制分析及后續(xù)的用藥指導(dǎo)，但目前尚缺乏大樣本的臨床數(shù)據(jù)支撐其在臨床工作中的常規(guī)應(yīng)用，未來還需開展更多的前瞻性臨床研究。

本文無(wú)影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。