鮮枸杞子漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

田 雨，王 慶，齊喜紅，韓 莎

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 2. 寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，寧夏 銀川 750001）

枸杞子為藥食同源的常用滋補(bǔ)類中藥［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］，現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典（一部）》，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目功效［3］。枸杞子含有豐富的化學(xué)成分，主要有枸杞多糖、生物堿、氨基酸、黃酮類、維生素、微量元素［4-6］等。鮮枸杞子漿是結(jié)合現(xiàn)代科技，將枸杞子鮮果經(jīng)破碎、制漿及滅菌工藝灌裝生產(chǎn)而成，最大限度地保留了枸杞子鮮果的藥效成分，同時(shí)便于運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用。近年來，鮮枸杞子漿作為食品已有應(yīng)用，其標(biāo)準(zhǔn)為食品行業(yè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)［7-9］。為傳承、創(chuàng)新枸杞子中藥飲片傳統(tǒng)炮制加工方法，提升其生物利用度，拓寬鮮枸杞子漿在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)鮮枸杞子漿進(jìn)行定性鑒別，分別采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定枸杞多糖及甜菜堿的含量，為建立鮮枸杞子漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；2550 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

枸杞子漿（寧夏早康生物科技有限公司，批號(hào)分別為20191001，20191002，20191003，20191004，20191005，20200701，20200702，20200703，20200704，20200705）；枸杞子對(duì)照藥材（批號(hào)為121072-201611），D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為110833-201908，純度為99.8%），甜菜堿對(duì)照品（批號(hào)為110894 - 201604，純度為99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

取樣品2.0 g，加水35 mL，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯15 mL 振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 μL，用自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1，V/V/V）為展開劑，上行展開，展距8.0 cm，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相同位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。色譜圖見圖1。

圖1 薄層色譜圖（365 nm）1.Reference medicinal materials solution 2-4.Test solutionFig.1 TLC chromatogram（365 nm）

2.2 枸杞多糖含量測(cè)定

2.2.1 溶液制備

取D-無水葡萄糖對(duì)照品25.11 mg，精密稱定，置250 mL 容量瓶中，加水定容，即得對(duì)照品溶液。取樣品2.0 g，精密稱定，加乙醚100 mL，加熱回流1 h，棄去乙醚液，殘?jiān)?00 mL 80%乙醇，加熱回流提取1 h，濾過，用30 mL 80%乙醇分次洗滌，將濾渣和濾紙置裝有150 mL 水的燒瓶中，繼續(xù)加熱回流提取2 h，趁熱濾過，用少量熱水沖洗濾器，收集濾液和洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備［10-12］

精密量取2.2.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5 mL，分別置具塞試管中，加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，40 ℃水浴放置15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以溶劑為空白對(duì)照，于490 nm 波長處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=0.072X- 0.026 4（r= 0.999 8，n= 6）。結(jié)果表明，D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度在2.506 0～18.794 8 μg/ mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.3 樣品含量測(cè)定方法

精密量取供試品溶液1.0 mL，置具塞試管中，精密加水1.0 mL，按2.2.2 項(xiàng)下自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中D-無水葡萄糖的濃度和含量。

2.2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密量取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.4 mL，置具塞試管中，加水至2.0 mL，按2.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6 次。結(jié)果的RSD為0.11%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20191001）樣品6份，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為0.81%，RSD為1.28%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20191001），按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8 h時(shí)按2.2.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果供試品溶液在室溫下放置6 h的吸光度無明顯變化，RSD為0.63%（n=4），表明供試品溶液在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；放置8 h 后吸光度下降，RSD為2.83%（n=5）。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20191001）0.25 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入D-無水葡萄糖對(duì)照品2 mg，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 枸杞多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of lycium burbarum polysaccharide（n=6）

2.2.5 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中枸杞多糖含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.2 Results of the content determination of lycium burbarum polysaccharide in samples（%）

2.3 甜菜堿含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Merck Purospher@STAR NH2柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 水溶液（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：195 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

取甜菜堿對(duì)照品17.68 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取樣品4 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置堿性氧化鋁固相萃取柱（2 g）上，加乙醇30 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀m量，溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液［13-14］。同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜同一保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.BetaineA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y =1.952 7X -9.219 0（r= 0.999 6，n= 5）。結(jié)果表明，甜菜堿質(zhì)量濃度在17.54～350.77 μg/ mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.50%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20191001）樣品6份，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為1.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.94%（n=7），表明甜菜堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20191001）2 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入質(zhì)量濃度為3.761 7 mg/ mL 的甜菜堿對(duì)照品溶液1 mL，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 甜菜堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of betaine（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品中甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.4 Results of the content determination of betaine in samples（%）

3 討論

本研究中鮮枸杞子漿的TLC 鑒別主要參考2020年版《中國藥典（一部）》枸杞子TLC鑒別項(xiàng)下的方法［3］，同時(shí)考察了不同薄層板、不同溫濕度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果重復(fù)性良好，操作簡(jiǎn)便，斑點(diǎn)清晰，分離效果好。故確定為2.1項(xiàng)下鮮枸杞子漿TLC鑒別方法。

在190～680 nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果于490 nm波長處葡萄糖吸收峰最大，故選用490 nm 為枸杞多糖的測(cè)定波長?？疾炝藰悠吩诓煌崛r(shí)間（2，3，4 h）所測(cè)得的枸杞多糖含量，結(jié)果分別為0.82%，0.83%，0.84%。綜合考慮，確定樣品提取時(shí)間為2 h。考察了比色皿、波長和苯酚試劑的耐用性，結(jié)果均無明顯影響。

從鮮果炮制成鮮枸杞子漿的收率為80%～90%，從鮮果炮制成枸杞子的收率為20%～25%，即鮮枸杞子漿與枸杞子干品比率為4∶1。參照2020年版《中國藥典（一部）》枸杞子含量測(cè)定項(xiàng)下枸杞多糖的限度為不得少于1.8%，結(jié)合10 批樣品的含量測(cè)定結(jié)果，暫將鮮枸杞子漿中枸杞多糖的限度訂為不得少于0.5%。

考察了流動(dòng)相乙腈- 水溶液的3 種比例（87∶13，85∶15，83∶17，V/V），結(jié)果均符合要求?？疾炝瞬煌放粕V柱（Merck Purospher@STAR NH2柱、Agilent NH2柱、Waters NH2柱，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果對(duì)甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果影響較小，故最終確定為2.3.1項(xiàng)下色譜條件。結(jié)合10批樣品的甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果，暫將鮮枸杞子漿中甜菜堿的限度訂為不得少于0.10%。

綜上所述，本研究中建立的方法簡(jiǎn)便、可行、重復(fù)性好，可用于鮮枸杞子漿的質(zhì)量控制。