麩炒枳殼標準湯劑質(zhì)量標準研究*

李國衛(wèi)，何嘉瑩，索彩仙，邱韻靜，胡綺萍，孫冬梅，陳向東

（廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

麩炒枳殼的原料為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL. 及其栽培變種的干燥未成熟果實［1］。傳統(tǒng)炮制方法包括麩炒、蜜制、鹽制等，其中麩炒應(yīng)用最廣泛，目的是“去燥性而和胃”［2］，以緩和其辛燥之性，增強其理氣消滯之功。目前，關(guān)于枳殼炮制的研究包括對其基原、炮制、提取工藝及質(zhì)量標志物的研究［3-19］，多側(cè)重于炮制前后黃酮類成分的變化，作為臨床使用湯劑的物質(zhì)傳遞的量值關(guān)系研究較少。因此，本研究中參考《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》［20］，制備12 批麩炒枳殼標準湯劑，在建立其超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜的基礎(chǔ)上，通過多指標定量測定，從定性及定量兩方面對其進行綜合評價。特別是在定量指標選擇方面，參考2020年版《中國藥典》麩炒枳殼質(zhì)控指標成分柚皮苷和新橙皮苷［1］，深化對黃酮類活性物質(zhì)的研究，以期為麩炒枳殼標準湯劑質(zhì)量標準的制訂提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H - Class 型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；HWS28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；ME204E 型分析天平（精度為萬分之一），XP26 型分析天平（精度為百萬分之一），均購于瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國默克股份有限公司）；KQ500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（批號110721-201818，純度96.20%），新橙皮苷對照品（批號111857-201804，純度99.4%），柚皮苷對照品（批號110722-201714，純度93.4%），均購于中國食品藥品檢定研究院；橘紅素對照品（批號wkq16011401，純度98.6%），蕓香柚皮苷對照品（批號wkq19041908，純度98.0%），川陳皮素對照品（批號wkq20031701，純度98.0%），水合橙皮內(nèi)酯對照品（批號wkq20031904，純度98.0%），均購于四川維克奇生物科技有限公司；馬爾敏對照品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號CFS201901，純度98.0%）；甲醇為分析純，磷酸、乙腈均為色譜純，水為超純水；麩炒枳殼藥材為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL. 及其栽培變種的干燥未成熟果實，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定均符合藥典標準，炮制品為實驗室自制，樣品信息見表1。

表1 麩炒枳殼樣品信息Tab.1 Information of bran-fried Aurantii Fructus samples

2 方法與結(jié)果

2.1 麩炒枳殼炮制

取枳殼片200 g，照2020年版《中國藥典（四部）》通則0213 麩炒法［21］炒至色變深。形如枳殼片，色較深，偶有焦斑，符合2020年版《中國藥典（一部）》枳殼項下麩炒枳殼飲片炮制規(guī)定。

2.2 標準湯劑制備

參考《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》制備。取麩炒枳殼飲片100 g，加水煎煮2次，第1次煎煮加10 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，文火煮30 min，趁熱濾過（350 目篩）后迅速冷卻；第2 次煎煮加7 倍量水，武火煮沸后，文火煮25 min，趁熱濾過（350 目篩）后迅速冷卻。合并濾液，濃縮至清膏，分裝至西林瓶中，每瓶分裝2 mL，真空冷凍、干燥，取出，軋鋁蓋，即得標準湯劑凍干粉（編號為S1-S12）。

取枳殼飲片（編號為F1）3 份，每份100 g，按標準湯劑制備工藝平行制備標準湯劑3 份，測定出膏率和水分。結(jié)果3 份飲片樣品的出膏率分別為26.61%，26.73%，27.13%，RSD為0.99%；水分分別為7.64%，7.77%，7.46%，RSD為2.04%。表明該標準湯劑制備工藝穩(wěn)定性良好。

2.3 出膏率測定

測定上述濃縮液室溫下總體積為V，經(jīng)磁力攪拌后，精密吸取25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中。樣品經(jīng)水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻至恒重后迅速精密稱定質(zhì)量（m1），所取飲片質(zhì)量為m2。出膏率（%）=（m1×V）/（0.025 ×m2）× 100%。計算平均出膏率，結(jié)果12 批麩炒枳殼標準湯劑平均出膏率為26.01%，標準偏差（SD）為1.86%。詳見表2。

表2 12批麩炒枳殼標準湯劑出膏率測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of extraction rate determination of 12 batches of bran-fried Aurantii Fructus Standard Decoction（%）

2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流動相：乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min 時15%A～25%A，7～8 min時25%A～40%A，8～10 min 時40%A～45%A，10～13 min時45%A～60%A，13～15 min時60%A～15%A）［20］。

2.5 溶液制備

取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為16.930 0，90.094 0，11.0803，31.7290，3.4590，1.1270，2.1970，2.5640μg/mL的混合對照品溶液［18］。取標準湯劑樣品適量，研細，取0.2 g，加甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.6 方法學考察

精密度試驗：取標準湯劑樣品（編號為S4）適量，依法制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，以新橙皮苷為參照峰。結(jié)果11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取標準湯劑樣品（編號為S4）適量，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h時按2.4項下色譜條件進樣測定，以新橙皮苷為參照峰。結(jié)果11個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取標準湯劑樣品（編號為S4）適量，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.4 項下色譜條件進樣測定，以新橙皮苷為參照峰。結(jié)果11個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 特征圖譜建立及相似度評價

以中藥色譜指紋圖譜相似度軟件2012A 版對12 批樣品UPLC 特征圖譜進行共有峰標識，以S1 為參照，設(shè)置時間窗寬度為0.2，以平均數(shù)法建立對照圖譜（R）和疊加圖譜，確定11 個共有峰，詳見圖1。經(jīng)對照品指認，1～4 號峰、10～11 號峰為黃酮苷類成分，峰1 為蕓香柚皮苷，峰2為柚皮苷，峰3為橙皮苷，峰4為新橙皮苷，峰10為川陳皮素，峰11為橘紅素；5號峰和9號峰為香豆素類成分，峰5為水合橙皮內(nèi)酯，峰9為馬爾敏。詳見圖2。其中，4 號峰（新橙皮苷）分離度好，色譜峰位置居中，便于其他色譜峰的定位，故以4 號峰（新橙皮苷）為參照峰（S）。由圖1 可知，疊加指紋圖譜共11 個，以對照指紋圖譜為參照，計算12批樣品間的相似度均不低于0.99，表明各批次標準湯劑的化學成分組成較穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3 12批標準湯劑相似度評價Tab.3 Similarity evaluation of 12 batches of standard decoction

圖1 12批枳殼對照圖譜（R）和疊加圖譜Fig.1 Reference chromatogram（R）and superimposed chromatogram of 12 batches of Aurantii Fructus

圖2 共有峰歸屬超高效液相色譜圖A.Mixed reference solution B.Test solution1.Narirutin 2.Naringin 3.Hesperidin 4（S）.Neohesperidin 5.Meranzin hydrate 9.Marmin 10.Nobiletin 11.TangeratinFig.2 UPLC chromatograms of common peak attribution analysis

2.8 含量測定

2.8.1 方法學考察

線性關(guān)系考察：取1.2 項下8 種對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為蕓香柚皮苷33.563μg/mL、柚皮苷128.71μg/mL、橙皮苷11.08μg/mL、新橙皮苷105.76 μg/mL、水合橙皮內(nèi)酯6.92 μg/mL、馬爾敏2.25 μg/ mL、川陳皮素6.92 μg/ mL、橘紅素5.13 μg/mL的混合對照品溶液。加甲醇分別稀釋得系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，并以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表4，表明各成分的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表4 8個待測成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.4 Results of the linear relation test of eight components

檢測限和定量限確定：取2.5 項下混合對照品溶液適量，以甲醇稀釋，按2.4項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時的質(zhì)量濃度確定檢測限和定量限。結(jié)果見表5。

表5 8個待測成分的檢測限及定量限（μg/mL）Tab.5 Limit of detection and limit of quantification of eight components（μg/mL）

精密度試驗：取2.5 項下混合對照品溶液適量，按2.4項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素8個成分峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取標準湯劑樣品（編號為S4）適量，研細，取0.2 g，精密稱定，按2.5 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h時按2.4項下色譜條件進樣測定。結(jié)果上述8個成分峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取標準湯劑樣品（編號為S4）適量，研細，取0.2 g，精密稱定，平行6 份，按2.5 項下方法制備供試品溶液，按2.4 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果上述8 個成分含量的RSD均小于2%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的枳殼飲片樣品（編號為F4）0.1 g，精密稱定，平行6 份，加入與樣品中含量等量的對照品，按2.5 項下方法制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。測得上述8個成分的平均加樣回收率分別為100.04%，97.23%，98.03%，97.46%，102.11%，97.45%，96.75%，95.16%，RSD分別為0.97%，1.80%，1.67%，1.72%，1.99%，2.96%，2.42%，2.28%（n=6），表明方法準確度良好。

2.8.2 含量測定

取12批飲片樣品，參考文獻［22］進行測定；另取12批標準湯劑樣品，按2.5 項下方法制備供試品溶液，按2.4 項下色譜條件進樣測定，根據(jù)公式標準湯劑轉(zhuǎn)移率（%）=（標準湯劑凍干粉指標成分含量×標準湯劑凍干粉量）/制備標準湯劑所用飲片指標成分總量×100%［23］計算標準湯劑中8個成分的轉(zhuǎn)移率。12批麩炒枳殼飲片的含量、標準湯劑含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果見表6和表7。

表6 12批麩炒枳殼飲片中8個成分含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.6 Results of content determination of eight components in 12 batches of bran-fried Aurantii Fructus decoction pieces（mg/g）

表7 12批標準湯劑中8個成分含量測定結(jié)果與轉(zhuǎn)移率Tab.7 Results of the content determination and transfer rate of eight components in 12 batches of standard decoction

3 討論

本研究中根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》，以出膏率、特征圖譜、含量及轉(zhuǎn)移率4 個考察指標對麩炒枳殼標準湯劑的質(zhì)量控制開展研究。其中，標準湯劑代表性的影響因素包括樣品來源及制備工藝，從枳殼的道地及主產(chǎn)區(qū)江西、湖南等地選取了12批樣品，參考2020年版《中國藥典》《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》對12 批枳殼藥材進行規(guī)范炮制并制備標準湯劑，保證標準湯劑的質(zhì)量穩(wěn)定。

中藥標準湯劑因失去了傳統(tǒng)的性狀特征，僅以單一指標進行定性和定量分析難以反映其質(zhì)量優(yōu)劣，故需建立標準湯劑的指紋圖譜或特征圖譜作為其質(zhì)量控制指標。本研究中基于12 批不同產(chǎn)地樣品的麩炒枳殼標準湯劑質(zhì)量標志物的UPLC 特征圖譜，從定性角度對標準湯劑進行指標成分量值研究，使其在失去外觀性狀的情況下實現(xiàn)質(zhì)量可控。

本研究中在參考2020年版《中國藥典》定量質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，選擇8個質(zhì)量標志物，即蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素，從定量角度對麩炒枳殼標準湯劑進行綜合評價。從標準湯劑制備、表征及傳遞3 個角度研究多指標成分的量值傳遞規(guī)律，以控制產(chǎn)品的質(zhì)量均一性。《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》中規(guī)定，在制訂標準含量及轉(zhuǎn)移率范圍時，以X±3SD（或均值的70%～130%）為依據(jù)。因此，本研究中對12 批麩炒枳殼標準湯劑及其飲片的含量及轉(zhuǎn)移率分別計算了均值及SD，為其質(zhì)量標準的制訂提供參考。其中，飲片及標準湯劑的柚皮苷SD值均較大，表明不同產(chǎn)地樣品的含量存在一定差異；8 個指標成分中蕓香柚皮苷的轉(zhuǎn)移率SD值較大，提示在提取過程中不同樣品的提取率差異較大，推測可能與不同產(chǎn)地樣品的質(zhì)地有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同指標間的轉(zhuǎn)移率波動較大，其中橙皮苷、橘紅素的轉(zhuǎn)移率均較小，考慮為橙皮苷、橘紅素的水溶性較差；蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率均較高，可能與熱水能提高這些成分的溶解度有關(guān)，且水煎煮過程中新橙皮苷的參與改變了柚皮苷的分子排列方式，形成了柚皮苷- 新橙皮苷共簇體，提高水溶液中柚皮苷的溶解度［24］。

綜上所述，本研究中從麩炒枳殼標準湯劑原料的代表性、制備工藝的標準化及全面的質(zhì)量控制體系出發(fā)進行研究，可為麩炒枳殼配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的臨床用藥質(zhì)量的一致性評價提供參考。